復合酶法改性制備乳清分離蛋白可溶性聚合物的性質

于國萍，齊微微，藏小丹，郭佩佩，王艷菲，陳 超，孫 琪

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

復合酶法改性制備乳清分離蛋白可溶性聚合物的性質

于國萍，齊微微，藏小丹，郭佩佩，王艷菲，陳 超，孫 琪

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

為探究胰凝乳蛋白酶與谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TGase）復合酶法改性制備乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）可溶性聚合物的性質，本實驗利用電泳、熒光分光光度計和旋轉流變儀等對可溶性聚合物的性質進行對比分析。結果表明：復合酶改性制得的聚合物與單一TGase改性相比，黏度增大，游離巰基含量顯著降低，但表面疏水性和ζ-電位無顯著變化。復合酶改性聚合物平均粒徑是（153.66±9.15） μm，而TGase改性聚合物平均粒徑是（157.92±10.91） μm，沒有顯著差異。通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對比分析得出，單獨的TGase改性聚合物分子質量較大，被截留在凝膠加樣口，而復合酶改性聚合物分子質量更多的集中在65 kD附近，即聚合物分子大小適中，這與粒徑的結果相呼應。胰凝乳蛋白酶和TGase復合改性聚合物表面呈波紋片狀，結構均一緊致。與未改性的WPI相比，復合酶改性WPI聚合物pH值溶解性曲線在pH 2.0～7.0范圍變化較平緩，且在pH 4.0～5.0時溶解性提高。此研究結果為復合酶法改性WPI在酸乳或酸性乳飲料方面的應用提供了理論依據與技術參考。

乳清分離蛋白；可溶性聚合物；胰凝乳蛋白酶；谷氨酰胺轉氨酶

乳清蛋白可溶性聚合物[1]為介于蛋白單體與不可溶性凝膠網絡結構或沉淀的一種中間狀態，也稱為溶膠或可流動的凝膠。乳清蛋白經過改性制得可溶性聚合物（soluble aggregates，SA），改善并拓展了乳清蛋白在起泡[2]、乳化[3]、凝膠[4]、成膜和包埋[5]等方面的應用。正因為SA具有多樣的結構和理化的性質，其在食品中的應用相當廣泛。

酶法改性制備可溶性聚合物主要涉及兩類酶：蛋白水解酶和交聯酶。蛋白水解酶通過類蛋白反應，改變蛋白的二級和三級結構，由此改變表面暴露的活性氨基酸，這些活性基團可以促進分子間的相互作用，有助于蛋白聚合[6]，生成沉淀、觸變膠體或具有良好流變學性質黏稠的可溶性聚合物[7-8]。交聯酶主要為微生物谷氨酰胺轉氨酶（transglutaminase，TGase），TGase催化蛋白質分子間或分子內的肽段之間形成ε-（γ-谷氨酰）賴氨酸共價鍵[9]。近年來，關于蛋白酶和TGase復合改性蛋白的研究較多[10-11]，王凱強等[11]先利用胰蛋白酶水解小麥面筋蛋白，能暴露出更多谷氨酰胺殘基供與TGase，致水化小麥面筋蛋白形成更為多孔且致密的小麥面筋蛋白網絡結構，但是過度的酶解將不利于TGase的交聯反應。所以可以利用蛋白水解酶和交聯酶同時作用于乳清蛋白，用以進一步形成高黏度穩定型的聚合物。

本實驗以乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）為研究對象，在已有的對多種酶篩選的基礎上，確定將胰凝乳蛋白酶與TGase復合酶法改性WPI制備可溶性聚合物，以獲得高凝膠穩定型酶法復合改性WPI聚合物，產品可作為具有增稠、穩定、凝固作用的蛋白源的食品添加劑，以替代價格昂貴的果膠或其他非蛋白源食用膠，應用于酸乳與乳酸飲料中，既可以提高WPI的使用價值，拓寬酶的應用，也為酶法改性WPI提供新的理論依據，為可溶性聚合物的形成提高新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

