EGFR基因突變與腫瘤標志物表達的關聯性及其對原發性肺癌的診斷價值

鄒傳偉，王小拍，周麗霞

(廣州市第一人民醫院普通內科1、病理科2、心胸外科3，廣東廣州510000)

EGFR基因突變與腫瘤標志物表達的關聯性及其對原發性肺癌的診斷價值

鄒傳偉1，王小拍2，周麗霞3

(廣州市第一人民醫院普通內科1、病理科2、心胸外科3，廣東廣州510000)

目的探討原發性肺癌患者EGFR基因突變及系列腫瘤標志物表達狀況，為肺癌的預防、預測、診斷和治療提供依據。方法選擇2014年3月至2015年12月期間廣州市第一人民醫院收治的160例原發性肺癌患者，取新鮮病理組織標本，用廈門艾德核酸提取試劑提取體細胞DNA，采用擴增阻滯突變系統熒光PCR(ARMS-PCR)技術檢測EGER基因突變，采取外周靜脈血用化學發光法檢測血清系列腫瘤標志物，進行統計學分析。結果160例肺癌患者中，EGER基因野生型比率為47.56%(78/164)，EGER基因突變型比率為52.44%(86/164)，突變型中21L858R點突變占23.17%(38/164)，19Del突變占22.56%(37/164)。所檢測腫瘤標志物按陽性率高低排序為：CYFRA21-1(351/537，65.36%)、CEA(346/532，65.04%)、CA125(203/361，56.23%)、CA153(137/358，38.27%)、CA724(116/365，31.78%)、CA199(71/366，19.40%)、NSE(84/536，15.67%)、SCC(47/535，8.79%)、AFP(31/364，8.52%)。EGER基因21L858R突變肺癌患者較19Del突變肺癌患者腫瘤標志物CEA陽性率高(71.97%和64.86%)，但差異無統計學意義(P＞0.05)；隨著CEA濃度梯度遞增，EGER基因突變率也遞增。結論肺癌致病與EGER基因突變、腫瘤標志物高表達關系密切，通過系列腫瘤標志物和EGER基因突變檢測，將有助于肺癌的診斷和鑒別診斷，并為肺癌治療手段選擇提供依據。

肺惡性腫瘤；EGFR基因；基因突變；腫瘤標志物

肺癌長期來位居國內惡性腫瘤發病率和死因構成中的首位，肺癌是嚴重影響國人健康、威脅生命的惡性疾病[1]。長期的實踐經驗已經證明，肺癌與工業排污、大氣污染、吸煙相關聯。抑制以上有害因素影響，并研究與肺癌致病相關影響因素，以加強肺癌的預防、預測、早期診斷和治療，已引起社會各界高度關注與重視。本研究以160例原發性肺癌患者為樣本，通過手術切除或纖支境等活檢技術獲取新鮮病理組織標本，并經病理組織細胞形態和免疫組化診斷技術確診為肺癌，然后采用肺癌新鮮病理組織提取體細胞DNA，使用擴增阻滯突變系統熒光PCR(ARMS-PCR)法，對160例標本行EGER基因突變檢測，并采取外周靜脈血用化學發光法檢測系列腫瘤標志物，從基因組學和蛋白質組學角度對肺癌致病進行研究，旨在探討肺癌患者中EGER基因突變情況、以及其與系列腫瘤標志物表達的關系，為肺癌的預防、預測、診斷和治療提供依據，現將結果報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料160例原發性肺癌患者來自2014年3月至2015年12月共22個月期間在廣州市第一人民醫院呼吸科、心胸外科、腫瘤科住院的患者，其中男性89例，女性71例；年齡35～86歲，平均(62.12± 1.82)歲。所有患者均根據臨床癥狀和影像學檢查(包括胸部X光照片和胸部CT)作出肺癌初步臨床診斷。

1.2 研究方法

1.2.1 檢測儀器設備EGER基因突變檢測儀器使用美國ABI公司生產的ABI7500PCR儀，DNA提取試劑(型號：FFPE DNA,Cat NO.ADx-FF01)和人類EGER基因突變熒光PCR檢測試劑盒由廈門艾德醫學檢驗所提供。測定提取樣本DNA濃度和純度的紫外分光光度計型號Nanodrop2000。腫瘤標志物系列檢測采用化學發光法，檢測儀器使用德國羅氏Cobas e 602分析儀。

