室內空氣污染、HIF-1α基因單核苷酸多態(tài)性與福建漢族肺癌易感性的關系

何斐 祁琪 李旭 肖仁棟 徐秋萍 熊為旻 劉志強 蔡琳

中國是世界肺癌大國，2012年全國數據[1]顯示每年新發(fā)肺癌病例70.5萬，發(fā)病率36.28/10萬人；死亡病例56.9萬，死亡率28.81/10萬人。肺癌已經連續(xù)多年占據中國城市及農村的惡性腫瘤發(fā)病和死亡首位。肺部腫瘤生長過程中，血供無法滿足腫瘤新生血管供應氧時，腫瘤細胞內即出現缺氧狀態(tài)，活化低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor 1α, HIF-1α）識別并結合低氧反應元件（hypoxia response element, HRE）的特殊DNA序列，誘導下游系列靶基因，促進血管生成、細胞增殖及葡萄糖代謝、抑制細胞凋亡、促使肺部腫瘤惡性生長[2]。近年來，HIF-1α在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用逐漸被人們認識，研究[3,4]表明HIF-1α在肺癌組織的表達高于對照組織，并且與肺癌的惡化與轉移有關。但HIF-1α基因單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）與肺癌易感性的研究仍較少。因此，本研究選擇在福建漢族人群中探討HIF-1α基因多態(tài)性與肺癌易感性的關聯，為進一步研究肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及預防和治療提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 對象 研究對象來自一項持續(xù)進行的病例-對照研究[5]，選擇2006年1月-2012年12月在福建醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院、協和醫(yī)院和南京軍區(qū)福州總醫(yī)院的胸外科及呼吸內科病理確診的漢族新發(fā)原發(fā)性肺癌患者1,096例，對照組來自同期前往醫(yī)院探訪患者的健康人群和社區(qū)健康人群1,110例，與病例組按性別、年齡（±2歲）進行匹配。所有調查對象均在福建省居住10年以上并且可以清晰回答問題者。研究經過福建醫(yī)科大學倫理委員會批準，所有面訪的調查對象均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 調查方法 采用統一編制的調查表，由經過統一培訓的調查員通過面訪形式對所有調查對象進行調查。調查內容包括：一般情況、病例情況、吸煙史、飲酒史、飲茶史、疾病史、職業(yè)史、家族史等。應用EpiData 3.1雙錄入數據，經邏輯糾錯，一致性檢驗，并隨機抽樣10%復查。吸煙定義為累計吸煙大于100支。環(huán)境煙草煙霧暴露按是否在工作場所和/或家庭環(huán)境中每日暴露于吸煙者呼出的煙霧時間超過15 min。飲酒定義為每周至少1次，持續(xù)半年以上。飲茶定義為每周至少1杯，持續(xù)半年以上。裝修后有氣味定義為裝修后入住時調查對象還可以感受到刺激性氣味。

1.2.2 實驗方法 每例患者與對照抽取外周靜脈血5 mL，高速離心分離出白細胞用于提取DNA。應用MALDITOF-MS（美國，Sequenom）技術對所有研究對象HIF-1α基因rs2057482位點多態(tài)性進行基因分型[5]。檢測結果應用TYPER 4.0軟件（Sequenom）完成分型，并輸出結果。

1.2.3 統計學方法 采用χ2檢驗，比較病例組和對照組在年齡、性別、婚姻狀況、文化程度、職業(yè)、體重指數（body mass index, BMI）等方面的分布差異，比較病例組和對照組間基因型頻率的分布差異；采用非條件Logistic回歸模型，分析HIF-1α基因rs2057482位點多態(tài)性與肺癌的關聯，調整可能的混雜因素后計算調整比值比（odds ratio, OR）值及95%CI；采用分層分析方法評價HIF-1α基因多態(tài)性與肺癌的關聯及其與環(huán)境因素對肺癌形成的影響；采用Logistic回歸模型進行相乘模型交互作用的分析；采用相對超危險度比（relative excess risk due to interaction, RERI）、歸因比（attributable proportion due to interaction, AP）、交互作用指數（synergy index, S）及其95%CI三個指標估計相加交互作用。統計學檢驗由SPSS v.23.0軟件包完成。所有P值基于雙側檢驗，統計學顯著性水平設定為0.05。

2 結果

2.1 一般情況 截止至2012年12月共收集肺癌病例1,096例，正常對照1,110例，病例組的平均年齡為（58.70±10.77）歲，對照組的平均年齡為（59.01±10.83）歲（t=0.685,P=0.493）；病例組BMI［體重（kg）/身高2（m2）］為（22.15±3.13）kg/m2，對照組為（23.43±3.16）kg/m2（t=0.468, P＜0.001）；其中病例組男性為776例（70.8%）、女性為320例（29.2%），對照組男性為790例（71.2%）、女性為320例（28.8%）。經均衡性檢驗，發(fā)現兩組在年齡、性別、婚姻狀況方面的分布無統計學差異（P＞0.05），但在BMI、文化程度及職業(yè)的分布有統計學差異（P＜0.05），見表1。