WPI（蛋白質含量90.90%） 新西蘭Fonterra公司；TGase（酶活力為100 U/g） 泰興市一鳴生物制品有限公司；胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin type Ⅱ，酶活力為5.65×105U/g） 北京博奧拓達科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

pHS-3C型精密pH計 上海雷磁儀器廠；NDJ-5S旋轉黏度計 上海精密科學儀器有限公司；TA-XT2 Plus物性測定儀 英國Stable Micro System公司；Mastersizer-2000型激光粒度分析儀、ζ-電位分析儀英國Malvern公司；S-3400N掃描電子顯微鏡、F-4500熒光分光光度計 日本日立公司；Mini-PROTEAN Tetra Cell電泳儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 酶法改性WPI

以未改性WPI為對照組（記為未改性組），進行以下5 種改性處理：pH 8堿改性條件下進行（記為堿改性組）；pH 8、85 ℃、5 min條件下熱改性（記為熱改性組）；pH 8、85 ℃、5 min條件下預熱，5 U/g TGase，50 ℃加熱60 min，再85 ℃、5 min酶滅活（記為TGase改性組）；pH 8條件下胰凝乳蛋白酶添加量為0.01%，再85 ℃、5 min酶滅活（記為水解改性組）；pH 8條件下5 U/g TGase、0.01%胰凝乳蛋白酶雙酶復合改性（記為復合酶改性組）。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 可溶性聚合物黏度的測定

可溶性聚合物的制備參照前期實驗齊微微[12]的方法，將可溶性聚合物冷卻至室溫，利用旋轉黏度計測定其黏度。

1.3.2.2 可溶性聚合物濁度的測定

樣品測定完黏度之后，立即測定其濁度值，根據David等[13]的方法，略有改動。樣品原液測定，不用稀釋，通過紫外分光光度計，在420 nm波長處測定吸光度A420nm。

1.3.2.3 可溶性聚合物游離巰基含量的測定

樣品中游離巰基含量的測定方法參照Beveridge等[14]，并有所改動。取5 mL Tris-Gly緩沖溶液加入到0.06 mL的WPI聚合物溶液中，然后在向其中加入20 μL的5,5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-(2-nitrobenzoic acid)，DTNB）試劑，振蕩混勻，在室溫條件下靜止15 min，利用紫外分光光度計在412 nm波長處測定吸光度，將0.06 mL去離子水替換樣品溶液，再加5 mL的緩沖液和20 μL的DTNB試劑做空白調零。以下式計算游離巰基含量。

式中：A412nm為在412 nm波長處的吸光度，計算時取其平均值；ρ為固形物含量/（mg/mL）；D為稀釋系數。

1.3.2.4 可溶性聚合物表面疏水性的測定

參照Hayakawa等[15]的測定方法，并加以改進，用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.7）將樣品溶液稀釋，稀釋5 個質量濃度從0.002 g/100 mL到0.010 g/100 mL。取樣5 mL，然后加入20 μL的ANS熒光探針，測得的熒光強度對蛋白溶液質量濃度作圖，線性關系良好的回歸線的斜率作為蛋白質表面的疏水性指數。測定的條件：樣品混勻后在室溫條件下避光15 min，激發波長390 nm，發射波長470 nm，狹縫5 nm。

1.3.2.5 可溶性聚合物pH值溶解性的測定

pH值溶解性的測定根據Zhu Haiming等[16]的方法。用0.5 mol/L的HCl或NaOH溶液調節pH值，pH值的變化范圍為2.0～7.0，利用紫外分光光度計在500 nm的波長下測定樣品不同pH值條件的吸光度。

