GM6001對激素性股骨頭壞死大鼠組織形態學與基因表達的影響

仝昭方，王慶志，唐洪濤，朱英杰，李光明，沙莎

(1.河南省洛陽正骨醫院(河南省骨科醫院)髖部疾病研究治療中心，河南洛陽471002；2.新鄉醫學院人體解剖學教研室，河南新鄉453003)

·論著·

GM6001對激素性股骨頭壞死大鼠組織形態學與基因表達的影響

仝昭方1，王慶志2，唐洪濤1，朱英杰1，李光明1，沙莎1

(1.河南省洛陽正骨醫院(河南省骨科醫院)髖部疾病研究治療中心，河南洛陽471002；2.新鄉醫學院人體解剖學教研室，河南新鄉453003)

目的探討靜脈注射基質金屬蛋白酶抑制劑GM6001對激素性股骨頭壞死(SINFH)大鼠組織形態學與基因表達的影響。方法60只健康SD大鼠，經臀肌注射甲基潑尼松后制備激素性股骨頭壞死模型，隨機分為SINFH組、低劑量GM6001(GM6001-L)組和高劑量GM6001(GM6001-H)組，每組20只，GM6001-L組與GM6001-H組在造模同時經尾靜脈注射50 mg/kg GM6001與100 mg/kg GM6001，1周1次，共計8周。另選取20只健康SD大鼠于臀肌注射等量生理鹽水作為對照，經12周、20周后，觀察SD大鼠股骨頭形態學改變，以及過氧化氫酶體增殖物激活受體γ(PPAPγ)、11β-羥基類固醇脫氧酶(11β-HSD1)、Run相關轉錄因子2(Runx2)與CCAAT區/增強子結合蛋白α(C/EBPα)的變化。結果與對照組比較，造模組大鼠造模8周內的血清鈣、磷水平降低；SINFH大鼠經GM6001治療后8周內的血清鈣、磷水平均顯著升高，與SINFH組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，且GM6001-H組血清鈣、磷水平均高于GM6001-L組，差異有統計學意義(P＜0.05)；造模組大鼠造模8周內的BALP、StrACP水平顯著高于對照組，BGP、CT水平顯著低于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；GM6001-L組與GM6001-H組經治療后8周內的BALP、StrACP水平均顯著低于SINFH組，BGP、CT水平均顯著高于SINFH組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；造模組大鼠造模8周內的股骨轉子、股骨頭的骨密度及股骨頭成骨細胞計數均低于對照組，破骨細胞數高于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)；GM6001-L組與GM6001-H組經治療后8周內的股骨轉子、股骨頭的骨密度及股骨頭成骨細胞計數均高于SINFH組，破骨細胞計數低于SINFH組，差異均有統計學意義(P＜0.05)。應用GM6001治療后，與SINFH組比較，PPAPγ、11β-HSD1、C/EBPα表達減少，Runx2表達升高，且隨劑量增加，PPAPγ、11β-HSD1、C/EBPα下降明顯，而Runx2上升明顯，與對照組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)。結論大鼠股骨頭壞死改變可能與激素抑制成骨及成脂分化基因表達有關，與11β-HSD1表達關系密切，而GM6001能改善這種病理改變以及基因異常表達，具有良好的臨床應用價值。

股骨頭壞死；GM6001；組織形態學；基因表達

目前，臨床應用糖皮質激素廣泛，由于糖皮質激素為自身免疫系統抑制劑，容易造成一系列的并發癥。激素性股骨頭缺血性壞死(steroid-induced necroisis of femoral head，SINFH)是糖皮質激素使用過程中最為常見的并發癥之一[1]。SINFH不僅加重患者身體疼痛感，還會導致患者的運動功能障礙，進一步發展可能造成終生殘疾等癥狀。研究表明，SINFH患者常見基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)的異常升高，MMPs為一組依賴于金屬離子，如鈣離子、鋅離子的蛋白水解酶家族，MMPs主要作用為降解細胞外基質，其與SINFH的發生密切相關[2]。研究表明，MMPs不僅參與了組織發育修復、炎癥反應及腫瘤發生發展，還可以導致SINFH[3-5]。很多藥物可通過抑制MMPs活性，從而發揮對SINFH的治療作用[6]，作為基質金屬蛋白酶抑制劑之一，GM6001可顯著抑制MMPs的活性，達到緩解SINFH癥狀目的[7]。目前，關于GM6001抑制SINFH的機制研究較少。本研究通過觀察不同實驗組大鼠股骨頭組織形態學改變以及基因表達情況，探討GM6001對SINFH大鼠組織形態學及基因表達的影響。

