江陵天星觀一號楚墓出土飽水木漆器F455中細(xì)菌對硬松木的腐蝕研究

章 俊，雷 瓊，邱祖明，范曉丹，汪 儉，詹亞斌，馬立安

(1. 長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025； 2． 湖北省荊州文物保護(hù)中心，湖北荊州 434020)

江陵天星觀一號楚墓出土飽水木漆器F455中細(xì)菌對硬松木的腐蝕研究

章 俊1，雷 瓊2，邱祖明2，范曉丹1，汪 儉1，詹亞斌1，馬立安1

(1. 長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025； 2． 湖北省荊州文物保護(hù)中心，湖北荊州 434020)

研究木質(zhì)文物中的細(xì)菌對木材腐蝕性影響，篩選防腐劑抑制腐蝕性強(qiáng)細(xì)菌的腐蝕作用，是延長木質(zhì)文物保存期的一種有效的生物保護(hù)措施。為研究飽水木漆器F455及其水環(huán)境中細(xì)菌的種類，以及對木材的腐蝕程度，采用16S rRNA基因序列分析方法及生理生化試驗(yàn)，對飽水木漆器F455及水環(huán)境中細(xì)菌進(jìn)行鑒定，并選取典型菌按5×108個(gè)/瓶菌量接種馬尾松心材(懸于無菌自來水中)，37℃培養(yǎng)120d，測試木材的損失率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從F455文物挑選的32株細(xì)菌中，有29株菌鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)，為優(yōu)勢菌屬，其余為短桿菌屬(Brevibacterium)、短波單胞菌屬(Brevundimonas)和產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)各1株。水樣樣品中細(xì)菌菌屬較F455文物樣品中豐富，27株菌有9個(gè)屬，其中短桿菌屬(Brevibacterium)有9株，為優(yōu)勢菌屬，其余交替赤細(xì)菌屬(Altererythrobacter)有5株，短波單胞菌屬(Brevundimonas)有4株，產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenes)有3株，黃桿菌屬(Flavobacterium)有2株，芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、白色桿菌屬(Leucobacter)、類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)各1株。從2種樣品材料的分離菌中共挑選出14株典型菌進(jìn)行木塊腐蝕試驗(yàn)，與對照組比較，其中有9株菌差異極顯著。說明這些菌對馬尾松木材有一定的腐蝕作用，但是腐蝕率非常低，最高僅1.56%。表明這些細(xì)菌對試驗(yàn)?zāi)静鸟R尾松腐蝕并不嚴(yán)重。該研究分析了飽水木漆器長期保存在水槽中細(xì)菌對木漆器的影響，豐富了飽水木漆器文物生物影響的理論依據(jù)。

飽水木漆器；16S rRNA基因；木材腐蝕率；文物保護(hù)

0 引 言

中國木漆器的歷史淵源最早可以追溯到7000多年前，春秋戰(zhàn)國以后，漆文化更是發(fā)展迅速[1]。漢代以后漆器使用已十分廣泛，幾乎遍及人類日常生活的各個(gè)方面，木漆器上的圖形文字以及色彩的運(yùn)用等都包含重要的考古信息。木漆器出土以后，為防止其自然干燥引起收縮、龜裂和變形，一般將這些木漆器浸泡在水中保存。木質(zhì)文物易受到微生物的侵蝕，特別是真菌的侵蝕，一旦環(huán)境適宜，真菌孢子就會(huì)在木質(zhì)文物表面快速繁殖，給文物造成巨大的破壞[2]。事實(shí)上，不僅僅是真菌，細(xì)菌也會(huì)對木材造成一定腐蝕，木材主要成分為纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，而自然界中存在許多降解纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的細(xì)菌[3-5]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)大量與木質(zhì)文物腐蝕相關(guān)的細(xì)菌[6]。因此，研究木質(zhì)文物中的細(xì)菌對木材腐蝕性影響，篩選防腐劑抑制腐蝕性強(qiáng)細(xì)菌的腐蝕作用，是延長木質(zhì)文物保存期的一種有效的生物保護(hù)措施。課題組已對江陵天星觀一號楚墓出土的飽水彩繪木漆器及保存水中的細(xì)菌進(jìn)行調(diào)查，研究發(fā)現(xiàn)文物木漆器F455中細(xì)菌數(shù)量590CFU/g，其水樣中細(xì)菌數(shù)量為1590CFU/L[7]，但未做種屬鑒定及木材腐蝕性研究。本研究針對上述問題，鑒定細(xì)菌種屬，模擬文物保存的水環(huán)境，評價(jià)其對木材腐蝕性影響，針對腐蝕性強(qiáng)的細(xì)菌，擬篩選殺菌抑菌劑，以期為延長飽水木漆器的保存期提供生物學(xué)保護(hù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 試驗(yàn)菌株為木漆器F455文物及保存環(huán)境水樣(荊州市博物館)中分離的細(xì)菌[7]；F455文物于1978年江陵天星觀一號楚墓(戰(zhàn)國)出土，經(jīng)清洗干凈，外表無雜物及污物，保存在荊州博物館水池中36年；從F455文物分離的細(xì)菌中挑選32株，從保存環(huán)境的水樣中分離的細(xì)菌中挑選27株，均來源于本實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 馬尾松 馬尾松2根(胸高部位、胸徑280mm、長2m)，購自荊州市某木材市場。