表 1 病例組和對照組的一般情況Tab 1 Demographic characteristics of case and control groups

2.2 環(huán)境相關因素Logistic回歸分析 經過性別、年齡、文化程度、職業(yè)、婚姻狀況及BMI因素調整的Logistic回歸分析結果提示，室內通風情況不佳（近一年與十年前）、暴露于烹調油煙（近一年與十年前）、吸煙、被動吸煙暴露、飲酒、既往存在肺部疾病史及腫瘤家族史均可不同程度增加罹患肺癌風險，見表2。

2.3 rs2057482位點多態(tài)性與肺癌易感性的關系 SNP分型結果提示，HIF-1α基因rs2057482檢出率為94.6%。如表3所示，該位點在1,110名正常對照中的分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P值為0.05）。說明研究對象具有較好的人群代表性。按照病理類型分類分析的多元Logistic回歸分析結果顯示，攜帶有HIF-1α基因rs2057482位點T基因型的人群更容易罹患小細胞癌（TT vs CC的OR值為1.725，95%CI：1.047-2.842），尚未發(fā)現rs2057482位點多態(tài)性與肺癌其他病理類型的關聯（表3）。

2.4 環(huán)境相關因素分層分析rs2057482位點多態(tài)性與肺癌易感性的關系 環(huán)境相關因素分層Logistic回歸分析結果顯示：調整一般情況和肺癌有關影響因素后，在共顯性遺傳模型中，暴露于被動吸煙的rs2057482 TT攜帶者的肺癌患病風險是CC攜帶者的2.195倍（95%CI: 1.038-4.643）。在顯性遺傳模型中，有腫瘤家族史的rs2057482 T基因攜帶者的肺癌患病風險是C基因攜帶者的1.911倍（95%CI:1.121-3.258）。在隱性遺傳模型中，有肺部疾病史的rs2057482 TT攜帶者的肺癌患病風險是TC+CC攜帶者的0.159倍（95%CI: 0.028-0.920）。在加性遺傳模型中，有腫瘤家族史的rs2057482 TC+TT攜帶者的肺癌患病風險是CC攜帶者的1.542倍（95%CI: 1.107-2.340）。而在各個遺傳模型中，均未見其余因素分層分析時HIF-1α基因rs2057482位點多態(tài)性與肺癌的關聯（表4）。

2.5 rs2057482位點多態(tài)性與環(huán)境因素的交互作用分析 根據分層分析結果顯示，rs2057482位點顯性遺傳模型在腫瘤家族史分層分析中存在層間不一致（P=0.025），隱性遺傳模型在被動吸煙、肺部疾病史分層分析中存在層間不一致（P=0.023; P=0.020），提示其中可能存在混雜或修飾效應。相乘交互作用分析顯示：顯性模型下，rs2057482位點多態(tài)性與腫瘤家族史之間不存在相乘交互作用（P=0.095）。隱性模型下，rs2057482位點與被動吸煙之間存在正相乘交互作用（P=0.013），與肺部疾病史存在負相乘作用（P=0.016）。進一步分析相加交互作用，結果顯示無論是在顯性模型還是隱性模型下，rs2057482位點多態(tài)性與腫瘤家族史、被動吸煙、肺部疾病史等環(huán)境因素之間不存在相加交互作用。

表 2 肺癌危險因素Logistic回歸分析Tab 2 Logistic regression analysis of lung cancer risk factors

表3 rs2057482與不同病理類型肺癌的易感性關聯結果Tab3 Association of rs2057482 locus polymorphism with susceptibility to lung cancer of different pathological types

3 討論

空氣污染室內空氣污染來源多樣，煙草煙霧是其重要來源，而裝修材料的揮發(fā)氣體、烹調油煙及居室通風狀況等都可能影響室內空氣質量，增加肺癌發(fā)病風險[6]。而室內空氣污染則可能降低氧氣含量，造成乏氧環(huán)境。人類HIF-1α基因定位于14號染色體（14q21-24），cDNA全長3,720 bp，編碼826個氨基酸[7]。當細胞處于乏氧狀態(tài)時，由于第402位、564位的脯氨酸殘基無法被脯氨酰羥化酶（prolylhydroxylase, PHD）所羥化，HIF-1α在細胞內大量積累，并與HIF-1β相結合形成具有轉錄作用的HIF-1[8]。隨后，HIF-1可以識別并結合下游靶基因的特定DNA序列，如血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、促紅細胞生成素（erythropoietin, EPO）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）、血紅素加氧酶1（hemeoxygenase-1, HO-1）、糖酵解酶等[9]。這些基因的激活可與肺癌的形成、惡化和轉移有重要關聯[2]。盡管HIF-1α基因的高表達被證實與肺癌的形成與惡化有關[10]，但其中的分子機制卻仍不清楚，考慮可能與磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B, PI3K/Akt）信號通路、細胞因子信號傳導抑制蛋白-1、脯氨酸羥化酶PHD家族、基質金屬蛋白酶等的反饋調節(jié)有關，HIF-1α在肺癌的血管生成、細胞增殖、凋亡、轉移、浸潤和代謝等中發(fā)揮的作用使其有望成為治療肺癌的一個重要靶點[11-13]。到目前為止，關于人類HIF-1α基因的SNPs有一部分已經被確認，主要有rs11549465、rs11549467和rs2057482。