1 資料與方法

1.1 實驗材料甲基潑尼松(美國Pfizer公司)，GM6001(美國Chemicon公司)，過氧化氫酶體增殖物激活受體γ(PPAPγ)抗體、11β-羥基類固醇脫氧酶(11β-HSD1)抗體、Run相關轉錄因子2(Runx2)抗體、CCAAT區/增強子結合蛋白α(C/EBPα)抗體以及引物序列均購自北京博奧森生物技術有限公司，RNA檢測試劑購自大連寶生物公司。SP試劑盒購自北京中杉生物有限公司，11β-HSD1、PPAPγ、Runx2、C/EBPα等引物序列購自上海生工生物有限公司，GAA購自北京中棉有限公司。

1.2 動物與分組選擇60只健康SD大鼠，雌雄各半，經臀肌注射甲基潑尼松，以制備激素性股骨頭缺血性壞死模型，具體操作為：大鼠兩邊臀大肌均交替注射，每次20 mg/kg，1周1次，共計8周。60只模型大鼠隨機分為SINFH組、低劑量GM6001 (GM6001-L)組和高劑量GM6001(GM6001-H)組，每組20只，GM6001-L組和GM6001-H組在造模同時經尾靜脈注射50 mg/kg GM6001與100 mg/kg GM6001，1周1次，共計8周。另選取20只健康SD大鼠作為對照組，臀肌注射等量生理鹽水作為空白對照，所有大鼠肌注青霉素20萬U/只，1次/周，有效預防感染。所有SD大鼠均購自上海斯萊克實驗動物技術有限公司，均飼養于SPF級實驗動物房，濕度控制在40%～70%，室溫為22℃～25℃，晝夜照明交替時間為12 h。

1.3 血清鈣、磷、骨代謝指標、骨密度檢測每組SD大鼠5只，于造模后2周、5周、8周清晨空腹狀態下心臟采血，每只取血5 mL，離心機上6 000 r/min離心10 min，取上清分離血清，-80℃冰箱冷凍備用，血清樣本鈣、磷含量經全自動生化儀檢測。酶聯免疫試劑盒檢測骨堿性磷酸酶(BALP)、骨鈣素(BGP)、降鈣素(PCT)含量；采用比色法檢測破骨細胞型抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)活性；上述5只大鼠經脫頸處死，取雙側股骨頭備用，活體股骨頭及股骨轉子間骨密度采用雙能X線骨密度測定儀。所有操作均遵守試劑盒或儀器相關操作說明。

1.4 股骨頭形態學觀察SD大鼠5只，取雙側股骨頭，沿其冠狀面正中切開，以4%多聚甲醛固定24 h，10%乙二胺四乙酸溶液中脫鈣3周，梯度乙醇脫水，脫水12 h后石蠟包埋切片，做4 μm厚連續切片，常規蘇木精-伊紅染色后光鏡下觀察。每張切片隨機選取5個100倍視野，用成像顯影系統軟件分析計算鏡下骨小梁面積比值與骨髓腔內脂肪細胞面積比值。400倍鏡下隨機選取5個視野，計數視野內染色陽性細胞(成骨細胞或脂肪細胞)，判斷標準：細胞質內出現棕黃色顆粒樣染色為陽性染色，計算陽性細胞所占總細胞的百分比，匯總取平均值。

1.5 骨組織切片免疫組織化學法(SP法)骨組織切片經脫蠟、水化操作后進行內源性過氧化物酶阻斷操作；并由高壓煮沸以進行抗原修復，后續加BSA封閉液；并滴加11β-HSD1、PPAPγ、Runx2、C/EBPα一抗，4℃過夜孵育；山羊抗小鼠IgG，經徹底顯色，由蘇木素復染色，乙醇梯度脫水，洗透明后，經中性樹膠封片保存。于鏡下評估所有切片。每組隨機抽取3張切片，由3名檢驗師評定。高倍顯微鏡(400×)下觀察并計算股骨頭內孔隙數目，骨小梁輪廓及分布。

