啤酒污染菌的鑒定及其細胞膜脂肪酸的組成分析

邱然，陸健

(江南大學生物工程學院, 工業生物技術教育部重點實驗室，糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)

研究報告

啤酒污染菌的鑒定及其細胞膜脂肪酸的組成分析

邱然，陸健*

(江南大學生物工程學院, 工業生物技術教育部重點實驗室，糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)

從純生啤酒中富集分離得到11株啤酒污染菌。對這11株菌進行16S rRNA同源性分析和系統發育樹構建。結果表明：11株菌均屬于乳酸桿菌，分屬于植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、類布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)和乳酸短桿菌(Lactobacillusbrevis)3個種。進一步對11株菌的膜脂肪酸組成進行分析，其脂肪酸組成變化規律與16S rRNA進化分布高度一致。將BN01、BN02和BN03號菌接種到不同程度啤酒環境脅迫的培養基中，發現隨著啤酒成分增加，菌的膜不飽和直鏈脂肪酸和鏈長18和20碳的脂肪酸含量增加。該研究結果不僅對啤酒污染菌進行了分類鑒定，而且闡述了基于膜脂肪酸調控的污染菌膜對啤酒環境脅迫的耐受機制。

啤酒；啤酒污染菌；乳酸桿菌；鑒定；脂肪酸

啤酒中含有酒花浸出物質、乙醇、高濃度CO2及低pH、低量溶氧和一定的營養物質，大多數微生物不能在啤酒環境中進行理想的生長繁殖[1]。但是有一些微生物能夠適應啤酒中的環境，并進行正常的生長代謝，這些微生物是啤酒污染菌[2]。啤酒污染菌是一類厭氧或兼性厭氧的微生物，其中乳酸菌是啤酒污染菌中最常見的微生物，大約占啤酒污染菌的80%[3]。這些乳酸菌在啤酒中滋生會影響啤酒風味和生物穩定性，如啤酒變酸、產生雜異味、渾濁、沉淀和產生菌膜等，從而降低了啤酒的可飲用性，縮短了啤酒貨架期[4]。

乳酸菌污染啤酒的前提是它能夠對啤酒環境的脅迫具有適應能力。細胞膜是微生物與外界環境接觸和敏感部位，其脂肪酸組成與細胞適應環境脅迫密切相關[5]。啤酒污染菌的抗酒花蛋白(HopA、HopB、HopC和HitA)和調控酸脅迫相關蛋白(H+-ATPase)都位于細胞上，膜脂肪酸組成能夠調控其活性，進而影響啤酒污染菌的抗酒花和耐酸性能[6]。另外，研究發現乳酸菌膜脂肪酸組成在其耐受乙醇脅迫和酸脅迫方面也起到重要的調控作用[7-8]。因此本研究從市售純生啤酒富集分離啤酒污染菌，運用16S rRNA基因序列分析方法在分子生物學水平上對所分離菌株進行鑒定。然后對不同啤酒污染菌細胞膜的脂肪酸組成進行分析，并進一步研究啤酒環境脅迫對啤酒污染菌膜脂肪酸組成的影響，最終闡明啤酒污染乳酸菌對環境脅迫的適應性及其調控機理， 進而為啤酒污染菌的檢測、評價和控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗原料

市售5個品牌共60瓶瓶裝(500 mL)純生啤酒，用于啤酒污染乳酸菌的分離。

1.1.2 培養基

MRS培養基：購于青島海博生物技術有限公司。NBB培養基(%)：葡萄糖1.5，麥芽糖1.5，酪蛋白胨0.5，酵母浸粉0.5，牛肉膏0.2，乙酸鉀0.6，磷酸氫二鈉0.2，L-半胱胺酸鹽酸鹽0.02，L-蘋果酸0.05，瓊脂2；Tween-80 0.05 ，氯酚紅0.0022 ，m(啤酒)∶m(蒸餾水)=1∶1，pH 5.8。

