NaCl對豬肉糜加工特性和蛋白質二級結構的影響

李 可，趙穎穎，康壯麗*，王虎虎，馬漢軍，徐幸蓮

（1.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，食品生產與安全河南省協同創新中心，河南 鄭州 450001；2.河南科技學院食品學院，食品生產與安全河南省協同創新中心，河南 新鄉 453003；3.南京農業大學，國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095）

NaCl對豬肉糜加工特性和蛋白質二級結構的影響

李 可1，趙穎穎1，康壯麗2,*，王虎虎3，馬漢軍2，徐幸蓮3

（1.鄭州輕工業學院食品與生物工程學院，食品生產與安全河南省協同創新中心，河南 鄭州 450001；2.河南科技學院食品學院，食品生產與安全河南省協同創新中心，河南 新鄉 453003；3.南京農業大學，國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095）

NaCl是豬肉糜制品加工過程中必不可少的輔料，為進一步探明NaCl在豬肉糜加工過程中的作用，通過低場核磁共振和拉曼光譜等方法，研究了NaCl對豬肉糜的蒸煮得率、硬度、水分遷移和蛋白質二級結構的影響。結果表明：蒸煮得率和硬度隨著NaCl添加量的增加而顯著提高（P＜0.05），特征峰T2b和T22的自旋-自旋弛豫時間逐漸縮短，T21（不易流動水）的峰面積比例逐漸增加；NaCl添加量從1%增加到2%，對蛋白質二級結構含量影響顯著，β-折疊含量提高，從2%增加到3%，二級結構相對含量差異不顯著（P＞0.05）；隨著NaCl添加量的增加，—OH基團伸縮振動波峰向高波數方向移動（3 226 cm-1和3 227 cm-1），水分子內氫鍵增多。因此，在豬肉糜加工中適量添加NaCl能夠改變豬肉糜蛋白質二級結構，增強蛋白質的水合作用，有助于提高豬肉糜的加工特性。

拉曼光譜；低場核磁共振；保水性；二級結構；水分子結構

豬肉糜制品品種豐富，能夠給消費者在營養、質構和風味等方面提供較多選擇。在豬肉糜制品加工制作過程中，NaCl對豬肉糜的加工特性起著關鍵作用。NaCl能夠提取肌肉中的鹽溶性肌原纖維蛋白，促使肌原纖維蛋白發生溶解和溶脹，增加肉糜的保水保油性，影響產品的出品率、質構和貨架期[1-2]；作為咸味劑，NaCl有助于提高肉制品的風味[3]。因而降低或提高NaCl的添加量都會影響產品品質。目前，豬肉糜制品的消費量逐年增加，但傳統豬肉糜制品中NaCl含量都較高，攝入過量NaCl會增加患高血壓和心血管疾病的風險[4]。因此，如何選擇合適的NaCl添加量是豬肉糜制品加工過程中一個研究難點[5]，需要進一步研究NaCl對豬肉糜加工特性和蛋白質二級結構的影響。

蒸煮得率是衡量肉糜制品保水性的常用指標，也能反映肉糜凝膠結構的優劣。NaCl影響肉糜蛋白質功能特性，特別是凝膠的保水性，但對于NaCl影響肉糜保水性的機理，如水分分布狀態的變化與蛋白質二級結構及水分子氫鍵變化的關系研究報道較少。低場核磁共振（low field nuclear magnetic resonance，LF-NMR）是一種無損的、非侵入式的測量高含水量樣品水分分布狀態和移動性的技術[6]，拉曼光譜也是一種快速、無損的提供蛋白質肽鏈變化信息的技術，如通過拉曼光譜可以測定肌肉蛋白質二級和三級結構的變化及對共價鍵和非共價鍵的影響，且因水對散射光譜影響較小，其能夠直接用于水相系統[7-8]。因此，本實驗應用拉曼光譜和LF-NMR技術研究不同NaCl添加量豬肉糜中蛋白質二級結構和水分子及水分分布狀態的變化，探究NaCl對豬肉糜保水性和硬度影響的機理，為豬肉糜制品在加工過程中添加適量的NaCl提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷卻24～48 h的豬后腿肉（水分含量為70.58%、蛋白質含量為21.25%、脂肪含量為6.98%、pH值為5.78）購于眾品集團。剔除豬肉中的結締組織和多余的脂肪，使用絞肉機絞碎（6 mm），每份1 000 g分裝于雙層真空包裝袋（PE/尼龍）中，真空包裝后貯存于-20 ℃冷庫中，2 周內用完。使用前在0～4 ℃冷庫中解凍約12 h至中心溫度為0 ℃左右。NaCl、白胡椒粉等均為食品級。