1.3.2.6 可溶性聚合物粒徑大小及分布的測定

利用Mastersizer-2000激光粒度儀進行粒徑分布的測定。

1.3.2.7 可溶性聚合物ζ-電位的測定

采用ζ-電位分析儀測定不同處理樣品的ζ-電位。

1.3.3 可溶性聚合物十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）按照Laemmli[17]實驗方法加以改進，分離膠質量濃度為12 g/100 mL、濃縮膠質量濃度為5 g/100 mL。樣品緩沖液（含有5%巰基乙醇和2% SDS）和樣品溶液直接混合（體積比為1∶1）電泳前煮沸3 min。取5 μL該混合液上樣，濃縮膠電壓為60 V，分離膠電壓為90 V。之后用0.1%的考馬斯亮藍染色。最后脫色，分析組分的差異。非變性聚丙烯酰胺凝膠（Native-PAGE）制膠時不加SDS，樣品緩沖液中也不加入巰基乙醇和SDS，其他操作與SDS-PAGE相同。

1.3.4 可溶性聚合物掃描電子顯微鏡觀察

電子顯微鏡掃描分析參考Helen等[18]方法。

1.4 數據統計分析

實驗數據均使用SPSS 18.0軟件進行統計分析，所用數據均為3 次的平均數，單因素方差分析（ANOVA）中采用Duncan檢驗。作圖采用Sigma Plot 9.0軟件。

2 結果與分析

2.1 不同改性條件制得WPI聚合物的黏度和濁度

圖1 不同改性條件下WPI聚合物的黏度和濁度Fig. 1 Viscosity and turbidity of differently modif i ed aggregates

由圖1可知，與未改性的WPI相比（柱1），85 ℃、5 min熱改性（柱2）聚合物與胰凝乳蛋白酶限制性水解改性（柱4）聚合物黏度變化不顯著，即表明單一的水解WPI改性與85 ℃、5 min熱改性不能提高WPI的黏度。而在熱改性的基礎上添加5 U/g的TGase，50 ℃加熱60 min聚合物的黏度顯著提高（柱3）。胰凝乳蛋白酶和TGase復合改性WPI制得聚合物黏度（柱5）與單一TGase改性相比，顯著提高。

從圖1可以看出，WPI通過不同條件的處理，所得產物的濁度顯著降低，但不同改性方法對濁度的影響無顯著變化，未改性的WPI濁度最大。這與David等[13]利用枯草桿菌蛋白酶（subtilisin）和堿性蛋白酶（alcalase）等酶水解WPI研究其聚合行為，濁度的變化一致。本研究發現，黏度與濁度并未呈正相關的關系。

2.2 不同改性條件制得可溶性聚合物電泳分析

圖2不同改性條件制得可溶性聚合物PAGE圖譜Fig. 2 PAGE prof i les of soluble aggregates with different modif i cations

圖2 a泳道1表明WPI的3 條主要條帶為α-乳清蛋白、β-乳球蛋白和牛血清白蛋白，分子質量分別約為14、18 kD和67 kD。圖2a除了未改性的WPI，其余4 條泳道在加樣口均有高分子聚合物，不能進入分離膠，說明熱改性、TGase改性、水解改性和復合酶改性WPI都發生了聚合反應，這是由于每一種改性都有85 ℃、5 min的熱變性，也說明熱處理對WPI聚合的影響非常顯著。泳道3和5的BSA條帶變淡或消失，同時產生了新的亞基，說明TGase改性蛋白交聯聚合，而且復合改性新產生的條帶更多。α-乳清蛋白條帶變淺，部分α-乳清蛋白參與聚合，而β-乳球蛋白條帶變淡不明顯，說明與β-乳球蛋白相比，α-乳清蛋白更利于TGase交聯，這與Srinivasan等[19]的研究是一致的。

圖2b更清晰地顯示了各種改性條件對WPI聚合的影響。SDS-PAGE和Native-PAGE對比表明聚合時分子間二硫鍵的作用的重要性。泳道3和5中β-乳球蛋白和α-乳清蛋白條帶均變淺，且泳道3條帶更淺一些，說明單獨的TGase改性導致更多的β-乳球蛋白和α-乳清蛋白聚合。分子質量在65 kD左右胰凝乳蛋白酶和TGase復合改性產生條帶顏色更深一些，即產生分子質量適中的聚合物較多。通過兩者對比分析得出，單獨的TGase改性聚合物分子質量較大，分子質量較大的被截留在加樣口，而復合酶改性聚合物分子質量更多地集中在65 kD附近。