1.2 方法

1.2.1 16S rRNA基因分子鑒定 利用煮沸法[8]獲得細(xì)菌DNA模板，利用細(xì)菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因序列，PCR反應(yīng)體系(50μL)為：10×Taq Buffer 5μL，dNTPs(2mM)6μL，Taq(2U/μL) 1μL，27F(10μM)1μL，1492R(10μM)1μL，ddH2O 32μL，4μL DNA模板。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，取3μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR合格的樣品送至上海生工武漢測序部進(jìn)行測序，序列在Eztaxon上比對分析，并采用MEGA軟件進(jìn)行細(xì)菌分類分析。

1.2.2 生理生化鑒定 生理生化鑒定項(xiàng)目包括：革蘭氏染色、明膠液化、檸檬酸鹽利用、過氧化氫酶、氧化酶、糖(醇)(果糖、阿拉伯糖、蔗糖、木糖、葡萄糖、甘露醇)發(fā)酵、吲哚、尿酶、H2S產(chǎn)生、VP、甲基紅、硝酸鹽還原及淀粉水解等試驗(yàn)。具體生化試驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[9，10]。

1.2.3 測試菌體對木材的腐蝕作用 按文獻(xiàn)[11]選取馬尾松心材(邊部內(nèi)側(cè)與髓心之間顏色較深部分)切割成2cm×2cm×1cm小塊狀，裝入燒杯中放入(103±2)℃烘箱中烘至恒重[12]，每次稱量前將木塊放入干燥器中冷卻。恒重后稱量10g左右的木塊分裝在規(guī)格相同的藍(lán)蓋螺紋廣口圓瓶中，121℃ 30min滅菌后冷卻備用[11，13]。采用液體培養(yǎng)基搖菌收集菌體，用無菌生理鹽水洗滌并重懸菌體，采用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，每瓶中接菌數(shù)目為5×108個(gè)[14]，每個(gè)菌株6個(gè)重復(fù)，并用不接菌作為對照，用無菌自來水定容至250mL，37℃培養(yǎng)120d后測木塊恒重，計(jì)算木塊質(zhì)量損失率[11]，并采用Origin7.5軟件進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rRNA基因分子鑒定結(jié)果

16S rRNA基因擴(kuò)增，序列長度為1500bp左右，序列比對發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)455文物樣品中，芽孢桿菌屬(Bacillussp.)為其優(yōu)勢菌屬，占90.63%，保存環(huán)境水樣中短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)為其優(yōu)勢菌屬，占33.3%。F455文物樣品中檢測到的細(xì)菌菌屬僅有4種，分別為Bacillus、Brevundimonas、Brevibacterium和Alcaligenes。環(huán)境水樣樣品中檢測到的細(xì)菌菌屬有9種，分別為Brevibacterium、Altererythrobacter、Flavobacterium、Paenibacillus、Brevundimonas、Ochrobactrum、Alcaligenes、Bacillus、Leucobacter，詳見表1和表2。木漆器及水樣中典型微生物序列，以及在Eztaxon數(shù)據(jù)庫中相似度最高的序列一起，以鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖1。S1、S7、F1、F2、F3和F4為厚壁菌門(Firmicutes)，S2、S4和F6為放線菌門(Actinobacteria)，S3、S5、S8、S9、S10、F7和F8為變形菌門(Proteobacteria)，S6為擬桿菌門(Bacteroidetes)。S1同Bacillustoyonensis及Bacillusthioparans同源性近，與序列比對結(jié)果不一致，其他樣品同源性與序列分析結(jié)果一致。

