海蜇傘部酶促溶性膠原蛋白的熱變性動力學

孫 睿，王煦松，秦 磊,2,*，張玉瑩，徐獻兵,2，杜 明,2，董秀萍,2，李冬梅,2

（1.大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

海蜇傘部酶促溶性膠原蛋白的熱變性動力學

孫 睿1，王煦松1，秦 磊1,2,*，張玉瑩1，徐獻兵1,2，杜 明1,2，董秀萍1,2，李冬梅1,2

（1.大連工業大學食品學院，遼寧 大連 116034；2.國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧 大連 116034）

為闡明海蜇傘部酶促溶性膠原蛋白（pepsin-solubilized collagen，PSC）的熱變性反應機理，以保持完整三螺旋結構的PSC為研究對象，通過微量熱儀測定不同升溫速率條件下PSC的變性溫度，以及采用34、35、36、37、38、39 ℃加熱不同時間后的PSC殘存率，并進行熱變性動力學分析。結果表明，海蜇傘部PSC對熱變化敏感，隨著加熱溫度升高，單位時間內提高的熱量增加，使海蜇傘部PSC變性速率加快，完成變性時間縮短；隨著升溫速率的減慢，吸熱峰逐漸向低溫區移動，即變性溫度隨升溫速率的減慢而降低，但升溫速率的變化對反應熱并無顯著影響。反應級數為0.9的回歸方程能夠較好地描述PSC熱變性過程，在恒溫34、35、36、37、38 ℃及39 ℃的條件下，PSC變性的D90值（90%蛋白變性所需時間）分別為53.76、26.11、15.75、4.89、4.26、2.55 min，Z90值（D值降低90%的溫度變化）為3.69 ℃，表觀活化能為481.90 kJ/mol。研究結果可為海蜇膠原蛋白的進一步開發利用提供理論參考。

海蜇；膠原蛋白；熱變性；動力學

海蜇（Rhopilema esculentum）屬于缽水母綱、根口水母目、根口水母科、海蜇屬，廣布于我國南北各海中，產量豐富，但高值化利用率低。研究表明，海蜇傘部干基中以膠原蛋白為主的蛋白類物質含量很高，是一個富有利用價值的潛在膠原蛋白源。膠原是由3 條肽鏈組成的螺旋形纖維狀細胞外基質的結構蛋白質[1]，主要含有脯氨酸、羥氨酸、羥賴氨酸、羥脯氨酸等[2-3]。與其他蛋白相比，其結構和組成的特殊性，使其能夠廣泛應用于生物醫學材料、藥物輸送載體、組織工程、化妝品和食品等領域[4]。

膠原分子均是依靠氫鍵等非共價鍵維持其三股螺旋構象[5-6]，當膠原分子從外界吸收足夠多的熱量后，這些非共價鍵就會遭到破壞，膠原的三股螺旋構象會隨之改變為無規卷曲構象[7]。Weir[8]研究了熱變性導致的膠原纖維收縮過程，發現膠原的熱收縮過程符合一級動力學方程，且反應的速率常數與溫度的關系滿足Arrhenius方程。Miles等[9-10]進行了一系列有關膠原熱變性的相關研究，也認為膠原熱變性是一個不可逆的速率過程，且符合一級反應動力學。經過后期研究表明，膠原熱變性首先從缺失羥脯氨酸的氨基酸序列片段開始，將該段氨基酸序列稱為熱不穩定區域。為了進一步探討膠原的熱變性機理，Persikov等[11]以膠原多肽為研究對象，通過變換各種實驗條件（如升溫速率、樣品濃度等），研究了膠原多肽從三股螺旋構象到無規卷曲構象的轉變過程，結果表明構象轉變是一個動力學過程而不是平衡過程，且絕大多數情況下不可逆。Liu Wentao等[12]采用等轉化率法研究了溶液中Ⅰ型牛皮膠原的熱變性過程，結果發現活化能隨膠原熱變性的進行而逐漸下降。