2.3 不同改性處理制得可溶性聚合物粒徑分析

未改性WPI平均粒徑（27.05±0.89） μm，胰凝乳蛋白酶水解改性平均粒徑減小到（19.14±0.51） μm，TGase改性聚合物為（157.92±10.91） μm，酶復合改性聚合物粒徑為（153.66±9.15） μm，小于TGase改性，這與電泳圖譜的結果一致。利用TGase改性和酶復合改性的粒徑大小與Nicolai等[20]研究β-乳球蛋白的聚合模型，形成的可溶性聚合物的大小在15～150 nm類似。

圖3 不同改性條件制得可溶性聚合物的粒度分布比較Fig. 3 Particle size distribution of soluble aggregates with different modif i cations

從圖3可以看出，未改性WPI、堿改性、熱改性和胰凝乳蛋白酶水解改性的聚合物粒徑分布曲線相似，而TGase改性和復合酶改性的粒徑分布曲線相似，在1 μm處體積分數減小，在100 μm處增大。

2.4 不同改性處理制得可溶性聚合物在不同pH值條件下溶解性的變化

圖4表明了不同的改性條件對產物在pH 2.0～7.0范圍內溶解性的影響。吸光度越小，表明聚合物的溶解性越好。Cheison等[21]研究了pH值對β-乳球蛋白結構的影響，當pH值大于7.5或小于2.0時，β-乳球蛋白以單聚體形式存在；當pH值在2.0～3.7和5.1～7.5時，β-乳球蛋白為二聚體；而pH值在3.7～5.1之間時，β-乳球蛋白形成八聚體。β-乳球蛋白為WPI的主要組成成分，因此本實驗未改性的WPI的溶解度的變化可以用Cheison等[21]的研究解釋，在pH 2.0～3.2和5.1～7.0，聚合物主要以二聚體形式存在，溶解性高，而在pH 3.7～5.1時，八聚體存在，溶解度低。

圖4 不同改性條件對聚合物在不同pH值條件下溶解性的影響Fig. 4 pH solubility profiles of aggregates with different modifications

當pH值調節到4.0時，聚合物的顏色由透明變成不透明的純白色，此時的吸光度最大，溶解性最差。TGase改性的WPI在pH 4.0～5.0有最大吸光度，這可能是交聯反應導致賴氨酸殘基的ε-氨基酸減少，改變了蛋白表面的疏水親水比率，導致在等電點處的大量沉淀。復合改性的WPI在pH 2.0～7.0范圍為吸光度變化較平緩，且在pH 4.0～5.0時，吸光度低于TGase改性的WPI聚合物，即溶解性提高，溶解性越高，在體系中不易沉淀。說明在偏酸環境溶解性較高，更適于應用酸乳或酸性乳飲料中。

2.5 不同改性處理制得可溶性聚合物游離巰基含量的變化

圖5 不同改性條件制得可溶性聚合物游離巰基含量的變化Fig. 5 Free sulfhydrylcontents of aggregates with different modifications

由圖5可知，自然狀態下的WPI游離巰基含量最高，WPI經過一定溫度的熱處理，其游離巰基含量顯著的降低，這可能是由于蛋白質在熱處理過程中，蛋白質結構打開，游離巰基暴露并形成分子間二硫鍵或分子內二硫鍵所致[22]。Vardhanabhuti等[23]用8 mol/L的尿素或DTT作用于初級聚合物，佐證二硫鍵的確在這一階段聚合物的形成起作用。所以熱處理WPI的游離巰基降低。

與熱改性相比，胰凝乳蛋白酶改性的聚合物游離巰基含量提高，這可能是由于極低限制性酶解改變了蛋白的二級結構，限制了游離巰基向二硫鍵轉變亦或打開部分二硫鍵。與單獨TGase改性相比，胰凝乳蛋白酶和TGase復合改性的游離巰基含量降低，這可能由于胰凝乳蛋白酶的作用，促進了TGase對WPI的交聯，進而降低了游離巰基的含量。