1.2 儀器與設備

JY Labram HR 800顯微激光拉曼光譜儀 法國Jobin-Yvon公司；PQOOl臺式NMR分析儀 上海紐邁電子有限公司；UMC-5C斬拌機 德國Stephan公司；質構儀英國StableMicroSystem公司；絞肉機 山東嘉信食品機械有限公司；HH-42水浴鍋 常州國華電器有限公司；CR-40色差計 日本美能達公司；AUY120電子天平 日本島津公司；L-80-XP高速離心機 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 肉糜的制備

凍肉解凍到中心溫度為0 ℃左右。豬肉糜配方：取豬后腿肉1 000 g，冰水200 g，NaCl添加量分別為1%（12 g，T1）、2%（24 g，T2）、3%（36 g，T3），白胡椒粉2 g。使用Kang Zhuangli等[9]的加工工藝并作修改：將解凍好的豬肉、NaCl放入真空斬拌機，1 500 r/min斬拌30 s，并緩慢加入1/3體積的冰水；加入白胡椒粉，1 500 r/min斬拌30 s，并緩慢地加入1/3體積的冰水；3 000 r/min斬拌60 s，并緩慢地加入1/3體積的冰水（中心溫度低于10 ℃）。將35 g肉糜裝入50 mL的離心管中，500×g離心3 min完全除去肉糜中的氣泡，然后放入80 ℃水浴鍋中煮制20 min（中心溫度72 ℃），冷卻后放入0～4 ℃冷庫中待用。

1.3.2 蒸煮得率測定

2 ℃過夜冷卻后，從離心管中取出，用吸水紙將豬肉糜外部的滲出液吸取干凈，分別對豬肉糜的質量進行測定，蒸煮得率按照以下公式計算。

式中：m1為蒸煮前肉糜質量/g；m2為蒸煮后肉糜質量/g。

1.3.3 質構分析

將過夜冷卻的豬肉糜放置在室溫條件下回溫2 h，使豬肉糜內外溫度一致。在室溫條件下使用質構儀對豬肉糜（直徑20 mm、高度20 mm的圓柱體）進行質構測定。參數設置如下：測試前速率為2.0 mm/s，測試速率為2.0 mm/s，測試后速率為3.0 mm/s；壓縮比50%；時間5 s。使用P/50測試探頭進行測定，得到豬肉糜的硬度/N[10]。每組樣品測定5 次。

1.3.4 LF-NMR自旋-自旋弛豫時間測定

應用臺式脈沖NMR分析儀PQ001進行NMR自旋-自旋弛豫時間（T2）的測量。稱取質量為2 g左右的豬肉糜放入直徑為15 mm的核磁管后放入分析儀中。測量溫度為32 ℃，質子共振頻率為22.6 MHz。參數設置如下：τ-值為（90°脈沖和180°脈沖之間的時間）為200 μs。重復掃描32 次，重復間隔時間為6.5 s，得到12 000 個回波，每組樣品測試4 次。