表1 F455文物樣品中細(xì)菌16S rRNA基因序列相似性分析

表2 F455水樣樣品中細(xì)菌16S rRNA基因序列相似性分析

圖1 F455文物樣品和環(huán)境水樣中細(xì)菌16S rRNA基因序列鄰接法分析細(xì)菌類群結(jié)構(gòu)

2.2 生理生化結(jié)果

根據(jù)16S rRNA基因序列分析，在F455木漆器樣品鑒定菌株中挑選出8個(gè)典型菌株，標(biāo)號為F1- F8，在水樣中挑選出10個(gè)典型菌株，標(biāo)號為S1- S10，進(jìn)行生理生化試驗(yàn)，結(jié)果詳見表3和表4。參考文獻(xiàn)[10]，S1、F1、F2、F3、F4、F5為革蘭氏陽性菌、過氧化氫酶為陽性，產(chǎn)芽孢，與芽孢桿菌屬相符；S2為革蘭氏、甲基紅陽性菌，H2S產(chǎn)生、硝酸鹽還原、淀粉水解及VP實(shí)驗(yàn)為陰性，與白色桿菌屬相符；S3為革蘭氏陰性桿菌，硝酸鹽還原陰性，與交替赤桿菌屬相符；S4和F6為革蘭氏陽性短桿菌狀菌，過氧化氫酶陽性，與表皮短桿菌屬相符；S5和F8為革蘭氏陰性菌，氧化酶和過氧化氫酶陽性，硝酸鹽還原陰性或陽性，吲哚產(chǎn)生為陰性，與糞產(chǎn)堿桿菌屬相符；S6為革蘭氏陰性菌，過氧化氫酶陽性，VP和甲基紅反應(yīng)均為陰性，生化反應(yīng)不活潑，與黃桿菌屬相符；S7為革蘭氏陽性桿狀菌，過氧化氫酶陽性，與類芽孢桿菌屬相符；S8、S9和F7革蘭氏陽性，分散的短桿菌，水解明膠，過氧化氫酶陽性，與短波單胞菌屬相符；S10為革蘭氏陰性菌，過氧化氫酶陽性，吲哚產(chǎn)生為陰性，與蒼白桿菌屬相符，但S10水解明膠與蒼白桿菌屬不相符。結(jié)合16S rRNA基因序列分析，初步確定S1和F4為芽胞桿菌(Bacillussp)、F5為東洋芽孢桿菌(Bacillustoyonensis)、F3為鹽敏芽孢桿菌(Bacillushalmapalus)、F2為病研所芽孢桿菌(Bacillusidriensis)、F1為北納創(chuàng)聯(lián)產(chǎn)硫芽孢桿菌(Bacillusthioparans)、S7為樹形類芽孢桿菌(Paenibacillusdendritiformis)、S2為干丘亮桿菌(Leucobacteraridicollis)、S4和F6為表皮短桿菌(Brevibacteriumepidermidis)、S5和F8為糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenesfaecalissubsp.Phenolicus)、S3為交替赤桿菌(Altererythrobactersp.)、S10為蒼白桿菌屬(Ochrobactrumsp.)、S9為短波單胞菌(Brevundimonasolei)、S8和F7為缺陷短波單胞菌(Brevundimonasdiminuta)、S6為水氏黃桿菌(Flavobacteriummizutaii)。

表3 F455文物樣品中細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果

注： +陽性；-陰性；N未試驗(yàn)。

表4 F455環(huán)境水樣中細(xì)菌生理生化試驗(yàn)結(jié)果

(續(xù)表4)

注： +陽性；-陰性；N未試驗(yàn)。

2.3 細(xì)菌對木材的腐蝕

從F455樣品鑒定菌中選擇6株、環(huán)境水樣鑒定菌中選擇8株，共14株細(xì)菌對馬尾松心材進(jìn)行腐蝕試驗(yàn)，結(jié)果見表5。同對照組相比較，F(xiàn)1(Bacillusthioparans)、F3(Bacillushalmapalus)、F4(Bacilluscereus)、F5(Bacillustoyonensis)、F7(Brevundimonasdiminuta)、S2(Leucobacteraridicollis)、S4(Brevibacteriumepidermidis)、S5(Alcaligenesfaecalissubsp.Phenolicus)、S9(Brevundimonasolei)均存在極顯著差異，但試驗(yàn)?zāi)緣K的質(zhì)量損失率僅為1.56%，屬于微弱腐蝕；只有F2(Bacillusidriensis)、S7(Paenibacillusdendritiformis)、S10(Ochrobactrumpseudogrignonense)差異不顯著；S3(Altererythrobacteratlanticus)和S6(Flavobacteriummizutaii)同對照組相比差異極顯著，但是對木材的腐蝕率比對照組小。