本研究主要探討室內空氣污染、HIF-1α基因rs2057482位點多態(tài)性與肺癌易感性之間的關聯。rs2057482位于HIF-1α基因3’端非編碼區(qū)與miRNA-199a的結合區(qū)域附近，其多態(tài)性可能會影響miRNA-199a的穩(wěn)定性，從而影響HIF-1α的mRNA和蛋白表達[14]。一項與宮頸癌患病風險的研究[15]結果顯示，攜帶CC基因型的人群宮頸癌患病風險是攜帶CT/TT基因型的1.44倍（95%CI:1.11-1.88）。盡管并未發(fā)現HIF-1α基因rs2057482單個位點與前列腺癌患病風險之間的關聯，Li等[16]對中國漢族人群HIF-1α基因多態(tài)性和前列腺癌易感性之間的關聯研究，通過rs2057482與rs11549467位點結合分析發(fā)現，攜帶≥3個等位基因可使前列腺癌的患病風險增加2.10倍（95%CI: 1.23-3.57）。Qin等[17]對該位點與腎細胞癌預后研究，Zhang等[18]對該位點與結直腸癌預后研究以及與另一項肝細胞癌預后研究[19]結果提示，攜帶rs2057482 CT/TT基因型的患者較攜帶CC基因型的患者復發(fā)率降低，預后更好。同時發(fā)現rs2057482位點多態(tài)性可能影響mRNA

的穩(wěn)定性以及和microRNA的結合能力，降低HIF-1α基因的表達能力和細胞內HIF-1α蛋白的含量，從而產生抗腫瘤效應[19]。

表 4 rs2057482與肺癌易感性關聯的分層分析結果Tab 4 Stratified analysis of association between four SNPs in rs2057482 and susceptibility to lung cancer aOR (95%CI)＃

本研究結果提示，在全人群中，rs2057482位點T基因型與小細胞肺癌易感性有關聯。分層分析結果發(fā)現，調整一般情況和肺癌有關影響因素后，rs2057482 T基因攜帶者在共顯性遺傳模型中，可增加暴露于被動吸煙人群的肺癌患病風險；在顯性遺傳模型和加性遺傳模型中，可增加有腫瘤家族史人群的肺癌患病風險；在隱性遺傳模型中，可降低肺部疾病史人群的肺癌患病風險。Zhang等[20]通過培養(yǎng)A549和H157細胞株研究尼古丁與HIF-1α基因表達的關系，發(fā)現尼古丁可通過激活nAchR調節(jié)的信號通路來促進HIF-1α蛋白的積累和下游VEGF的表達，對肺癌的形成和惡化起到重要的作用。Guo等[21]的研究也得出了類似的結論，研究發(fā)現尼古丁可通過誘導線粒體活性氧的產生來調節(jié)HIF-1α基因的表達。因此一定程度上支持本研究結果。而對于危險基因型別的判斷，本文結果與Fu、Qin等[15,17]的研究結論不一致，原因可能是研究的腫瘤類別不一致，上述研究種類是腎細胞癌和宮頸癌，不同腫瘤的發(fā)病機制不同，故可能會得出不一致的結論，也有可能是研究地區(qū)的不同和人群異質性的影響，本研究主要針對福建地區(qū)漢族人群rs2057482位點多態(tài)性，目前該地區(qū)尚無類似的文章可供參考，其他諸如不同的樣本量等因素都可能使結論受到影響。

本研究采用病例對照研究設計，樣本量較大，將增大結果的可信性；研究針對福建地區(qū)的漢族人群，可以排除不同民族人群本身的基因差異對研究結果的影響；研究不僅分析了全人群中HIF-1α基因rs2057482位點多態(tài)性與肺癌易感性的關聯，并按照不同病理類型及各類環(huán)境因素進行了相應的分類及分層分析，研究了不同亞型人群中rs2057482位點多態(tài)性和肺癌易感性的關聯，為探討HIF-1α基因多態(tài)性在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制提供了參考。但研究仍然存在一定的局限：首先以醫(yī)院為基礎的病例對照研究，無法完全排除選擇偏倚；其次研究中rs2057482檢出率為94.6%，可能與樣本質量有關，盡管可能未能成功分型的樣本可能會影響結果，但5%左右的未檢出率符合質量控制要求，不易造成現有結果方向的改變；本研究僅探討單基因位點，未能分析基因-基因交互作用，另外未進行功能學研究。因此，未來相關研究可增加檢測HIF-1α基因SNPs的個數或者與肺癌發(fā)生有關基因的SNPs（例如DNA修復基因、癌基因和抑癌基因），并在此基礎上增加細胞株的培養(yǎng)或采用免疫組化的方法來檢測HIF-1α基因mRNA的水平和HIF-1α蛋白的表達，從而為闡明HIF-1α基因多態(tài)性在肺癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制提供科學的依據，有助于肺癌的預防和后期的臨床診斷及治療，從而提升人群的健康水平。