1.3.5 拉曼光譜測定

取適量豬肉糜均勻涂抹在載玻片中央，使用顯微拉曼光譜儀進行測定。用單晶硅對拉曼光譜儀進行頻率校正，再用50 倍長焦距鏡頭將激光聚焦到樣品上，功率100 mW左右，獲取的拉曼光譜波數在400～3 600 cm-1范圍內。每個肉樣測定3 次。具體測定條件如下：600 g/mm光柵，狹縫200 μm，3 次掃描數據，獲取速率為120 cm-1?min-1，分辨率為2 cm-1，積分時間為60 s。因苯丙氨酸環在1 001 cm-1伸縮振動強度不隨蛋白質結構變化而變化，可將其作為內標對拉曼光譜數據進行歸一化。根據文獻[11-12]已報道的蛋白質和多肽拉曼光譜，對氨基酸側鏈和肽鍵骨架振動光譜條帶進行指認和分析。蛋白質二級結構（α-螺旋、β-折疊、β-轉角、無規卷曲）的相對含量使用Alix等[12]的方法計算得到。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 蒸煮得率

圖1 不同NaCl添加量豬肉糜的蒸煮得率Fig. 1 Cooking yield of pork meat batters with various amounts of NaCl

由圖1可知，NaCl添加量對豬肉糜的蒸煮得率影響顯著（P＜0.05）。蒸煮得率隨著NaCl添加量的增加而提高，T3有最高的蒸煮得率，T2次之，T1最低（P＜0.05）。提高豬肉糜中NaCl的添加量，有利于肌原纖維蛋白的溶解和溶出。Totosaus等[13]報道了通過增加豬肉糜和牛肉糜中NaCl的添加量，使肌原纖維蛋白的提取量和溶解度提高。Kang Zhuangli等[9]也發現豬肉糜中肌原纖維蛋白溶解度隨著NaCl添加量的增加而顯著提高（P＜0.05）。肌原纖維蛋白的溶出量顯著影響豬肉糜的蒸煮得率[14]，因為提取較多的肌原纖維蛋白能夠形成穩定的肉糜體系，在加熱過程中能利用充足的肌原纖維蛋白與不溶性肌肉組織形成良好的蛋白質基質。Tobin等[15]報道了與高鹽法蘭克福香腸（2.0%、2.5%和3.0% NaCl）相比，低鹽（1%和1.5% NaCl）香腸有較高的蒸煮損失。

2.2 硬度

圖2顯示NaCl添加量對豬肉糜的硬度影響顯著（P＜0.05）。隨著NaCl添加量的增加，豬肉糜的硬度增大。這是由于NaCl添加量的增加提高了肌原纖維蛋白的溶解和溶脹性，從而提高鹽溶性蛋白的提取量。Tobin等[15]發現減少NaCl添加量，法蘭克福香腸的硬度降低。另外，不同NaCl添加量的肉糜中，溶出的肌原纖維蛋白不同，也影響凝膠的形成。如減少NaCl添加量導致肌原纖維蛋白，特別是肌球蛋白和肌動蛋白提取量和溶解量的減少，影響肌原纖維蛋白的功能特性[16]。因此，增加NaCl添加量能夠提高豬肉糜凝膠的硬度[17]。

圖2 不同NaCl添加量豬肉糜的硬度Fig. 2 Hardness of pork meat batters with various amounts of NaCl

2.3 LF-NMR質子T2分析

表1 NaCl添加量對豬肉糜弛豫時間的影響Table 1 Effect of NaCl addition on relaxation times of pork meat batters ms