1.2.2 標本處理160例原發性肺癌患者通過手術切除或纖支境檢查等活檢技術獲取新鮮病理組織標本，離體標本30 min內放入商品化的10%中性福爾馬林溶液固定。溶液與標本體積大于10:1，手術標本固定時間為6～12 h，活檢標本為4～8 h。病理組織標本處理程序包括標本收取、石蠟包埋、切片、HE染色、病理組織細胞形態、免疫組化檢查評估等，從而明確肺癌病理診斷。腫瘤標志物檢測需空腹采取靜脈血標本5 mL送檢。

1.2.3 DNA提取與檢測從新鮮病變組織中取樣應確定至少含有30%肺癌病變組織，將石蠟包埋病理組織或切片樣品厚度切成5 μm，取3～8片，選用廈門艾德生物醫藥科技公司的核酸提取試劑提取人類基因組DNA，所提樣本DNA需用紫外分光光度計測定濃度和純度，DNA純度的OD260/280比值為1.8～2.0，提取完的DNA建議立即進行檢測，否則置于-20℃以下保存。人類EGER基因突變檢測試劑盒檢測方法操作流程按照說明書進行。

1.3 統計學方法應用SPSS21.0統計軟件進行數據分析，率的比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者臨床資料及組織病理學分類160例肺癌患者中，男性89例(55.62%)，女性71例(44.38%)。89例男性患者中，吸煙者56例(62.92%)，無吸煙33例(37.08%)；56例男性吸煙者中，按吸煙指數(每天吸煙支數×吸煙年數)計數為：400以下者11例，400～600者20例，700～800者19例，800以上者6例。71例女性患者中吸煙者2例(2.82%)，其吸煙指數均在200以下；無吸煙69例(97.18%)。160例肺癌患者按組織細胞形態和免疫組化檢測結果分類，主要分為腺癌142例(88.75%)、鱗癌10例(6.25%)、其他8例(5%)等類別，其他類中包括腺磷癌、類癌、肉瘤樣癌等。

2.2 EGER基因突變檢測情況160例肺癌患者中，EGER基因野生型為78人次(47.56%)，EGER基因突變型為86人次(52.44%)，突變型中21L858R點突變為38人次(23.17%)，19Del突變為37人次(22.56%)。在89例男性肺癌患者中，共有4例患者EGER基因同時檢測到存在兩個位點突變。其EGER基因突變詳細情況，見表1。

表1160 例原發性肺癌患者EGFR基因突變檢測結果

2.3 腫瘤標志物表達情況腫瘤標志物系列檢測包括細胞角蛋白19片段(CYFRA21-1)、鱗狀上皮癌相關抗原(SCC)、神經元特異烯醇(NSE)、糖類抗原-125 (CA125)、糖類抗原-153(CA153)、糖類抗原-199 (CA199)、糖類抗原-724(CA724)、癌胚抗原(CEA)、甲胎蛋白(AFP)。在明確肺癌病理診斷后，將160例肺癌患者每一例在住院過程中歷次腫瘤標志物檢測結果匯總做縱向統計，將超過正常參考值的作為陽性，計算其陽性率。所檢測腫瘤標志物按陽性率高低排序為：CYFRA21-1為65.36%(351/537)、CEA為65.04% (346/532)、CA125為56.23%(203/361)、CA153為38.27%(137/358)、CA724為31.78%(116/365)、CA199為19.40%(71/366)、NSE為15.67%(84/536)、SCC為8.79%(47/535)、AFP為8.52%(31/364)。EGER基因21L858R突變肺癌患者較19Del突變肺癌患者腫瘤標志物CEA陽性率高(71.97%和64.86%)，差異均無統計學意義(P＞0.05)，見表2。

2.4 肺癌患者EGER基因突變與腫瘤標志物CEA、CYFRA21-1濃度梯度關聯性從以上119例具備完整腫瘤標志物檢測系列的原發性肺癌患者中剔除4例雙位點突變患者后余115例，按腫瘤標志物CEA、CYFRA21-1首診檢測結果以濃度梯度分層，結果見表3和表4。

表2 原發性肺癌患者EGFR基因突變與腫瘤標志物表達陽性率(%)

表3 115例原發性肺癌患者EGFR基因突變與CEA濃度梯度的關聯性(例)

表4 115例原發性肺癌患者EGFR基因突變與CYFRA21-1濃度梯度的關聯性(例)