1.1.3 菌株

乳酸短桿菌ATCC367：來源于青貯，購于中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)。

啤酒酵母w-34/70：由江南大學生物工程菌種保藏中心提供。

1.2試驗方法

1.2.1 純生啤酒理化分析

啤酒脫氣：旋轉振蕩法[9]；pH檢測：運用梅特勒酸度計檢測脫氣啤酒pH；乙醇濃度：頂空進樣氣相色譜法檢測[9]；啤酒苦味值：參考文獻[9]。

1.2.2 啤酒污染菌的分離純化

在無菌條件下，將每瓶純生啤酒(500 mL)用超濾膜(直徑10 cm，孔徑0.22 μm)進行過濾，然后將濾膜倒置于NBB固體培養基上，30 ℃恒溫培養48 h，揭開超濾膜，將平板上單菌落轉接至NBB斜面上，于4 ℃進行保藏。

在Whitley A35厭氧工作站中進行厭氧菌篩選，包括純生啤酒過濾、培養和NBB培養基穿刺保藏。

1.2.3 啤酒污染菌理化鑒定

污染菌啤酒腐敗能力鑒定參考文獻[10]；顯微形態觀察，革蘭氏染色和過氧化氫酶活性參考文獻[11]；乳酸檢測運用高效液相色譜法參考文獻[11]。

1.2.4 16S rRNA序列與菌株鑒定

[11]。

1.2.5 細胞膜脂肪酸組成檢測[7,12]

(1)菌體培養

將啤酒污染菌接種到MRS培養基中，30 ℃恒溫靜止培養，在穩定前期收集菌體，取一定量混勻發酵液，在4℃條件下8 000 r/min離心10 min，去離子水洗滌2遍，收集菌體，然后對其膜脂肪酸組成進行檢測。

(2)細胞膜脂肪酸提取

取約1 g的菌體，加入7 mL甲醇氯仿(2∶1，v/v)混合溶液。室溫條件下旋渦2 h，迅速置于4℃條件下放置24 h，取出后在4℃條件下6 000 r/min離心10 min，收集上清液備用；沉淀用3.75 mL甲醇氯仿水(2∶1∶0.8，體積比)混合溶液潤洗，在4℃條件下6 000 r/min離心10min，收集上清液備用。將前面兩次離心所得上清液合并，在其中加入5 mL、4℃預冷的水氯仿(1∶1，v/v)轉換為雙向體系。用移液管移出氯仿(下相)，此相包括細胞膜脂，迅速氮吹蒸發溶劑，獲得約50 μL的細胞膜脂，迅速加入1 mL(4℃)預冷的氯仿甲醇(1∶1，v/v)混合溶液，樣品于-20℃保存備用。

(3)脂肪酸甲酯化

將所得細胞膜脂肪酸樣品重新氮吹，蒸發除去氯仿:甲醇混合溶液，加入3 mL KOH的甲醇溶液，70 ℃水浴回流5 min。冷卻加入1 mL三氯化硼乙醚溶液70 ℃水浴回流5 min，冷卻。加入3 mL正己烷提取3次。合并提取液，用甲醇潤洗，移除上層溶液，加入飽和NaCl，放置3～5 min，氮氣吹干，1 mL正己烷定容，獲得脂肪酸甲酯待測樣品。

(4)脂肪酸分析

氣相色譜分析條件：采用HP-5彈性石英毛細管柱(30 m × 0.25 mm × 0.25 μm)，進樣口溫度250 ℃，載氣為高純氦氣，柱流速1 mL/min，柱前壓73.0 kPa，柱起始溫度70℃，保持2 min，以5℃/min升至230℃，保持20 min，再以5℃/min升至280℃，保持15 min，分流進樣1 μL，分流比20∶1。

質譜分析條件：用電子轟擊源(EI)分析，電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，接口溫度250 ℃，選取全程離子碎片掃描(SCAN)模式，質量掃描范圍40～650，溶劑延遲3.5 min。

(5)脂肪酸組成分析

細胞膜脂肪酸峰面積總和認為是100%，根據每種脂肪酸峰面積占總峰面積的比例計算脂肪酸的相對質量分數，即：

飽和度和鏈分支組成分析：直鏈飽和脂肪酸質量分數總和，直鏈不飽和脂肪酸質量分數總和，支鏈飽和脂肪酸質量分數總和，支鏈不飽和脂肪酸質量分數總和；鏈長組成分析：不同長度脂肪酸質量分數總和。