發生熱變性的膠原其低抗原性等優良特性都將消失，因而在實際應用中如何確保膠原的三股螺旋結構與生物學性能不發生改變顯得尤為重要。隨著人們對膠原進一步的了解、開發和利用，對膠原的熱穩定性的研究也更加深入。熱變性動力學是研究膠原穩定性的重要組成部分，是生物材料進行實際應用的基本原理。海蜇傘部酶促溶性膠原蛋白（pepsin-solubilized collagen，PSC），是經過胃蛋白酶酶解提取得到的純度較高且結構完整性較好的膠原蛋白。本實驗對PSC熱變性動力學，即熱變性反應機理進行研究，進一步解釋膠原在熱處理過程中的變化，以期為海蜇活性膠原蛋白的開發利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮海蜇（Rhopilema esculentum）捕撈于遼寧營口遼東灣海域，將傘部割下，海水洗凈，加冰于當日運回實驗室，-80 ℃冷凍保存。

胃蛋白酶、氯化鈉 上海生工生物工程有限公司；氫氧化鈉 天津東麗區天大化學試劑廠；乙酸 天津市恒興化學試劑制造有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉天津市大茂化學試劑廠；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Micro DSC III微量熱儀 法國塞塔拉姆公司；Z323K冷凍離心機 德國哈默公司；98-2強磁力攪拌器鞏義市予華儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 海蜇傘部PSC的制備

取冷凍海蜇傘部，解凍后切塊，加等量去離子水，勻漿。9 320 r/min離心10 min棄去上清液。向沉淀加入去離子水攪拌30 min后9 320 r/min離心10 min，重復水洗，至上清液透明。向所得沉淀按料液比（1∶500，m/V）加入0.1 mol/L NaOH溶液，攪拌24 h。9 320 r/min離心10 min，沉淀加入去離子水反復洗滌至中性。將所得沉淀稱質量后溶于0.5 mol/L乙酸溶液（1∶500，m/V），以干物質質量1%計算，加入胃蛋白酶（酶活力為13 274 U/g，酶量為干物質質量的10%），攪拌72 h。9 320 r/min離心30 min，取上清液，向上清液中緩慢加入4 mol/L NaCl溶液，直至NaCl濃度為1.2 mol/L，攪拌20 min，靜置過夜。9 360 r/min離心5 min取沉淀。將沉淀溶于少量0.5 mol/L乙酸中，攪拌至完全溶解。將其裝入透析袋中，置于0.02 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4（pH 8.0）透析液中透析48 h，9 630 r/min離心20 min取沉淀。將沉淀溶于少量0.1 mol/L乙酸，并采用0.1 mol/L乙酸溶液透析48 h，再用去離子水透析72 h。取出冷凍干燥后得到PSC。以上所有操作除特殊注明外，均在4 ℃條件下進行[13-16]。

1.3.2 海蜇傘部PSC變性溫度的測定

稱取凍干后的海蜇傘部PSC樣品，用去離子水配制成10 mg/mL溶液，使其充分溶解，離心排除氣泡，靜置過夜。以等量去離子水做參比，應用Micro DSC III微量熱儀對其變性溫度進行測定，升溫區間為5～80 ℃，升溫速率分別為1.00、0.50、0.10、0.01 ℃/min。

1.3.3 加熱后海蜇傘部PSC殘存率的測定

稱取凍干后的海蜇傘部PSC樣品，用去離子水配制成10 mg/mL溶液，使其充分溶解，離心排除氣泡，靜置過夜。取300 μL配制樣品于差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）樣品池中，以等量去離子水做參比。以未加熱樣品測定反應熱為空白，34 ℃條件下加熱5、10、15、20、25、30、35 min，35 ℃條件下加熱5、10、13、15、20、25、30 min，36 ℃條件下加熱2、5、8、10、12、13、15 min，37 ℃條件下加熱0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0 min，38 ℃條件下加熱1、2、3、4、5、6、7 min，39 ℃條件下加熱0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0 min。樣品加熱后置于冰浴中快速冷卻5 min，應用微量熱儀對其反應熱進行測定，測量的溫度范圍為0～60 ℃，升溫速率為1 ℃/min。不同溫度條件下熱處理不同時間的殘存率計算見式（1）。