3 討論

表皮生長因子受體(EGER)是原癌基因(erbB1/ HER1也即EGER基因)的表達產物[2]，定位于細胞膜上，EGER由胞外的配體結合區、疏水跨膜結合域和胞內的蛋白酪氨酸激酶區三部分組成[3]。EGER主要通過兩條途徑將信號傳遞至細胞核，一條是Ras-Raf-MAPK途徑，另一條是PI3K-PKC-IKK途徑，當信號傳導至細胞核后，引起核內基因轉錄水平的增加，使細胞增殖、轉化，EGER信號傳導的異常是包括原發性肺癌等多種腫瘤發生的原因。EGER基因位于人類7號染色體的短臂上，由188 307個堿基組成，包括28個外顯子，其酪氨酸激酶功能區由外顯子18-24編碼，研究發現一些患者EGER基因的編碼區，主要是在外顯子18～21上發生突變，而這些突變與表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGER-TKI)如吉非替尼、厄洛替尼藥物反應性有關。

根據“二次打擊學說”[4]，肺癌是親代遺傳獲得易感變異基礎上，環境致癌因素長期作用，支氣管黏膜上皮細胞EGER、KRAS、BRAF等基因突變積累形成。對于一個特定個體來說，其體內所有類型的細胞均含有同樣一套基因組，而人類各個體基因組存在大量的變異和多態性，這種基因序列差異(包括單核苷酸多態性SNP、短串聯重復序列STR和拷貝數目變異CNV)構成不同個體對疾病易感性和對藥物、環境因素等不同反應的分子基礎。在本研究中，統計結果顯示，89例男性肺癌患者中吸煙者占比62.92%(56/89)，非吸煙者占比37.08%(33/89)；71例女性肺癌患者中吸煙者占比2.82%(2/71)，非吸煙者占比97.18%(69/ 71)。說明環境因素(如吸煙)是否致肺癌，存在著個體易感性差異區別。“二次打擊學說”就是對以上實踐現象貼切的理論解釋。如何通過對人群中由親代遺傳而來的胚系細胞肺癌易感基因的檢測，從而從分子水平上開展肺癌致病的早期“精準預測”與“精準預防”，值得研究者進一步思考、探索與挖掘。有關肺癌組織病理學分類方面，160例肺癌患者中腺癌占大部分，占比88.75%(142/160)，鱗癌占比6.25%(10/160)，其他類別占比5.00%(8/160)，其他類別包括腺磷癌、類癌、肉瘤樣癌等。

腫瘤起源于一些未分化或微分化的干細胞，上皮細胞作為干細胞自我更新的組織和細胞類型，更容易發生癌變，據統計，目前人類腫瘤90%以上是上皮源性[5]。通過本試驗原發性肺癌患者支氣管黏膜上皮細胞EGER基因突變檢測，從基因組學角度，可以發現經病理診斷確診的160例原發性肺癌病例中，EGER基因突變型占比52.44%(86/164)，主要是21L858R點突變(占23.17%，38/164)和19Del突變(占22.56%，37/164)，突變率和突變情況與其他研究結果相近[6-8]，說明肺癌致病與EGER基因突變明確相關[9]。有占比47.56% (78/164)的患者EGER基因未發生突變，表現為野生型，是否存在其他基因突變，情況尚不明確。而18G719X、20T790M、20S768I、20Ins、21L861Q等位點突變頻率較低，均屬于低頻突變。以上160例原發性肺癌EGER基因突變情況，為以后的肺癌基因診斷提供了依據。

根據分子生物學中心法則，遺傳信息從DNA傳遞給RNA，再從RNA傳遞給蛋白質，即完成遺傳信息的轉錄和翻譯過程。在確診的160例原發性肺癌病例中，已發現EGER驅動基因高頻突變。那么，從蛋白質組學角度，腫瘤標志物系列檢測也發現有顯著高表達。經大樣本檢測統計，所檢測腫瘤標志物按陽性率高低排序為：CYFRA21-1(351/537，65.36%)、CEA(346/ 532，65.04%)、CA125(203/361，56.23%)、CA153(137/ 358，38.27%)、CA724(116/365，31.78%)、CA199(71/366，19.40%)、NSE(84/536，15.67%)、SCC(47/535，8.79%)、AFP(31/364，8.52%)，說明原發性肺癌發病與腫瘤標志物表達存在明確正相關，腫瘤標志物檢測有助于原發性肺癌的診斷，但只能起輔助診斷作用，而無確診價值。腫瘤標志物CYFRA21-1、CEA陽性率較高，反映肺癌疾病的一致性較好，說明其檢測靈敏度、診斷價值較高，但易于出現假陽性，在有關肺部良性腫塊腫瘤標志物檢測研究中，兩者都有10%以上假陽性率[10-11]。相反，腫瘤標志物SCC陽性率較低，反映肺癌疾病的一致性較差，說明其檢測靈敏度、診斷價值較低，易出現假陰性。同時將同一患者住院期間歷次腫瘤標志物系列檢測做比較，發現前后結果比較有極好的連貫性。提示對臨床中常碰到的腫瘤標志物檢測結果陽性病例，而對其診斷意義有疑問時，可通過動態檢測、觀察來厘清。在臨床工作中，腫瘤標志物檢測結果的解讀，除觀察是否超過正常參考值，作陰陽性判別外，其數值高低對提示診斷也有價值。一般來說，數值越高、偏離正常參考值越多、越具有肯定診斷價值。160例肺癌病例中，具備以上完整腫瘤標志物系列檢測組合的119例患者的首診檢測結果按同時陽性個數做橫向比較，發現全部陰性共有4例，占比3.36%(4/119，P＜0.05)，屬小概率事件。單個腫瘤標志物陽性占比19.32%(23/119)，多個腫瘤標志物陽性占比77.32%(92/119)，其中同時三個腫瘤標志物陽性占比最高(28/119，23.53%)。以上結果說明，腫瘤標志物檢測在原發性肺癌診斷中有明確的價值。而且，如果進行單個腫瘤標志物檢測，將存在極高漏診率，通過腫瘤標志物系列檢測組合進行檢測，可提高肺癌診斷準確性，降低漏診率。