1.2.6 啤酒環境脅迫對膜脂肪酸組成的影響

將啤酒污染菌接種到MRS培養基中，30 ℃恒溫靜止培養48 h，然后用無菌MRS培養基稀釋發酵液濃度至OD600=0.2。將稀釋發酵液以1%接種量分別接種到培養基M(MRS培養基)、培養基M/B(50% MRS培養基+50%啤酒)和培養基B(啤酒)中，30 ℃恒溫靜止培養，在對數期和穩定期取一定量混勻發酵液，在4 ℃條件下8 000 r/min離心10 min，去離子水洗滌2遍，收集菌體，然后對其膜脂肪酸組成進行檢測。生物量運用MRS平板計數法檢測。

2 結果與討論

2.1啤酒的理化性質

50瓶5個品牌的瓶裝純生啤酒的pH、乙醇濃度和苦味值進行分析，結果見表1。5個品牌的純生啤酒的pH范圍為pH3.9～pH4.2，乙醇濃度范圍為2.2%～2.3%和苦味值范圍為7.2～8.0。

表1 5個品牌啤酒的理化指標(n=10)

2.2啤酒污染菌的分離純化

7個菌落從NBB固體培養基從純生啤酒中被分離出來，然后經過5代劃線純化得到7株啤酒污染菌，編號：BN01～BN07。在厭氧條件下，4株菌被分離出來，編號：ABN01～ABN04。這11株菌均能引起啤酒明顯渾濁，說明這些菌是啤酒腐敗菌。另外，這11株菌均表現為短桿狀、革蘭氏陽性、過氧化氫酶陰性和產乳酸。根據這一結果初步斷定這些菌為乳酸菌。

2.3啤酒污染菌的16SrRNA鑒定及系統發育樹構建

對上述11株啤酒污染菌進行16S rRNA序列為分子指標進行菌種鑒定。運用NCBI網站中BLAST程序，將所測定的11株菌株的16S rRNA序列，與Genbank數據庫中已知細菌的16S rRNA序列進行比較鑒定，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種，結果如表2所示。

表2 啤酒污染菌的16S rRNA序列對比與分子鑒定

一般認為，16S rRNA序列同源大于98%屬于同一種。由表2結果可知，這11株啤酒污染菌與基因數據庫中已報道的乳酸桿菌屬的16S rRNA的同源性匹配性較高，均在98%以上，其中BN01、ABN02和ABN04號菌與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)同源性最高，BN02號菌與類布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)同源性最高，其余菌(BN03～BN07、ABN01和ABN03)與乳酸短桿菌(Lactobacillusbrevis)同源性最高。

采用Clustal X2.1和MEGA4.1軟件進行16S rRNA多序列對比和鄰近連接(NJ)分析，構建系統發育樹，結果見圖1。

圖1 啤酒污染菌16S rRNA序列的系統發育樹Fig. 1 Phylogenetic tree based on the homologies of 16S rRNA sequences of beer bacteria

由圖1可知，來源于啤酒的污染菌同屬于乳酸桿菌屬，分屬3個不同種。菌株BN01、ABN02和ABN04與植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)WCFS1處于同一分支；菌株BN02與類布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)DSM5707處于同一分支；菌株BN03～BN07、ABN01和ABN03與乳酸短桿菌(Lactobacillusbrevis)ATCC14869和ATCC367處于同一分支。這一結果說明污染菌與不同來源的乳酸菌可能擁有共同祖先，但在不同環境中進化所致。也表明這些乳酸菌可能具有多樣的適應機制能夠在不同環境脅迫中生存。

