過表達TIPE2上調BID分子促進H446細胞凋亡

王方南陽醫學高等專科學校基礎部

過表達TIPE2上調BID分子促進H446細胞凋亡

王方
南陽醫學高等專科學校基礎部

目的觀察TIPE2過表達對小細胞肺癌H 446細胞凋亡相關分子BID的影響。方法建立TIPE2過表達的H 446小細胞肺癌細胞株，利用熒光顯微成像技術和W estern Blot技術分別檢測TIPE2過表達情況和細胞凋亡相關分子BID的變化。結果TIPE2質粒穩轉H 446細胞高表達TIPE2基因和綠色熒光蛋白。TIPE2過表達的H 446細胞促凋亡分子BID表達增多，顯微鏡觀察細胞凋亡明顯。結論過表達TIPE2基因引起BID上調，并促進小細胞肺癌H 446凋亡。

TIPE2；細胞凋亡；BID

肺癌的發病率和死亡率是惡性腫瘤之首[1]。肺癌的發生發展是由一系列腫瘤相關分子反饋性作用于下游靶分子調控細胞增殖、遷移、侵襲和轉移過程。其中細胞凋亡、信號傳導等過程的改變普遍認為是影響以上過程的的關鍵機制。BID是Bcl-2家族重要成員，促進細胞程序性凋亡，在腫瘤的發生、發展中發揮重要作用[2]。

TIPE2基因是維持機體免疫內環境平衡的重要基因之一[3]，在細胞凋亡以及炎癥反應等生物學過程中發揮調控作用。TIPE2抑制肝癌遷移和胃癌增殖在腫瘤生長方面主要發揮抑癌效應[4-5]，但其在肺癌發展中的作用研究較少。因此，本研究以穩定轉染技術建立TIPE2過表達H446小細胞肺癌細胞株，探討TIPE2過表達對細胞促凋亡分子BID的影響以及細胞凋亡情況，以期探討TIPE2在小細胞肺癌中的負調控促凋亡作用。

1.材料與方法

1.1 主要試劑與細胞細胞：人小細胞肺癌細胞株H446。購自中國醫學科學院。試劑：Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司。G418 sulfate、預染蛋白Marker和化學發光底物試劑盒購自上海生工公司。鼠抗TIPE2購自美國Abnova公司，鼠抗tubulin抗體、兔抗BID抗體、HRP-羊抗兔抗體和HRP-驢抗鼠抗體均購自美國Santa Cruz公司。

1.2 建立TIPE2過表達細胞和實驗分組完全培養基接種H446細胞，待培養80-90%匯合度時換無血清培養基。將新鮮Lipofectamine 2000-GFP-TIPE2混合物培養8小時，換完全培養基培養48小時后，G418篩選細胞一周左右，繼續培養直到形成單克隆H446-TIPE2穩定表達細胞。熒光顯微鏡觀察細胞形態。實驗分為H446組、H446-Vector組和H446-TIPE2組。

1.3 蛋白免疫印跡技術檢測BID蛋白表達按標準流程收集細胞冰上裂解，離心收集蛋白上清，BCA法檢測蛋白濃度。凝膠電泳將蛋白轉移至PVDF膜上，5%封閉液室溫封閉2小時，特異性單克隆一抗4℃孵育過夜，含吐溫20的TBST洗3次后，辣根過氧化物酶標記的二抗室溫孵育2小時，ECL顯影液反應、曝光，掃描膠片觀察實驗結果。

1.4 TIPE2引物序列及RT-PCR技術

TIPE2：sense5`-GGAACATCCAAGGCAAGACTG-3`

antisense5`-AGCACCTCACTGCTTGTCTCATC-3`

按照Tarkara試劑盒說明書標準流程提取總RNA，合成cDNA，配制PCR反應液，1.5%瓊脂糖凝膠電泳。

2.結果

2.1 H446過表達TIPE2表達鑒定RT-PCR結果顯示三組細胞僅H446-TIPE2細胞檢測到TIPE2mRNA高表達，其他兩組細胞基本無表達（見圖1）。提示H446過表達TIPE2細胞株構建成功，TIPE2高表達。

圖1 H446過表達TIPE2細胞株的鑒定

2.2 過表達TIPE2對促凋亡分子BID表達和細胞凋亡的影響Western blot結果顯示H446-Vector和H446-TIPE2細胞在內參Actin的參照下，均表達促凋亡分子BID。且H446-TIPE2細胞BID水平高于H446-Vector細胞（見圖2-A）。顯微鏡結果顯示過表達H446-TIPE2細胞凋亡萎縮壞死部分懸浮，而H446-Vector細胞輪廓清晰呈梭形貼壁生長（見圖2-B）。以上結果表明過表達TIPE2上調BID并引起細胞凋亡壞死。

