重度創傷后鋅和腦干NMDA受體與MODS死亡機制關系

周永翠,王廣歡,王 典,于曉軍,呂俊耀,湯 暢

(汕頭大學醫學院 1.第一附屬醫院;2.第二附屬醫院;3.法醫學教研室,廣東 汕頭515041)

*通訊作者

重度創傷后鋅和腦干NMDA受體與MODS死亡機制關系

周永翠1,王廣歡2*,王 典3,于曉軍3,呂俊耀3,湯 暢3

(汕頭大學醫學院 1.第一附屬醫院;2.第二附屬醫院;3.法醫學教研室,廣東 汕頭515041)

目的 探討重度創傷引發的微量元素鋅急性缺乏與多器官功能障礙綜合征(MODS)及其死亡機制的關系。方法 建立重度創傷兔模型，檢測腦干NMDA受體、血生化、血清和腦鋅。結果 傷后12 h，腦和腦干中鋅增高，但血鋅濃度下降明顯。在腦干背側區，NR1在傷后6 h內增高隨后下降，NR2A在傷后12 h降至最低點。腦干NR2B水平在死亡組最低。血鋅離子與腦干腹側區，背側區以及網狀結構的NR2A、NR2B呈正相關(P<0.05)。腦干鋅與只與腹側，背側與網狀結構NR2A變化呈負相關(P<0.05)。結論 重傷可致血鋅急性降低，氧化應激增強，引起NMDA受體的改變導致神經細胞的神經毒性，這可能是重度創傷MODS發生的機制之一。

多器官功能衰竭；NMDA；鋅

(ChinJLabDiagn,2017,21:1412)

嚴重的創傷會導致全身性病理生理反應，嚴重的可以引起全身炎癥反應綜合征(SIRS) 、 休克和多器官功能障礙綜合征(MODS)包括死亡。外傷引起的繼發MODS或死亡機制并不完全清楚。微量元素與抗氧化相關酶的急劇變化，是多器官功能衰竭(MOF)甚至死亡的重要機制[1]。目前，氧化應激和/或興奮性毒性被認為是神經毒素損傷[2]的最后共同通路。作為特異性興奮性氨基酸受體NMDA受體是興奮性毒性的主要神經通路。它在各種急、慢性腦損傷中起重要作用，尤其在腦干，因為它包含了許多重要的生命中樞核。因此，我們應用創傷后MODS模型探討鋅和腦干NMDA受體變化，了解創傷后MODS及其死亡的可能機制。

1 材料與實驗方法

1.1 動物模型建立及分組

1.1.1 創傷模型建立 新西蘭家兔40只，體重2-2.5 kg。每只兔子每天喂40 g濃縮飼料，每千克飼料含40 g鋅。創傷程度采用創傷定級和創傷嚴重度分級(AIS-ISS)。將家兔固定后：①反復過度擰絞右膝關節，完全性撕碎膝關節后十字韌帶，膝關節脫位癱軟(AIS 840406.3)；②左肘關節上1.5 cm處鉗夾致肱骨閉合性粉碎骨折(AIS 752804.3)；③左側股骨下段膝關節上1.5 cm處鉗夾致股骨下段閉合性粉碎骨折(AIS 8518143.3)。損傷總評分ISS=32+32+32=27。

1.1.2 實驗分組 ①正常對照組8只；②重傷6 h組8只；③重傷12 h組8只；④重傷3 d組8只；⑤傷后超過24 h死亡的家兔為死亡組8只。

1.2 取材和檢測方法

兔深麻醉(戊巴比妥鈉腹腔注射，100 mg/kg)。兔頸動脈急性出血處死。各組家兔按創傷后6 h、12 h和3 d定時并頸靜脈采血。重傷組家兔分別隨機于傷后6 h、12 h、3 d，頸動脈放血快速處死，各時間點8只，立即取腦干組織，用于組織切片。

應用原子吸收光譜法檢測家兔血清、大腦及腦干組織微量元素Zn含量。血常規及生化檢測：全自動生化分析儀檢測血清白蛋白、球蛋白、BUN、Cr。免疫組織化學檢測腦干NR1、NR2A、NR2B表達，Image-Pro Plus 6.0 測定受體的含量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 血生化檢測

創傷各組的生化指標較對照組有顯著性改變。實驗組血清ALB、GLB水平傷后明顯降低(P<0.05)；BUN、Cr水平傷后明顯增加，并在死亡組中達到峰值(P<0.05；表1)。

表1 各組中ALB,GLB,Cr 和 BUN測定

*與正常組相比P<0.05

2.2 腦干NR1、NR2A、NR2B免疫組化檢測

在腦干背側損傷后6 h，NR1水平均高于對照組，但在傷后12 h，NR1較傷后6 h明顯下降，傷后3天接近基礎水平。死亡組中NR1水平比正常組低。重傷組和死亡組中NR2A水平較低，且低于正常組，死亡組水平最低。重傷組NR2B水平低于對照組；但重傷各組差異不明顯，重傷組水平顯著高于死亡組(圖1)。

圖1 各實驗組中腦干NR1,NR2A和NR2B的變化。資料采用均數±標準差；n=8,與對照組相比 (*,#,& ,P<0.05).

2.3 血清，腦和腦干鋅

與正常組相比，傷后6 h血清鋅水平下降，傷后12 h繼續下降，然而傷后3天增加。腦和腦干中鋅含量在傷后6 h增加，傷后3天持續增加(圖2)。

圖2 重度創傷后血清、腦和腦干鋅的變化。資料采用均數±標準差；n=8,與對照組相比 (*,#,& ,P<0.05).