式中：A為加熱0 min空白組反應熱/（J/g）；B為不同溫度條件下不同時間的反應熱/（J/g）。

1.3.4 海蜇傘部PSC熱變性動力學分析

1.3.4.1 熱變性方程反應級數及變性速率常數的確定

海蜇傘部PSC熱變性過程的速率方程可用式（2）表示。

式中：-dC/dt為變性速率；C為任意時間下的未變性膠原蛋白含量；k為變性速率常數；n為反應級數。

當n≠1時，對式（2）取對數，得-ln（dC/dt）=ln k+ nln C，積分后得：（Ct/C0）1－n=1+（n-1）kC0n-1t，設k’=kC0

n－1，則上式變化為式（3）。

當n=1時，則有：

取n=0.0、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0，依據式（3）作（Ct/C0）1－n-t圖；取n=1時，依據式（4）作ln（Ct/C0）-t圖，求得不同溫度條件下回歸方程的相關系數及最大相關系數下反應級數n對應的回歸方程。根據回歸方程的斜率求得不同溫度條件下變性速率常數。

1.3.4.2 熱變性過程中表觀活化能的確定

在熱變性過程中，變性速率常數（k）與溫度的關系可以采用Arrhenius方程表示。

式中：A為Arrhenius常數；Ea為表觀活化能/（kJ/mol）；R為氣體常數8.314 510 J/（mol·K）；T為絕對溫度/K。

對上式兩邊取對數，得：ln k=ln A-Ea/RT，即ln k-1/T應為直線，根據斜率計算出海蜇PSC熱變性過程中的表觀活化能Ea。

1.3.4.3 熱變性過程中D90值與Z90值的確定

D90值指在恒定溫度下90%膠原蛋白變性所需時間，通過lg Ct對t作圖求得（回歸方程斜率的倒數值）。Z90值指D90值降低90%的溫度變化，體現了溫度對D90值的影響，通過lg D90T（D90T為T溫度條件下的D90值）對T作圖求得（回歸方程斜率的倒數值）[17]。

2 結果與分析

2.1 不同升溫速率對海蜇傘部PSC變性溫度的影響

圖1 不同升溫速率條件下海蜇傘部PSC的DSC結果Fig. 1 DSC curves of PSC from jellyf i sh umbrella at different heating rates

表1 不同升溫速率下海蜇傘部PSC熱力學參數分析Table 1 Thermodynamic parameters of PSC from jellyf i sh umbrella at different heating rates

不同升溫速率對海蜇傘部PSC變性溫度的影響如圖1與表1所示，隨著升溫速率的減小，吸熱峰逐漸向低溫區移動，即變性溫度隨升溫速率的減小而降低，然而升溫速率對反應熱的影響未出現明顯變化。實驗過程中，升溫速率為1.00 K/min和0.50 K/min時，在低溫區間，膠原的熱變性速率很低，且持續時間較短，此時熱容變化很小，DSC的基線很平；當升溫速率降低至0.10 K/min和0.01 K/min時，膠原仍保持很低的熱變性速率，但持續時間過長，此時膠原變性的數量增多，熱容變化能夠被儀器檢測到，基線較早發生漂移。當溫度逐漸升高，不同升溫速率條件下的膠原，其熱變性速率均迅速增加，出現明顯的吸熱峰，但由于未變性膠原總量一定，較低升溫速率條件下的膠原較早完成全部變性，形成新基線，但反應熱無明顯變化。同時，考慮隨著升溫速率的降低，升溫過程耗時增長，在緩慢升溫的過程中，除了膠原變性的過程外，伴隨著膠原降解的過程，使膠原的熱穩定性在緩慢升溫的過程中，逐漸降低，最后導致變性溫度隨升溫速率的減小而降低的現象。

根據不可逆速率過程模型[10]，可對海蜇膠原的熱變性的DSC曲線解釋如下：當溫度較低時，膠原的熱變性速率很低，此時熱容變化很小，DSC的基線很平；當溫度達到一定值時，膠原熱變性速率足夠高，其導致的熱容變化能夠被儀器檢測到，基線開始漂移；隨著溫度的逐漸升高，膠原的熱變性速率迅速增加，體系的熱容也相應提高，然而在膠原的熱變性是不可逆的情況下，體系熱容的增加會受到樣品中未變性膠原數量減少的制約；當溫度達到一定值時，體系的熱容達到最大值，之后逐漸降低直至所有膠原分子全部變性，此時生成了新的基線[18]。