圖2 過表達TIPE2對BID表達和細胞凋亡的影響（A.蛋白免疫印跡檢測BID蛋白表達B.顯微成像觀察細胞凋亡作用）

3.討論

TIPE2是新型免疫負調控分子，研究發現TIPE2通過抑制TNF-α所致的NF-κB、Erk信號激活，抑制MMP-3和MMP-13表達發揮負調控肝癌轉移的作用[4]。也有研究證實小鼠肺癌LLC細胞中TIPE2表達水平明顯低于正常肺組織[6]。本研究通過穩定轉染系統建立H446-TIPE2過表達細胞株可為探討TIPE2在肺癌發生發展中的相關作用研究奠定細胞基礎。

線粒體凋亡是啟動細胞凋亡壞死的重要途徑。BID是Bcl-2家族促凋亡蛋白，活化的BID蛋白可與促凋亡蛋白Bax、Bak等結合誘導線粒體蛋白釋放，促進細胞凋亡[7-8]。活化的Bid蛋白也可通過與抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl等結合，減弱其抗凋亡作用[9]。本課題研究發現TIPE2通過上調BID表達的線粒體凋亡途徑引起H446肺癌細胞凋亡，但TIPE2上調BID表達的分子機制有待下一步研究發現。

[1]陳萬青,鄭榮壽,張思維,等.2013年中國惡性腫瘤發病和死亡分析[J].中國腫瘤,2017；26（1）：1-7.

[2]梁博,王新軍,周少龍.膠質瘤組織中CPEB4和Bcl-xl的表達及預后影響因素分析[J].鄭州大學學報：醫學版,2013；48（5）：605.

[3]Sun H,Gong S,Carmody RJ,etal.TIPE2,a negative regulator of innate and adaptive immunity thatmaintains immune homeostasis [J].Cell,2008；133（3）：415-26.

[4]Zhang YH,Yan HQ,Wang F,etal.TIPE2 inhibits TNF-α-induced hepatocellular carcinoma cellmetastasis via Erk1/2 downregulation and NF-κB activation[J].International Journal of Oncology, 2015；46：254-264.

[5]Zhao Q,Zhao M,Dong T,et al.Tumor necrosis factor-α-induced protein-8 like-2（TIPE2）upregulates p27 to decrease gastric cancer cellproliferation[J].JCell Biochem,2015；116（6）：1121-1129.

[6]Liu QQ,Zhang FF,Wang F,etal.TIPE2 Inhibits Lung Cancer Growth Attributing to Promotion of Apoptosis by Regulating Some Apoptotic Molecules Expression[J].PLoS ONE,2015；10（5）：e0126176.doi：10.1371/journal.pone.0126176

[7]WEIMC,LINDSTEN T,MOOTHA VK,et al.tBID,a membrane-targeted death ligand,oligomerizes BAK to release cytochrome [J].DenesDev,2000；14（16）：2060-2071.

[8]LIHL,ZHU H,XU CJ,et al.Cleavage of BID by caspase-8 mediates themitochondrial damage in the Fas pathway ofapoptosis[J]. Cell,1998；94（4）：491-501.

[9]LOU X,BUDIHARDJO I,ZOU H,etal.Bid,a Bcl-2 interacting protein,mediates cytochrome c release from mitochondria in response to activation of cell surface death receptors[J].Cell,1998；94（4）：481-490.

TIPE2 cou ld up-regu late BID to p rom o te cell apop tosis on H446

W ang Fang
Departmentof Basic M edicine Science,NanYang MedicalCollege

南陽市科技攻關計劃項目（No.2015KJGG18）資助。

王方，女，碩士研究生學歷，腫瘤免疫藥理學方向，南陽醫學高等專科學校基礎部。