這11株菌均為Lactobacillus屬。Lactobacillus菌是一類革蘭氏陽性，并且是乳酸菌的重要組成部分。在啤酒腐敗菌中，Lactobacillus菌被認為是對啤酒生產極具威脅的腐敗菌，因為其會對啤酒品質和風味產生不良影響。這一結果與文獻報道的多年來世界各地啤酒污染菌絕大部分是乳酸桿菌，70%以上是乳酸短桿菌的結果一致[3]。此次分離得到的11株啤酒污染菌中7株為乳酸短桿菌(L.brevis)。MENZ等[13]從澳大利亞精釀啤酒中分離出45株乳酸菌，其中34株為乳酸短桿菌(L.brevis)。HOLLEROV和 KUBIZNIALCOV[14]研究發現，捷克啤酒的污染菌種62.5%為乳酸短桿菌(L.brevis)。另外，本研究分離得到3株植物乳桿菌(L.plantarum)和1株類布氏乳桿菌(L.parabuchneri)。LIN等[15]會在麥汁、釀造過程或啤酒中檢測到植物乳桿菌(L.plantarum)、類布氏乳桿菌(L.parabuchneri)和布氏乳桿菌(L.buchneri)。

2.4細胞膜脂肪酸組成分析

將11株啤酒污染菌在MRS平板上進行劃線，30 ℃恒溫培養48 h，收集菌體，進行細胞膜脂肪酸提取和脂肪酸甲酯衍生化，然后進行氣相色譜分析，并根據飽和度、鏈分支情況和鏈長分布等特征進行總結，結果見圖2和圖3。

圖2 啤酒污染菌細胞膜脂肪酸組成(飽和度和鏈分支)Fig. 2 Desaturation and branched distribution of membrane fatty acid of beer bacteria

由圖2可知，11株菌細胞膜中均含有大量飽和直鏈脂肪酸，含量從12%到60%，這說明飽和直鏈脂肪酸在啤酒污染菌的分類及適應環境脅迫方面都是必不可少的成分。但是，這11株啤酒污染菌細胞膜脂肪酸組成(飽和度和鏈分支)存在顯著差異。11株菌膜脂肪酸的飽和度和鏈分支情況大致可分為2大類，其中以BN03～BN07、ABN01、ABN03號菌為一類，含有不飽和直鏈和飽和直鏈脂肪酸，兩者比例從86∶12到46∶48。另外，以BN01、BN02、ABN02和ABN04為另一類，與第一類相比，這2株菌不飽和直鏈脂肪酸含量明顯降低，出現比例較高的飽和支鏈脂肪酸，含量分別為21.18%和53.29%。釀酒酵母菌的不飽和直鏈脂肪酸含量高達94.5%，飽和直鏈脂肪酸含量為4.9%，這一比例與污染乳酸菌具有明顯的區別。

圖3 啤酒污染菌細胞膜脂肪酸組成(鏈長)Fig. 3 Chain length distribution of membrane fatty acid of beer bacteria

圖3表示11株啤酒污染菌細胞膜脂肪酸的鏈長分布。這些菌中含有鏈長為C14到C20的脂肪酸，但組成上存在差異，BN03～BN07、ABN01、ABN03號菌的脂肪酸鏈長組成相對集中。主要含有C16和C18脂肪酸，占總脂肪酸的99%以上。釀酒酵母脂肪酸鏈長分布與此相似，C16和C18脂肪酸的含量占總脂肪酸97.5%。BN01、BN02、ABN02、ABN04號菌的脂肪酸鏈長組成相對復雜，BN01、ABN02、ABN04號菌主要是C15和C20占總脂肪酸約50%，C16、C17和C18占約48%。BN02號菌主要是C16和C17占總脂肪酸70%。

結合前文所述，以16S rRNA序列構建的進化樹分布為依據來分析脂肪酸組成的變化趨勢。根據16S rRNA序列進化樹分布可將11株啤酒污染菌分為3類，這與細胞膜脂肪酸組成分類高度一致。脂肪酸是微生物細胞膜重要組成成分，微生物具有其獨特的膜脂肪酸指紋圖譜，與微生物分子生物學分類具有高度同源性。目前國內外已有將脂肪酸用于微生物分類鑒定的報道[16]。因此，可以通過膜脂肪酸組成對啤酒污染菌進行分離和鑒定，可以縮短檢測時間和節省檢測經費。