2.2 不同溫度加熱條件下海蜇傘部PSC殘存率的變化

圖2 海蜇傘部PSC熱處理不同時間后的DSC結果Fig. 2 DSC curves of PSC from jellyf i sh umbrella after heating treatment for different times

海蜇傘部PSC隨著熱處理溫度及時間的變化，其殘存率發生變化，以加熱0 min為空白（殘存率為100%）。通過海蜇傘部PSC的殘存率曲線，可分析相同溫度熱處理不同時間，海蜇傘部PSC的熱變性情況，以34 ℃與39 ℃為例，分析海蜇傘部PSC的熱變性趨勢。圖2顯示，34 ℃與39 ℃熱處理不同時間，隨著熱處理時間的延長，海蜇傘部PSC熱變性曲線中的吸熱峰先是逐漸變平緩，后分裂為兩個峰，最終吸熱峰逐漸消失。說明在34 ℃與39 ℃條件下短時間加熱，海蜇傘部PSC的結構中個別維持網絡結構的化學鍵遭到破壞，而當熱處理時間進一步延長時，這種結構幾乎被完全破壞掉，因此導致原來的單一吸熱峰分為兩個吸熱峰。海蜇傘部PSC在34 ℃條件下加熱35 min后，熱變性曲線仍未變為一條直線，即海蜇傘部PSC未完全變性，仍保留少量的三螺旋結構。而在39 ℃條件下加熱5 min后，熱變性曲線可近似看成一條直線，即完全趨于變性。由圖2可知，34 ℃與39 ℃熱處理過程中，海蜇傘部PSC的反應熱與熱處理時間成反比。海蜇傘部PSC在35、36、37、38、39 ℃條件下熱處理不同時間具有相同的結論，即溫度升高，海蜇傘部PSC完全變性所用的時間減少。

圖3 不同溫度加熱不同時間海蜇傘部PSC殘存率變化Fig. 3 Time-course curves of rates of residual PSC from jellyf i sh umbrella at different heat treatment conditions

由圖3可知，海蜇傘部PSC隨著熱處理溫度的升高和時間的延長，變性加劇。海蜇傘部PSC在34 ℃的條件下，變性較為緩慢，完全變性所需時間較長；35 ℃條件下，海蜇傘部PSC殘存率降至10%所需時間相比34 ℃條件明顯減小；36 ℃條件下熱處理15 min，海蜇傘部PSC的殘存率小于10%；海蜇傘部PSC在37 ℃的條件下處理10 min，已經完全變性；海蜇傘部PSC在38、39 ℃的條件下變性較為迅速，熱處理5 min左右，殘存率小于10%。海蜇傘部PSC在34 ℃以下穩定性較強，隨著溫度的升高，海蜇PSC穩定性下降的幅度會逐漸增大。

2.3 海蜇傘部PSC熱變性動力學分析

2.3.1 海蜇傘部PSC熱變性方程反應級數及變性速率常數的確定

表2 海蜇傘部PSC熱變性過程中不同反應級數下的相關系數Table 2 Correlation coefficients of kinetic equations with different reaction orders for the thermal denaturation process of PSC from jellyfish umbrella

表3 海蜇傘部PSC熱變性參數（n = 0.9）Table 3 Thermal denaturation kinetic parameters of PSC from jellyfish umbrella (n = 0.9)

綜合海蜇傘部PSC不同溫度條件下的n值，表2顯示，當n=0.9時，回歸方程的相關系數（R2）平均值最大，且縱坐標截距接近1，由此可以確定海蜇傘部PSC熱變性反應的反應級數為0.9。反應級數由反應機制決定，生成產物之前，反應物曾經過許多非穩定的瞬間反應，這些瞬間反應所產生中間化學生成物的特性，可以控制反應級數。根據張紅[19]、鄭惠娜[20]等的實驗研究結果，乳鐵蛋白的熱變性反應級數為1.9，水溶性和鹽溶性馬氏珠母貝肌肉提取蛋白熱變性級數分別為1.1和1.3[20-21]。蛋白質變性十分復雜[22-24]，不同來源的蛋白或是相同來源不同種類的蛋白，由于其組成和結構的不同，在熱變性過程中，其非穩定瞬間反應存在差異，導致其熱變性反應級數具有明顯差別。根據不同溫度條件下回歸方程的斜率，計算得到不同溫度條件下的變性速率常數。由表3可知，隨著溫度的升高，海蜇傘部PSC變性速率常數增加，變性速率加快。