如上所述，在原發性肺癌中，大約2/3患者腫瘤標志物CEA存在陽性表達。表3所示在74例陽性表達患者中，5 ng/mL≤CEA＜20 ng/mL占37.84%(28/74)，CEA＞20 ng/mL占62.16%(46/74)，說明CEA表達濃度較高。分子生物學理論上有“一個基因一種多肽”假說，那么一個基因中不同位點突變又會有何種影響？有關EGER基因不同突變位點與腫瘤標志物CEA表達的關聯方面，表2中，EGER基因21L858R突變肺癌患者CEA陽性率為71.97%(95/132)，19Del突變肺癌患者CEA陽性率為64.86%(72/111)，差異無統計學意義(P＞0.05)。EGER基因21L858R突變肺癌患者CEA陽性率為74.07%(20/27)，19Del突變肺癌患者CEA陽性率為57.69%(15/26)，差異未統計學意義(P＞0.05)，計算方法不同，但結論一致。說明CEA表達濃度差異較小，屬于微調，而非決定性的。但兩種計算方法均顯示EGER基因21L858R突變肺癌患者較19Del突變肺癌患者CEA陽性表達率高，是否提示EGER基因21L858R位點突變，促使調控序列包括啟動子、增強子功能上調，使EGER基因編碼序列作用加強，從而與腫瘤標志物CEA高表達存在某種內在聯系，尚未能下定論。其次，有關CEA濃度梯度與EGER基因突變關聯方面，發現隨著CEA濃度梯度的遞增，EGER基因突變率也遞增。有研究認為EGER基因突變率隨著術前血清CEA的升高而增加，在沒有條件獲得EGER基因突變的情況下，對于CEA表達水平增高的NSCLC患者，認為其有較高EGER基因突變率，可以嘗試使用EGER-TKI，會有生存獲益[12]。但如上所述，在本研究中未能獲得足夠、可靠的依據支持該結論。

有關腫瘤標志物CYFRA21-1的表達方面，腫瘤標志物CYFRA21-1陽性率較高，在表2總樣本中CYFRA21-1陽性率為65.36%(351/537)，表4中CYFRA21-1陽性率為69.57%(80/115)，數值接近。但其表達濃度較低，表4中80例陽性表達患者，CYFRA21-1＜20 ng/mL占80.00%(64/80)，CYFRA21-1＞20 ng/mL占20.00%(16/80)。其中50 ng/mL＜CYFRA21-1＜200 ng/m者只有5例。有關EGER基因不同突變位點與腫瘤標志物CYFRA21-1表達的關聯方面，表2中，EGER基因21L858R突變肺癌患者CY-FRA21-1陽性率為70.77%(92/130)，19Del突變肺癌患者CYFRA21-1陽性率為57.66%(64/111)，兩者間差異無統計學意義。表4中，EGER基因21L858R突變肺癌患者CYFRA21-1陽性率為70.37%(19/27)，19Del突變肺癌患者CYFRA21-1陽性率為69.23%(18/26)，CYFRA21-1陽性率兩者基本相同。有關CYFRA21-1濃度梯度與EGER基因突變關聯方面，發現CYFRA21-1各濃度梯度之間EGER基因突變率甚為接近，各分層之間EGER基因突變率幾乎無差別。總體來說，EGER基因21L858R與19Del不同位點突變的肺癌患者，其腫瘤標志物表達有些微差別，但不顯著，其內在調控因素、關聯比較復雜。因此，有關EGER基因不同位點突變與腫瘤標志物表達的關聯，仍需要進一步探索、研究。