1.6 股骨頭11β-HSD1、PPAPγ、Runx2、C/EBPα表達的qRT-PCR檢測股骨頭組織經RNA抽提，mRNA的含量經紫外分光光度計測定。RNA逆轉錄，根據mRNA的含量，利用qRT-PCR法檢測基因表達。具體步驟：取股骨頭組織標本，去除軟骨組織，經研缽研磨成粉，加入RNAiso Plus，經裂解液裂解5 min后，4℃離心，加0.2 mL氯仿，搖勻，在室溫下靜置5 min，在4℃條件下，以速度12 000 r/min離心處理15 min，取上清液加入75%乙醇清洗沉淀，在4℃條件下，以速度12 000 r/min離心處理5 min，丟棄上清液，保留沉淀組織，取細胞RNA樣本進行逆轉錄處理，采用實時定量qRT-PCR技術，反應條件按試劑盒操作書進行，檢測股骨頭組織的PPAPγ、11β-HSD1、Runx2、C/EBPα基因表達情況。

1.7 統計學方法應用SPSS19.0統計學軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差(x-±s)表示，兩兩比較采用t檢驗，多組間計量數據比較采用單因素方差分析，均以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組大鼠組織形態學應用GM6001后，與SINFH組比較，小鼠股骨小梁面積所占比值明顯升高，骨髓腔內脂肪占面積比值明顯下降，且隨著治療時間延長，骨小梁面積比值上升更為明顯，骨髓腔內脂肪占面積比值下降更為明顯，差異有統計學意義(P＜0.05)；但SINFH組、GM6001組骨小梁面積比值低于對照組，骨髓腔內脂肪占面積比值高于對照組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 四組大鼠形態學比較

表1 四組大鼠形態學比較

注:與對照組比較，aP＜0.05；與SINFH組比較，bP＜0.05。

組別只數骨小梁面積比值骨髓腔內脂肪占面積比值對照組SINFH組GM6001-L周組GM6001-H周組F值P值20 20 20 20 58.34±5.26 48.21±3.43a53.19±4.24ab55.65±4.81ab12.136 7 0.001 20.65±1.23 26.54±2.86a24.22±1.14ab21.65±1.63ab8.594 3 0.007

2.2 四組大鼠血清鈣磷水平比較與對照組比較，造模組大鼠造模8周的內血清鈣磷水平降低；SINFH大鼠經GM6001治療后8周內血清鈣、磷水平均顯著升高，與SINFH組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)；且GM6001-H組血清鈣磷水平均高于GM6001-L組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

表2 四組大鼠血清鈣磷水平比較(mmol/L)

2.3 四組大鼠的血清骨代謝指標水平比較造模組大鼠造模8周內的BALP、StrACP水平顯著高于對照組，BGP、CT水平顯著低于對照組；GM6001-L組與GM6001-H組經治療后8周內的BALP、StrACP水平均顯著低于SINFH組，BGP、CT水平均顯著高于SINFH組，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表3。

2.4 四組大鼠大鼠的股骨骨密度及股骨頭細胞計數比較造模組大鼠造模8周內的股骨轉子、股骨頭的骨密度及股骨頭成骨細胞計數均低于對照組，破骨細胞數高于對照組；GM6001-L組與GM6001-H組經治療后8周內的股骨轉子、股骨頭的骨密度及股骨頭成骨細胞計數均高于SINFH組，破骨細胞計數低于SINFH組，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見表4。

2.5 四組大鼠基因表達應用GM6001治療后，與SINFH組比較，PPAPγ、11β-HSD1、C/EBPα表達減少，Runx2表達升高，且隨劑量增加，PPAPγ、11β-HSD1、C/EBPα下降明顯，而Runx2上升明顯，與對照組比較，差異均有統計學意義(P＜0.05)，見表5。