表5 回接細(xì)菌對木塊的平均損失率

注： **為極顯著，未標(biāo)注為沒有顯著差異，CK為未接菌的陰性對照

3 討 論

對F455及保水環(huán)境中分離純化的細(xì)菌進(jìn)行16S rRNA基因分子鑒定發(fā)現(xiàn)，水樣中細(xì)菌種屬比F455木漆器樣中多，并且基本包含了木漆器樣品細(xì)菌，水樣中細(xì)菌來源可能部分來自外界環(huán)境，部分來自木漆器樣品；由于分離細(xì)菌時(shí)沒有對F455樣品表面進(jìn)行消毒殺菌處理，只是用無菌水清洗F455表面3次，故木漆器F455樣品中的細(xì)菌主要來自F455內(nèi)部，也有可能來自F455表面。徐潤林[6]研究表明，歐洲木質(zhì)文物中常見的好氧菌有噬胞菌(Cytophaga)和纖維弧菌(Cellvibrio)；厭氧菌有梭狀芽孢桿菌(Clostridium)、芽孢桿菌(Bacillus)、假單胞菌(Pseudomonas)、黃桿菌(Arthrobacter)、黃草桿菌(Flavobacterium)和螺旋菌(Spirillum)。本研究從F455木漆器樣品中分離到Bacillus、Brevibacterium、Brevundimonas、Alcaligenes等細(xì)菌，從環(huán)境水樣中分離到Brevibacterium、Altererythrobacter、Flavobacterium、Paenibacillus、Brevundimonas、Ochrobactrum、Alcaligenes、Bacillus、Leucobacter等細(xì)菌，這與歐洲文物木漆器中細(xì)菌種類存在一定差異。F455木漆器樣品中細(xì)菌優(yōu)勢菌屬為芽孢桿菌屬(Bacillus)，這可能是因?yàn)檠挎邨U菌能夠產(chǎn)芽孢，對逆境環(huán)境耐受能力強(qiáng)，生存時(shí)間久。湯顯春等[15]對曾侯乙墓穴木槨中微生物進(jìn)行分離，其優(yōu)勢菌屬也是芽孢桿菌屬。Landy[16]等分析了來自不同地區(qū)、不同年代的108份飽水木質(zhì)文物樣品細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，同樣分離到Bacillus、Brevundimonas，但是從文物木漆器中分離到Brevibacterium和Alcaligenes細(xì)菌尚未見報(bào)道。

本研究選用馬尾松作為腐蝕試驗(yàn)材料，是因馬尾松的耐腐蝕性較差，腐蝕效果較容易出現(xiàn)，是木材天然耐腐性室內(nèi)試驗(yàn)的較理想材料[11，17]。湯顯春等[14]研究曾侯乙墓穴木槨中的微生物對木材的降解也選用馬尾松作為試驗(yàn)材料。