2.6 不同改性處理制得可溶性聚合物表面疏水性的變化

圖6 不同改性條件對可溶性聚合物表面疏水性的影響Fig. 6 Effect of different modif i cation conditions on surface hydrophobicity of soluble aggregates

分子間的疏水相互作用是促進聚合的主要非共價作用力之一。加熱促進蛋白粒子展開，大量疏水基團暴露，如圖6所示，85 ℃、5 min熱改性顯著提高了WPI的表面疏水性。而TGase改性制得聚合物的表面疏水性降低，這是由于TGase改性，制得聚合物結構更緊密，使部分疏水性的區域被掩埋導致的。所以，胰凝乳蛋白酶作用使聚集的蛋白結構打開，與熱改性相比，表面疏水性增大。酶復合改性的聚合物的表面疏水性介于TGase改性和胰凝乳蛋白酶改性，但變化差異不顯著。

2.7 不同改性處理制得可溶性聚合物ζ-電位的變化

圖7 不同改性條件制得可溶性聚合物的電位的變化Fig. 7 Change inζ-of soluble aggregates with different modif i cations

ζ-電位是揭示膠體分散體系是否穩定的重要指標[24]。ζ-電位測定的是分子表面的所有電荷，不論是正電荷還是負電荷，ζ-電位越大，表明分子間靜電排斥力越強越有利于聚合，盡管沒有確切的數據說明，但推測出較低的表面疏水性和較高的負ζ-電位有利于膠體的穩定[25]。從圖7可以看出，未改性的WPI溶液帶負電荷，在各個改性條件下，蛋白帶有的負電荷有所增加，但改變pH值和加熱改性對ζ-電位的變化影響不顯著。Ladan等[26]研究了胰凝乳蛋白酶對WPI水解過程ζ-電位的變化，研究表明未水解的WPI和熱處理組的WPI的ζ-電位無顯著變化，與本實驗結果相符。TGase參與改性顯著提高了聚合物的ζ-電位，未改性WPI的ζ-電位為-（13.00±1.74）mV，TGase參與改性后WPI聚合物ζ-電位降低到-（22.26±1.74） mV和-（19.27±3.22） mV，且單獨的TGase改性高于復合酶改性的ζ-電位，但是變化不顯著。這可能是由于蛋白酶的初步改性，使底物的結構變得松散，隱藏在內部的帶電基團有所暴露，ζ-電位有所增加，同時依據谷氨酰胺轉胺酶作用機理，它催化（γ-谷氨酰）賴氨酸共價鍵形成，使底物中的賴氨酸的ε-氨基參與反應，正電性減少，進一步導致負電性增加。Donato等[27]的研究表明，可溶性聚合物的ζ-電位約在-45～-25 mV范圍內。通過對比分析，胰凝乳蛋白酶限制性水解改性提高了聚合物的ζ-電位，但變化不顯著。

2.8 不同改性處理制得可溶性聚合物微觀結構分析

圖8 不同改性條件制得聚合物的掃描電子顯微鏡結果Fig. 8 Scanning electron micrographs of aggregates with different modif i cations

未改性的WPI和pH 8的WPI冷藏24 h后仍為液體，未形成凝膠沒有測定其微觀結構。熱改性及胰凝乳蛋白酶改性制得聚合物形成淡棕色，透明的半固體凝膠；TGase改性和復合酶改性制得聚合物形成淡棕色、透明、有彈性的固體凝膠。有研究表明凝膠形成的不透明性與凝膠的微觀結構有較大關系，即不透光凝膠為顆粒結構，而半透明凝膠為絲狀結構。85 ℃、5 min熱改性的聚合物表面呈波浪狀（圖8A1），放大倍數到4 000 倍時觀察，結構致密，表面粗糙，有大小不一的顆粒浮于表面（圖8B1）。TGase改性的聚合物呈片狀長線型不規則性，表面光滑，這有利于黏度的增大。胰凝乳蛋白酶水解改性制得聚合物結構較松散，表面不光滑，圖8A3、B3與B1相比較，顆粒變小，表面較平整，這是由于酶解作用，裂解了蛋白肽鏈，蛋白分子質量變小，聚合度降低，所以結構較松散。胰凝乳蛋白酶和TGase復合改性聚合物表面呈波紋片狀，與單獨的TGase改性相比，通過復合酶改性產生更多分子質量適中的聚合物，所以聚合物結構邊緣更圓潤、寬厚，表面圓滑，放大4 000 倍時觀察，結構均一緊致。較厚和較光滑的結構表明蛋白間的相互作用提高，結構更穩定[28]。