表3 四組大鼠血清骨代謝指標及骨密度水平比較

表3 四組大鼠血清骨代謝指標及骨密度水平比較

注：與對照組比較，aP＜0.05；與SINFH組比較，bP＜0.05；與GM6001-L組比較，cP＜0.05。

組別對照組SINFH組GM6001-L組GM6001-H組F值P值CT(μg/L) 228.45±27.53 65.74±7.83a 120.33±18.84ab177.26±21.27abc25.816 3 0.000只數20 20 20 20 BALP(μg/L) 48.35±4.77 78.24±7.73a62.25±6.17ab57.24±5.22abc14.156 9 0.001 BGP(μg/L) 6.26±0.88 1.33±0.25a2.54±0.32ab4.75±0.37abc6.668 3 0.012 StrACP(U/mL) 34.95±4.57 111.68±8.94a99.63±7.22ab62.84±5.25abc22.671 8 0.000

表4 周四組大鼠骨細胞計數(x±s)

表5 四組大鼠基因表達分析(x-±s)

3 討論

近年來，隨著臨床糖皮質激素的廣泛應用，SINFH的發生率明顯升高。有報道顯示，患者由于長期大劑量服用糖皮質激素，導致骨細胞活性破壞，骨吸收加重，且影響成骨細胞的正常功能，從而引起SINFH的發生[8]。SINFH不僅影響患者的臨床治療效果，而且由于股骨修復過緩緩慢，一定程度上增加臨床治療難度。因此，應積極采取有效治療措施以促進患者股骨頭壞死區域組織的功能修復。

股骨頭是髖關節的重要組成部分之一，對人體起著負重，活動，吸收震蕩等作用。血中鈣磷水平是衡量股骨頭的重要指標之一，兩者水平高低與骨吸收及骨重建密切相關，且其水平高低受多個因子的調控[9]。鈣磷水平的高低受骨堿性磷酸酶、骨鈣素、降鈣素及破骨細胞型抗酒石酸酸性磷酸酶等影響。其中，骨堿性磷酸酶為機體提供無機磷以合成骨鹽結晶，與骨礦化密切相關，可作為成骨細胞成熟的早期標志之一[10]。成骨細胞產生骨鈣素，骨鈣素變化較快，其水平升高有利于骨形成，可直接反應骨代謝水平[11]。破骨細胞型抗酒石酸酸性磷酸酶產生于破骨細胞，主要反應骨吸收[12]。GM6001為一種含羧基的二肽，是一種廣譜金屬蛋白酶抑制劑，被認為是目前人工合成MMPs抑制劑中最強的一種[13]。GM6001的作用機制是通過與MMPs分子中的底物識別部位結合，并在酶的活性中心與催化所需的鋅離子絡合，抑制酶的活化，從而直接抑制MMPs對膠原的破壞。本文SINFH大鼠出現嚴重骨功能異常及骨代謝紊亂，經GM6001治療后，均得到有效改善，提示GM6001抑制MMP活性，可有效改善SINFH伴有的骨功能異常及骨代謝紊亂。另外，骨的主要成分之一為鈣磷，兩者可有效確保骨的力學強度，同時可維持體內礦物質平衡。本文GM6001可提高SINFH大鼠的血清鈣磷水平，有效促進新骨形成。本文SINFH大鼠經GM6001處理后，其股骨骨密度顯著升高，與GM6001改善SINFH的結論相符。另外，SINFH的最早期病理變化為成骨細胞凋亡與破骨細胞激活[14]。本文GM6001可促進SINFH大鼠股骨細胞成骨細胞的生長并抑制破骨細胞的活化。

近年，研究表明，MMPs可參與骨細胞外基質的降解[3]。因此，采用GM6001治療SINFH具有一定可行性。報道顯示，經使用糖皮質激素后，機體細胞外基質大量聚集，骨髓脂肪細胞體積增大，骨小梁稀疏，局部骨量下降，最終發展為骨壞死[15]。本文對激素性股骨頭壞死大鼠經GM6001處理后，結果發現，隨著應用時間的延長，骨小梁面積比值明顯升高，骨髓腔內脂肪占面積比值明顯下降。提示GM6001在SINFH治療方面具有一定的積極作用。11β-HSD1基因是內源性糖皮質激素的最重要調節酶，主要存在于成骨細胞及脂肪細胞的胞漿內，當存在外源性激素作用時間，會誘發11β-HSD1基因表達，同時也會引起PPAPγ、C/EBPα基因表達、Runx2基因減少。其中PPAPγ多存在于骨髓脂肪細胞的細胞質內，具有促進脂肪分化的作用，應用激素后，隨著時間延長，PPAPγ表達增加[16]。C/EBPα多存在于骨髓成骨細胞及脂肪細胞的細胞質及細胞核內，使用糖皮質激素后，隨著時間延長，其陽性細胞比例數升高，即C/EBPα表達增加。Runx2多存在于成骨細胞核及細胞漿內，其中以細胞漿表達為主，具有控制成骨細胞骨鈣素、骨保護素等特異性基因的表達，使用激素后，其染色陽性成骨細胞數量明顯減少，即C/EBPα表達減少[17]。本文SD大鼠經GM6001處理后，隨著時間延長，PAPγ、C/EBPα、11β-HSD1基因表達減少，Runx2升高，與文獻報道結果相符[5]。提示GM6001在SINFH基因表達調控方面發揮作用。