本研究測試從F455木漆器樣品及其水樣樣品中分離的14株細(xì)菌對馬尾松心材的腐蝕率，相較于對照組，除少量幾個(gè)樣品外，都差異極顯著。說明這些細(xì)菌對硬松木具有一定腐蝕作用，但腐蝕率最高僅1.56%，質(zhì)量損失低于10%，只有微弱腐蝕性，故沒有進(jìn)一步檢測木材的其它指標(biāo)。細(xì)菌對馬尾松腐蝕率過低，其可能的原因是營養(yǎng)的缺乏，僅硬松木中的碳源氮源等營養(yǎng)元素不足以維持細(xì)菌的良好生長。荊州博物館中保存文物木漆器的水同樣營養(yǎng)缺乏，以及水中缺乏充足的氧氣，少量存在的細(xì)菌對木漆器的腐蝕作用比較微弱。當(dāng)然，本研究以單一的細(xì)菌研究其對馬尾松的腐蝕，存在一定的局限性。微生物對木材的腐蝕作用可能是多種細(xì)菌或者細(xì)菌與真菌共同作用的結(jié)果。閆晨曦和黃偉[18]研究表明，降解木材的細(xì)菌主要屬于桿菌屬(Bacillus)、產(chǎn)氣桿菌屬(Aerobacter)和假單孢菌屬(Pseudomonas)，這與本研究部分相似。研究表明，某些細(xì)菌能夠以異養(yǎng)方式產(chǎn)生胞外細(xì)菌纖維(Bacterial cellulose，BC)[19]。例如，醋酸桿菌屬(Acetobacter)細(xì)菌可快速繁殖分泌細(xì)菌纖維素用來填充古代木質(zhì)內(nèi)部細(xì)胞壁的坍塌結(jié)構(gòu)，造成木質(zhì)文物濕重變化不大[20，21]。細(xì)菌纖維素的發(fā)酵生產(chǎn)一般是在含葡萄糖的復(fù)雜營養(yǎng)介質(zhì)中進(jìn)行的[22]。試驗(yàn)中S3(Altererythrobacteratlanticus)和S6(Flavobacteriummizutaii)菌株造成試驗(yàn)?zāi)緣K質(zhì)量損失率明顯低于對照組，是否也是因能合成細(xì)菌纖維素引起，有待做進(jìn)一步試驗(yàn)。

4 結(jié) 論

1) F455文物木漆器樣品中，芽孢桿菌屬(Bacillussp.)為其優(yōu)勢菌屬，水樣中短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)為其優(yōu)勢菌屬。

2) F455文物木漆器保存在水槽中，單一細(xì)菌對木漆器的腐蝕作用有限。但是，有關(guān)微生物對出土木漆器的危害有必要進(jìn)一步研究，尤其是真菌及其與細(xì)菌協(xié)同作用的影響。

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(責(zé)任編輯 潘小倫)

Study of wood degradation by bacteria from the archaeological waterlogged wood F455 excavated at Chu Tomb No.1 at Tianxingguan

ZHANG Jun1, LEI Qiong2, QIU Zu- ming2, FAN Xiao- dan1, WANG Jian1, ZHAN Ya- bin1, MA Li- an1

(1.CollegeofLifeScienceofYangtzeUniversity,Jingzhou434025，China; 2.CulturalRelicProtectionCenterofJingzhou,Jingzhou434020，China)

The species of bacteria from an archaeological sample of waterlogged wood and the water environment, and the degree of degradation of the wood using 16S rRNA gene sequence analysis, as well as physiological and biochemical tests were studied. Then representative bacteria were selected to test their degradative effects on heart- wood of pinusmassoniana. Bacteria at a concentration of 5×108/bottle were diluted with sterile water and then used for inoculatation. The test samples were cultured for 120 days at 37℃. The results showed that thirty- two strains of bacteria were separated from waterlogged wood sample F455. Twenty- nine of them belong to the genus Bacillus.The remaining three strains of bacteria are Brevibacterium, Brevundimonas and Alcaligenes.The dominant genus in the waterlogged wood sample F455 was Bacillus. Twenty- seven species of bacteria belonging to nine genera were isolated from the water samples. The diversity of bacteria in the water was greater than in the wood samples. Nine of them belong to the genus of Brevibacterium, five are Altererythrobacter, four are Brevundimonas, three are Alcaligenes, two are Flavobacterium, and one each of Bacillus,Leucobacter,Paenibacillus and Ochrobactrum. Fourteen typical bacteria were selected to test their degradative effects. Nine strains of bacteria had significant differences compared to the control. It was found that some bacteria caused degradation but that the rate was low (the highest 1.56%). It was also found that these bacteria did not cause severe degradation of pinusmassoniana. This study also analyzed the effect of bacteria on wood lacquer when the waterlogged wood was stored in a sink for a long time. The results of this work benefit theories of waterlogged wood protection.

Waterlogged wood; 16S rRNA gene; Wood degradation rate; Cultural relics conservation

2016- 05- 08；

2017- 03- 20

出土木漆器保護(hù)國家文物局重點(diǎn)科研基地(荊州文物保護(hù)中心)開放課題資助(33110016)

章 俊(1991—)，男，長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士研究生，研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物，E- mail： 1067360640@qq.com

馬立安，E- mail： malian@yangtzeu.edu.cn

1005- 1538(2017)04- 0019- 08

K854

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