3 結 論

酶復合改性制得的聚合物與單一TGase改性相比，黏度增大，游離巰基含量顯著降低，但表面疏水性和ζ-電位無顯著變化。通過SDS-PAGE和Native-PAGE對比分析得出，單獨的TGase改性聚合物分子質量較大，分子質量較大的被截留在加樣口，而復合酶改性聚合物分子質量更多地集中在65 kD附近，即聚合物分子大小適中，這與粒徑的結果相呼應。胰凝乳蛋白酶和TGase復合改性聚合物表面呈波紋片狀，結構均一緊致。與未改性的WPI相比，改性制得的WPI聚合物濁度顯著降低，pH值溶解性曲線在pH 2.0～7.0范圍為變化較平緩，且在pH 4.0～5.0時，溶解性提高。為酶法復合改性WPI聚合物在酸乳或酸性乳飲料方面的應用提供理論依據與技術參考。

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Properties of Soluble Aggregates Prepared from Whey Protein Isolate Modif i ed by Mixed Enzymes

YU Guoping, QI Weiwei, ZANG Xiaodan, GUO Peipei, WANG Yanfei, CHEN Chao, SUN Qi
(College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)

This study was aimed to explore the properties of soluble aggregates from whey protein isolate (WPI) modif i ed with mixed chymotrypsin and transglutaminase (TGase) using electrophoresis, a fluorescence spectrophotometer and a rotational rheometer. The results showed that the viscosity of protein aggregates modif i ed by mixed enzymes was higher, and the content of free sulfhydryl groups was signif i cantly decreased; however, the surface hydrophobicity and ζ-potential did not change signif i cantly when compared with single TGase modif i cation. The average particle size of mixed enzymemodif i ed aggregates was (153.66 ± 9.15) μm, while that of TGase-modif i ed aggregates was (157.92 ± 10.91) μm, suggesting no signif i cant difference. Comparative analysis using SDS-PAGE and Native-PAGE showed that single TGase-modif i ed aggregates had higher molecular weight, and was trapped at the injection port; in contrast, the molecular weight of aggregates modif i ed by mixed enzymes was moderate, mostly distributed around 65 kD, which was coincided with the particle size distribution. The surface of aggregates modified by both enzymes showed a corrugated shape with structural uniformity. The solubility curve of mixed enzyme-modified WPI aggregates in the range of pH 2.0–7.0 was gentle, while the solubility was increased at pH 4.0–5.0 when compared with the unmodif i ed whey protein. The results in this study may provide a theoretical basis and technical reference for applying enzymatically modif i ed WPI in yogurt and fermented dairy beverage.

whey protein; soluble aggregates; chymotrypsin; transglutaminase(TGase)

10.7506/spkx1002-6630-201715015

TS201.2

A

1002-6630（2017）15-0089-06

于國萍, 齊微微, 藏小丹, 等. 復合酶法改性制備乳清分離蛋白可溶性聚合物的性質[J]. 食品科學, 2017, 38(15): 89-94.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201715015. http://www.spkx.net.cn

YU Guoping, QI Weiwei, ZANG Xiaodan, et al. Properties of soluble aggregates prepared from whey protein isolate modified by mixed enzymes[J]. Food Science, 2017, 38(15): 89-94. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201715015. http://www.spkx.net.cn

2016-06-29

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2013BAD18B07-03）

于國萍（1963—），女，教授，博士，研究方向為農產品精深加工。E-mail：yuguopingneau@hotmail.com