2.5啤酒環境脅迫對細胞膜脂肪酸組成的影響

細胞膜脂肪酸組成會隨著細胞環境的變化而發生相應的變化。本研究以BN01、BN02和BN03號菌和乳酸短桿菌ATCC367(分離于青貯)為例，研究其細胞膜脂肪酸對啤酒環境脅迫的響應。將BN01、BN02和BN03號菌分別接種到培養基M(MRS培養基)、培養基M/B(50%MRS培養基+50%啤酒)及培養基B(啤酒)中，ATCC367菌接種到培養基M(MRS培養基)和培養基M/B(50%MRS培養基+50%啤酒)中，然后在對數期和穩定期收集菌體，對其膜脂肪酸組成進行分析及分布規律進行總結，結果見圖4和圖5。

I-M：對數期-培養基M；I-M/B：對數期-培養基M/B；I-B：對數期-培養基B;II-M：穩定期-培養基M；II-M/B：穩定期-培養基M/B；II-B：穩定期-培養基B圖4 不同啤酒含量條件下乳酸短桿菌BN03和ATCC367細胞膜脂肪酸組成(飽和度和鏈分支)Fig. 4 Desaturation and branched distribution of membrane fatty acid of Lactobacillus brevis BN03 and ATCC 367 at different content of beer

I-M：對數期-培養基M；I-M/B：對數期-培養基M/B；I-B：對數期-培養基B;II-M：穩定期-培養基M；II-M/B：穩定期-培養基M/B；II-B：穩定期-培養基B圖5 不同啤酒含量條件下乳酸短桿菌BN03和ATCC367細胞膜脂肪酸組成(鏈長)Fig. 5 Chain length distribution of membrane fatty acid of Lactobacillus brevis BN03 and ATCC 367 at different content beer

由圖4可知，在不同條件下BN01、BN02和BN03號菌膜脂肪酸類型保持不變，含有飽和、不飽和直鏈脂肪酸和飽和支鏈脂肪酸，但它們比例發生變化，隨著啤酒含量的增加，膜不飽和脂肪酸直鏈含量逐漸增加，飽和直鏈和飽和支鏈脂肪酸含量逐漸降低。這種脂肪酸組成變化在穩定期比對數期更加顯著。由此可見啤酒腐敗乳酸菌膜不飽和脂肪酸含量增加在適應啤酒環境脅迫方面起到重要作用。

短乳酸桿菌ATCC367與BN03的16S rRNA的同源性匹配達到99%，但ATCC367菌來源于青貯，不具備在啤酒中繁殖生長的能力。達到穩定期，ATCC菌在MRS培養基的生物量(8.14 lg CFU/mL)比BN03菌生物量(8.05 lg CFU/mL)略低；在50%MRS培養基+50%啤酒中，ATCC367菌的生物量(3.54 lg CFU/mL)顯著低于BN03菌的生物量(6.39 lg CFU/mL)；ATCC菌在啤酒中不能生長繁殖，BN03菌在啤酒中的生物量為5.06 log cfu/mL。ATCC367菌在MRS培養基和50%MRS培養基+50%啤酒中膜脂肪酸組成類型與BN03相似。對數期ATCC367菌在含50%啤酒的MRS培養基中不飽和直鏈脂肪酸含量比在MRS培養基中升高了4.31%；穩定期分別升高了11.62%。由此結果可知，ATCC367菌膜脂肪酸含量隨啤酒含量增加而增加，但是其增加量顯著低于BN03菌。這一結果說明啤酒腐敗菌膜不飽和脂肪酸的增加范圍比非腐敗菌較高，這可能是腐敗菌適應啤酒環境脅迫的主要原因。