豬肉糜凝膠體系中水的分布和移動性能夠通過質子T2來反映[18]。本研究中豬肉糜凝膠體系共出現4 個特征峰，分別為T2a、T2b、T21和T22（表1）。T2越短表明水與底物結合越緊密，越長表明水分越自由[19-20]。結合水T2在0～10 ms之間，表示豬肉糜凝膠中蛋白質等大分子結合的水和部分脂肪中的水分，分別用T2a和T2b表示；T21和T22的T2分別在20～100 ms和250～400 ms之間，分別代表不易流動水和自由水[6]。隨著NaCl添加量的增加，豬肉糜中T2b和T22起始T2較短，說明增加NaCl有利于形成良好的凝膠結構，限制了水的移動，而水的可移動性降低造成了T2下降。T21隨著NaCl從1%增加到2%，T2延長，表明凝膠具有均勻和細致的孔狀結構，有利于毛細管力的形成和保持較多的水分[21-23]。而添加2%和3% NaCl的豬肉糜中，T21的T2差異不顯著（P＞0.05），表明添加2% NaCl對可移動水的影響與3% NaCl一致。

表2 NaCl添加量對豬肉糜峰面積比例的影響Table 2 Effect of NaCl addition on peak ratio of pork meat batters %

由表2可知，NaCl添加量對不同狀態水所對應的峰面積比例影響顯著（P＜0.05）。增加NaCl添加量能夠降低結合水（T2b）和自由水（T22）的峰面積比例，增加不易流動水（T21）的峰面積比例，表明提高NaCl有利于三維網狀凝膠結構的形成，并將水分束縛于凝膠中，減少水分的損失[24]。NMR測量T2結果表明，提高NaCl添加量能夠增加豬肉肉糜蛋白質與水的交互作用，提高凝膠的保水性。

2.4 拉曼光譜分析

2.4.1 二級結構

豬肉糜蛋白酰胺Ⅰ帶位于拉曼光譜的1 665 cm-1附近[8,25]，主要通過肽鍵C＝O的伸縮振動，也包含Cα—C—N的彎曲振動、C—N的伸縮振動、N—H的面內彎曲振動提供蛋白質二級結構的信息[11]。由于酰胺Ⅰ帶對肽鍵上氫鍵的變化比較敏感，α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲含量的變化分別交錯有序地通過1 650～1 660、1665～1680、1680 cm-1和1660～1665 cm-1條帶上的變化來反映[26-27]。

由表3可知，NaCl添加量從1%增加到2%，α-螺旋含量降低（P＞0.05），β-折疊含量增加，而β-轉角和無規卷曲的相對含量差異不顯著（P＞0.05）。NaCl從2%升高到3%，α-螺旋、β-折疊、β-轉角和無規卷曲的相對含量差異不顯著（P＞0.05）。Kang Zhuangli等[9]發現提高豬肉糜中NaCl添加量，β-折疊相對含量有升高的趨勢。NaCl增加促進α-螺旋結構解折疊，形成β-折疊結構。而β-折疊結構是蛋白質集聚和形成良好凝膠的基礎結構，增加肉糜體系中β-折疊的含量，有助于改善肉制品的質構特性和保水性[28-29]。

表3 不同NaCl添加量豬肉糜蛋白質二級結構相對含量的變化Table 3 Effect of NaCl addition on the secondary structure contents of proteins in pork meat batters%

2.4.2 水分子結構

圖3 不同NaCl添加量豬肉糜的拉曼光譜（3 100～3 500 cm－1）Fig. 3 Raman spectra of pork meat batters with various amounts of NaCl in the region of 3 100–3 500 cm-1

拉曼光譜能提供肉糜體系中水分子變化的信息。拉曼光譜中3 100～3 500 cm-1之間的條帶被指認為—OH基團的伸縮振動，能夠反映水分子內氫鍵的振動[23]。如圖3所示，與添加1% NaCl的豬肉糜相比，隨著NaCl添加量的增加，峰值逐步向高波數方向移動，T1、T2和T3的峰值分別位于3 224、3 226 cm-1和3 227 cm-1。峰值向高波數方向移動，表明水分子內形成更多的氫鍵，氫鍵作用力更大[30]。增加NaCl，促使蛋白質中氨基酸側鏈的親水基團暴露并與水分子結合，加強蛋白質與水分子間的交聯，使這部分水分的T2延長（表1）。另外，由于形成較多的氫鍵能夠誘導蛋白二級結構中的β-折疊相對含量增加，因此，提高NaCl添加量，也能促使α-螺旋結構的解折疊，形成β-折疊結構（表3），在加熱過程中形成良好的凝膠結構，提高豬肉糜的蒸煮得率和硬度（圖1和表2）。