綜上所述，GM6001具有改變SINFH組織學形態以及調節基因表達的作用，其能促進股骨成骨細胞的生長。由于本研究條件限制，關于GM6001在改善SINFH組織學形態及基因表達方面的具體作用機制，還需作進一步分析研究。

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Effects of GM6001 on histomorphology and gene expression in rats with steroid-induced necrosis of femoralhead.

TONG Zhao-fang1,WANG Qing-zhi2,TANG Hong-tao1,ZHU Ying-jie1,LI Guang-ming1,SHA Sha1.1.Center of Hip Disease Research and Treatment,Luoyang Orthopedic Hospital of Henan Province(Orthopedic Hospital of Henan Province),Luoyang 471002,Henan,CHINA;2.Department of Anatomy,Xinxiang Medical University,Xinxiang 453003, Henan,CHINA

ObjectiveTo investigate the effect of GM6001 on histomorphology and gene expression in rats with steroid-induced necroisis of femoral head(SINFH).MethodsA total of 60 healthy SD rats were intragluteally injected with methylprednisolone for the preparation model of avascular necrosis of femoral head,which were randomly divided into the SINFH group,GM6001 low dose group(GM6001-L)and high dose group(GM6001-H)with 20 rats in each group.In GM6001-L group and GM6001-H group,the rats were intravenous injected with GM6001 by 50 mg/kg and 100 mg/kg respectively,1 time per week,for 8 weeks.At the same time,20 healthy SD rats injected with saline were taken as the blank control group.After 12 weeks and 20 weeks,the morphological changes of femoral head in SD rats,and the expression changes of peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ),11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1(11β-HSD1),runt-related transcription factor-2(Runx2),CCAAT/enhancer binding protein-α(C/EBPα) were observed.ResultsCompared with the control group,the serum calcium and phosphorus levels in the model group were decreased within 8 weeks.The levels of serum calcium and phosphorus in SINFH rats treated with GM6001 were significantly higher than those in SINFH group(P＜0.05),and the levels in GM6001-H group were significantly higher than those in GM6001-L group(P＜0.05).The levels of BALP and StrACP in the model group were significantly higherthan those in the control group within 8 weeks(P＜0.05),while the levels of BGP and CT were significantly lower than those in the control group(P＜0.05).The levels of BALP and StrACP in GM6001-L group and GM6001-H group were significantly lower than those in SINFH group(P＜0.05),while BGP,CT levels were significantly higher(P＜0.05).Compared with the control group,the femur and femoral head bone density and femoral head bone cell counts in the model group rats within 8 weeks were significantly decreased,and the osteoclast significantly increased(P＜0.05);Compared with the SINFH group,the femur and femoral head bone density and femoral head bone cell counts in GM6001-L and GM6001-H group rats after 8 weeks were significantly increased,and the osteoclast significantly decreased(P＜0.05). With the increase dose of GM6001 treatment,compared with the SINFH group,the expression of PPARγ,11β-HSD1,C/ EBPα significantly decreased,while Runx2 significantly increased(P＜0.05).ConclusionNecroisis of femoral head in rats may be closely related to the expression of hormone inhibiting osteogenic and adipogenic differentiation related gene and 11β-HSD1.GM6001 can improve the pathological changes and abnormal gene expression,which has the good clinical value.

Avascular necrosis of the femoral head;GM6001;Histomorphology;Gene expression

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.001

R-332

A

1003—6350（2017）15—2409—05

2017-03-20)

河南省教育廳科學技術研究重點項目(編號：142182310068)

仝昭方。E-mail：tfcgd5@163.com