啤酒中含有高濃度乙醇(0.5%～10% vol)，酒花苦味質(約17～55 mg/L異α-酸)和pH值呈酸性(3.8～4.7)等環境脅迫條件[17]。這些啤酒環境脅迫對啤酒污染菌膜脂肪酸組成產生了影響。研究發現乳酸菌細胞膜脂肪酸的不飽和度決定了細胞膜的厚度和黏度，進而提高對環境脅迫的適應性[18]。趙文英等[7]研究發現酒酒球菌SD-2a在乙醇脅迫條件下，細胞膜通過調整層膜脂與乙醇平衡，進而抵制由于乙醇在膜上聚集所產生毒性作用。另外，JOBIN等[19]研究發現乳酸菌細胞膜流動性增強可誘導表達膜結合蛋白。因此推測BN03號菌在適應乙醇脅迫環境時，細胞膜流動性增強，誘導膜上脅迫蛋白大量表達，增加了細胞膜中蛋白與磷脂的比例，從而抵抗啤酒中乙醇引起的膜脂無序性的增加。啤酒的低pH值和異α-酸也會對乳酸菌膜脂肪酸組成產生影響。在酸性環境中，細胞膜不飽和脂肪酸數量會隨著環境條件變化而發生改變。研究表明，細胞膜脂肪酸組成變化在細胞適應低pH條件方面起到關鍵作用。酸脅迫可提高細胞膜脂質中不飽和脂肪酸含量，進而增加細胞膜在低pH條件下的正常流動性和生理功能。袁崢等[20]對嗜酸乳桿菌的細胞膜中脂肪酸進行檢測，發現隨著pH下降，細胞膜單不飽和脂肪酸和長鏈脂肪酸的含量增加。單不飽和脂肪酸和長鏈脂肪酸作為“阻滲層”降低H+對細胞膜的滲透[13]。可推測，細胞膜組成變化，尤其是不飽和脂肪酸含量的增加，是乳酸菌適應酸性環境維持正常生理功能的結果。

由圖5可知，在不同條件下BN01、BN02和BN03號菌膜脂肪酸鏈長組成保持不變，但它們比例發生變化，隨著啤酒含量的增加，BN01號菌中C18和C20脂肪酸含量增加，C16脂肪酸含量降低，BN02號菌中C18和C20脂肪酸含量增加，C15脂肪酸含量降低，BN03號菌中C18脂肪酸含量增加，C16脂肪酸含量減低。這種脂肪酸鏈長變化在穩定期比對數期更加顯著。對數期ATCC367菌在含50%啤酒的MRS培養基中C18脂肪酸含量比在MRS培養基中升高了4.71%；穩定期分別升高了11.13%。酸脅迫條件下，乳酸菌膜脂肪酸碳鏈長度增加，使脂肪酸更容易橫跨膜雙分子層，通過疏水作用與其他脂類和蛋白結合，使脂肪酸鏈更緊湊，膜環境形成“凝膠狀”，增加膜穩定性，進而提高對酸脅迫的適應性[21]。

3 結論

對純生啤酒中富集分離得到7株啤酒污染菌進行16S rRNA同源性分析和系統發育樹構建。這11株菌均屬于乳酸桿菌，包括植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、類布氏乳桿菌(Lactobacillusparabuchneri)和乳酸短桿菌(Lactobacillusbrevis)3個種。

對11株菌的膜脂肪酸組成進行分析，其脂肪酸組成變化規律與16S rRNA進化分布高度一致。將BN01、BN02和BN03號菌接種到不同程度啤酒環境脅迫的培養基中，研究發現隨著啤酒成分增加，BN03號菌的膜不飽和直鏈脂肪酸和鏈長18和20碳的脂肪酸含量增加。

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Identificationofbeer-spoilagebacteriumandanalysisofitsmembranefattyacidscomposition

QIU Ran, LU Jian*

(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China)

A total of 11 strains of beer-spoilage bacteria were isolated from draft beer. The homology of 16S rRNA was analyzed and phylogenetic tree was structured for these 11 beer-spoilage bacteria. These 11 beer-spoilage bacteria were all classified intoLactobacillusgenus, includingLactobacillusplantarum,LactobacillusparabuchneriandLactobacillusbrevis. Variation of beer-spoilage bacteria membrane lipid composition was consistent with the result of 16S rRNA. The contents of straight chain unsaturated fatty acids and C18 and C20 fatty acids of BN01, BN02 and BN03 were increased with increase of beer content. These results not only classified and identified beer-spoilage bacteria but also expound tolerance mechanism of beer environmental stress based on regulation of fatty acids of beer bacteria membrane.

beer; beer-spoilage bacteria;Lactobacillus; identification; membrane fatty acids

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013105

博士研究生(陸健教授為通訊作者，E-mail：jlu@jiangnan.edu.cn)。

863計劃(啤酒用新酶創制與低碳制造關鍵技術研究2013AA102109)；江蘇高校優勢學科建設工程項目

2016-10-08，改回日期：2017-03-27