2.4 鋅和腦干NR1，NR2A和NR2B的表達水平之間的相關性

血清鋅與腦干背側NR2A(r=0.629，P<0.05)和NR2B(r= 0.696，P<0.05)的變化呈正相關。腦鋅與腦干背側NR2A表達呈負相關(r=-0.702，P<0.05)。腦鋅與腦干背側NR2B的表達呈負相關(r=-0.568，P<0.05)。腦干鋅水平與腦干背側NR2A表達呈負相關(r=-0.616，P<0.05)。

3 討論

3.1 鋅與創傷后氧化應激反應的相關性

嚴重創傷可導致炎癥介質和炎性細胞因子的釋放，引起SIRS和氧化應激。氧化應激理論在神經毒性機制研究中具有重要地位，它可以解釋神經損傷和延遲效應的積累。本實驗中，血清鋅明顯下降，傷后12 h后繼續下降。在重傷和死亡組鋅在損傷后3天持續在較低水平，表明嚴重的創傷可能會導致血清鋅急性下降[3]。在嚴重創傷后腦、腦干組織中鋅含量逐漸增加，顯著高于死亡組，但低于存活組。鋅在抗氧化系統中起著重要的作用，腦組織在一定程度上可以繼續重新分配鋅，可提高抗氧化能力[4]。

3.2 嚴重創傷后與興奮性毒性密切相關NMDA受體的變化和意義

在神經損傷中，除氧化應激外，還有興奮性神經毒性。興奮性毒性是由各種氧自由基和炎癥介質刺激谷氨酸引起的。其中，NMDA受體是主要的受體。臨床上，在腦缺血、創傷性腦損傷發生時與NMDA受體密切相關。

NR1是離子型谷氨酸受體家族的重要成員，其作用受谷氨酸介導；生理條件下NR1起重要的作用[5]。本實驗，在腦干背側傷后6 h NR1的含量較高，傷后3天恢復。表明，傷后機體通過代償機制操縱NMDA受體亞單位，造成這時期中樞興奮性氨基酸毒性增強[6]。本結果與神經元缺血缺氧通過NMDA受體的激活導致大腦受損的最終結果是一致的。

另外，傷后NR2有顯著的變化。NR2A和2B是2種調節蛋白亞基。推測，在創傷后調節亞基的減少，減少了對受體活性的結合位點的抑制作用，抑制結合可能會減少，導致最終抑制減少。已證實，在大鼠腦內NR2A和NR2B的表達之間的差異，為NMDA受體表達在腦組織不同的時間和不同的地點的表達提供了分子基礎[7]。我們發現，NR2A和2B與血清鋅水平變化高度相關表明，作為調節蛋白成分，它們對環境更敏感，特別是外周創傷后等強的刺激[8]。

血液鋅與腦干中NR1水平不相關，最有可能是由于血鋅丟失增加，攝入減少和再分配。此外，NR1是一個含量大的功能單元，特別是在代償期更容易受到大的影響。基于腦和腦干鋅與NR2A和2B的表達相關，我們推測，嚴重創傷后NR2不需要抑制就能達到明顯的抑制效果。腦鋅的急劇增加滿足了這一要求。鋅和腦干NR2A和2B的相關性表明鋅在大腦中抑制NR2A具有較好的親和力。

嚴重創傷后急性鋅缺乏，抗氧化活性降低，NMDA受體活性改變，導致興奮性神經毒性增強，導致腦干實質性損害，可能是重度創傷MODS發生的機制之一。

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[5]白 暉,張 明,張 煒.谷氨酸受體輔助亞單位的研究進展[J].神經藥理學報,2015,5(2):24.

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Relationship between zinc and brain stem NMDA receptor activity and death mechanism of MODS after severe trauma

ZHOUYong-cui1,WANGGuang-huan2*，WANGDian3,etal.

(1.TheFirstAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege,Shantou515041,China；2.TheSecondAffiliatedHospitalofShantouUniversityMedicalCollege.3.DepartmentofForensicMedicine,ShantouUniversityMedicalCollege)

Objective To investigate the relationship between acute zinc deficiency caused by severe trauma and multiple organ dysfunction syndromes (MODS) and its mechanism.Methods A severe traumatic rabbit model was established.Zinc and serum biochemical profiles were determined.Results Immunohistochemistry was used to detect brainstem NR1,NR2A,and NR2B in severe trauma.Brain and brainstem Zn increased at 12 h,but serum Zn decreased dramatically after trauma.NR1 in the dorsal brainstem increased at 6 h after injury and then decreased.NR2A in the dorsal regions decreased to a plateau at 12 h after trauma.NR2B were lowest in the death group in the brainstem.Serum zinc was positively correlated with NR2A and 2B and negatively correlated with zinc in the brain (P<0.05).Correlations were also found between the brainstem NR2A and that of the dorsal brainstem,as well as between brainstem NR2A and changes in NR2B.There was a negative correlation between zinc and NR2A (P<0.05).Conclusion Severe trauma led to an acute reduction of zinc enhancing oxidative stress and the changes of NMDAR causing the neurotoxicity of the nerve cells.This may be a mechanism for the occurrence of MODS or death after trauma.

Multiple Organ Failure；N-Methyl-D-Aspartate,Zinc

1007-4287(2017)08-1412-03

R651.1

A

周永翠(1979-)，女，博士，副主任技師，研究方向：病理與病理生理。

2016-09-20)