本試驗通過檢測肺癌病理組織支氣管黏膜上皮體細胞DNA中EGER基因突變，現階段其檢測目的主要是為肺癌的分子靶向治療提供依據，但也存在技術局限，檢測的靶基因為單個基因，實驗所使用的ARMS-PCR技術，可以檢出10 ng DAN樣品中含量低至1%的基因突變[13]，但只能檢測已知位點突變。而下一代測序(NGS)技術可以檢出突變豐度在0.01%～0.1%的突變[14]，檢測靈敏度更高。同時既可檢測已知位點突變，也可檢測未知位點突變。一般認為，肺癌是多基因異常引起的惡性疾病，通過多基因檢測更能反映疾病的全貌。因此從肺癌致病與基因突變關聯分析，從診斷的角度，更趨向于進行多基因突變檢測，甚至是全外顯子組或全基因組檢測。其次，從檢測標本的采取著眼，通過高效的富集、捕獲技術檢測外周血微量循環腫瘤DNA(ctDNA)或循環腫瘤細胞(CtCs)，即所謂的液體活檢技術來進行腫瘤體細胞多基因突變檢測、診斷，是當前的發展趨勢和研究熱點[15-16]。通過以上研究有望提供簡便的、有創新性的檢測技術、手段和方法應用于臨床，對臨床影像學檢查發現肺部占位疑難病例，通過液體活檢技術進行基因突變檢測，同時進行肺癌腫瘤標志物系列檢測，以輔助臨床診斷，確認或排除肺癌，并為進一步治療手段的選擇提供依據。從而從分子病理學角度來推動肺癌的精準預防、預測、基因診斷和治療。

綜上所述，原發性肺癌患者中存在高頻EGER基因突變和系列腫瘤標志物高表達，EGER基因突變型中，以21L858R和19Del占大多數，突變型中女性多于男性。通過EGER基因突變和系列腫瘤標志物檢測，將為肺癌的診斷和治療方法的選擇提供依據。

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Association of EGFR gene mutation with tumor marker expression and its value in the diagnosis of primary lung cancer.

ZOU Chuan-wei1,WANG Xiao-pai2,ZHOU Li-xia3.Department of General Internal Medicine1,Department of Pathology2,Department of Cardio-Thoracic Surgery3,Guangzhou First People's Hospital,Guangzhou 510000,Guangdong, CHINA

ObjectiveTo investigate the association of epidermal growth factor receptor(EGER)gene mutation with the expression of tumor markers in patients with primary lung cancer,and to provide evidence for the prevention,prediction,diagnosis and treatment of lung cancer.MethodsThe fresh pathological tissue specimens were collected from 160 patients with primary lung cancer who admitted to Guangzhou First People′s Hospital from March 2014 to December 2015.Somatic cell DNA were extracted with Xiamen AmoyDx?DNA and RNA Extraction Kits.Then ARMS-PCR technique was used to detect EGER gene mutations.The series of tumor markers were detected by taking the peripheral venous blood with chemiluminescence method,then the data were analyzed statistically.ResultsIn 160 primary lung cancer patients,EGER gene wild type rate was 47.56%(78/164),and EGER gene mutation type rate was 52.44%(86/164)．For EGER gene mutation type,the proportion of 21L858R mutation was 23.17%(38/164),and that of 19Del mutation was 22.56%(37/164)．The detection of tumor markers sorted by positive rate as followes:65.36%(351/ 537)of CYFRA21-1,65.04%(346/532)of CEA,56.23%(203/361)of CA125,38.27%(137/358)of CA153,31.78% (116/365)of CA724,19.40%(71/366)of CA199,15.67%(84/536)of NSE,8.79%(47/535)of SCC,8.52%(31/364)of AFP．Tumor markers CEA positive rate in lung cancer patients of EGER gene 21L858R mutations was 71.97%,which was higher than 64.86%in patients with 19Del mutations(P＞0.05).As the CEA concentration gradient increasing,EGFR gene mutation rate was also increasing.ConclusionLung cancer pathogenesis is closely related to EGER gene mutation and tumor marker overexpression.The detection of series of tumor markers and EGER mutation will contribute to the diagnosis and identification of lung cancer,and provide the basis for lung cancer treatment．

Pulmonary malignant tumor;Epidermal growth factor receptor(EGER)gene;Gene mutation;Tumor markers

10.3969/j.issn.1003-6350.2017.15.005

R734.2

A

1003—6350（2017）15—2426—05

2017-05-03)

廣東省科技計劃項目(編號：2012B31800327)

鄒傳偉。E-mail：zcw.cz@163.com