3 結 論

隨著NaCl添加量的增加，豬肉糜蒸煮得率和硬度顯著提高。LF-NMR結果表明高NaCl添加量的豬肉糜中不易流動水含量較高，有較好的保水性。拉曼光譜結果表明NaCl從1%提高到2%，α-螺旋結構相對含量降低，β-折疊相對含量增加，而NaCl添加量從2%提高到3%，二級結構含量變化不明顯。NaCl添加量從1%增加至3%，3 100～3 500 cm-1之間的波峰向高波數方向移動，水分子內氫鍵增多，蛋白質和水分子之間的相互作用增強，誘導α-螺旋結構解折疊，形成β-折疊結構。

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Effect of NaCl on Processing Characteristics and Protein Secondary Structures in Pork Meat Batters

LI Ke1, ZHAO Yingying1, KANG Zhuangli2,*, WANG Huhu3, MA Hanjun2, XU Xinglian3
(1. Henan Province Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety, College of Food and Bioengineering, Zhengzhou University of Light Industry, Zhengzhou 450001, China; 2. Henan Province Collaborative Innovation Center for Food Production and Safety, School of Food Science, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China; 3. National Center of Meat Quality and Safety Control, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

NaCl is an essential auxiliary material for processing of minced pork products. In this paper, in order to further conf i rm the role of NaCl in this regard, low fi eld nuclear magnetic resonance and Raman spectroscopy were used to explore the effect of NaCl on cooking yield, hardness, water migration and protein secondary structures in pork batters. The results showed that cooking yield and hardness were signif i cantly (P ＜ 0.05) improved, T2band T22relaxation times became shorter, and the peak ratio of T21(bound water) was increased with the increase in NaCl concentration. Raman spectroscopy indicated that β-sheet content was increased with increasing NaCl concentration from 1% to 2%, while the secondary structure composition was not signif i cantly changed (P ＞ 0.05) with further increase in NaCl concentration up to 3%. With the increase in NaCl concentration, the—OH stretching vibration was shifted to high wavenumbers (3 226 and 3 227 cm-1), and the number of hydrogen bonds in a water molecule was increased. Overall, the addition of a proper amount of NaCl could change the secondary structure of pork proteins and enhance protein hydration, thereby helping improve processing properties of pork batter.

Raman spectroscopy; low field nuclear magnetic resonance (LF-NMR); water holding capacity; secondary structure; water structure

10.7506/spkx1002-6630-201715013

TS251.1

A

1002-6630（2017）15-0077-05

李可, 趙穎穎, 康壯麗, 等. NaCl對豬肉糜加工特性和蛋白質二級結構的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(15): 77-81. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715013. http://www.spkx.net.cn

LI Ke, ZHAO Yingying, KANG Zhuangli, et al. Effect of NaCl on processing characteristics and protein secondary structures in pork meat batters[J]. Food Science, 2017, 38(15): 77-81. (in Chinese with English abstract)

10.7506/ spkx1002-6630-201715013. http://www.spkx.net.cn

2016-06-24

國家自然科學基金青年科學基金項目（31501508；31601492）；河南省高校科技創新團隊支持計劃項目（13IRTSTHN006）；河南省高等學校重點科研項目（16A550006）

李可（1986—），男，講師，博士，研究方向為肉品加工與質量安全控制。E-mail：xc_like@163.com

*通信作者：康壯麗（1980—），男，講師，博士，研究方向為肉品加工與質量安全控制。E-mail：kzlnj1988@163.com