2.3.2 熱變性過程中表觀活化能及熱力學參數

熱對蛋白質的變性作用體現在熱使分子振動程度增加，蛋白質分子內和分子間的各種作用力被削弱，導致原本規則、致密的蛋白質分子結構被破壞，有序纏繞、折疊的多肽鏈伸展開形成線性分子[25-27]。熱對蛋白質的變性作用受蛋白質本身的性質、蛋白質濃度、溫度、作用時間等多種因素的影響[28]，這是因為蛋白質分子的空間結構的穩定性受這些因素的影響。根據Arrhenius方程取對數結果，ln k = ln A-Ea/RT，做ln k-1/T圖，由圖中方程y=-57 961.897 3x+192.703 0（R2=0.966 0）的斜率可計算出海蜇PSC熱變性過程中的表觀活化能Ea=481.90 kJ/mol。根據張紅[19]、鄭惠娜[20]等的實驗研究結果，乳鐵蛋白的表觀活化能Ea=125.07 kJ/mol[19-20]，水溶性和鹽溶性馬氏珠母貝肌肉提取蛋白變性活化能分別為101.83 kJ/mol和112.78 kJ/mol[20-21]。膠原蛋白是由3 條多肽鏈組成的具有三股螺旋結構的蛋白質[29]，變性過程為膠原蛋白交聯區域的三股螺旋結構向無規則線團的過渡。穩定超螺旋結構主要是氫鍵、疏水鍵、范德華力以及膠原分子側鏈相反電荷基團的作用，在膠原分子結構上有序分布的電離基團和疏水作用有利于膠原結構的穩定[30]。同時，氫鍵鍵合水分子在穩定膠原結構中也起了重要作用。因而相比之下，海蜇傘部PSC具有較高的表觀活化能。

根據ln k-1/T圖可知方程截距，得ln A為185.80，再根據不同熱力學參數公式，分別計算出海蜇傘部PSC在不同溫度條件下各項熱力學參數值（表4）。

表4 海蜇傘部PSC熱變性過程中的熱力學參數Table 4 Thermodynamic parameters for thermal denaturation of PSC from jellyf i sh umbrella

2.3.3 熱變性過程中D90值與Z90值

表5 海蜇傘部PSC熱變性過程中的D90值與Z90值Table 5D90and Z90values for thermal denaturation of PSC from jellyf i sh umbrella

對海蜇傘部PSC質量濃度對數lgCt與熱處理時間t作圖，根據圖中直線斜率可計算出在34、35、36、37、38 ℃和39 ℃條件下海蜇傘部PSC熱變性的D90值，并以lgD90對溫度T作圖，得y=-0.271 1x+10.907（R2=0.966 1），根據直線斜率計算出在34～39 ℃范圍內海蜇傘部PSC熱變性的Z90值。由表5可知，隨著熱處理溫度的升高，D90值減小，即在恒定溫度條件下90%海蜇傘部PSC變性所需時間縮短，且在海蜇傘部PSC變性溫度35 ℃左右，D90值變化明顯。在此溫度范圍內的Z90值為3.69 ℃。考慮隨著溫度升高，單位時間內提高的熱量即能量值增加，使海蜇傘部PSC變性速率加快，完成變性時間縮短。

3 結 論

海蜇傘部PSC熱變性動力學分析表明，PSC熱變性反應級數為0.9，在34、35、36、37、38 ℃及39 ℃的加熱條件下，隨著溫度的升高，且PSC變性的D90值不斷下降，分別為53.76、26.11、15.75、4.89、4.26、2.55 min，說明其PSC變性速率常數增加，熱變性率不斷升高。在此溫度范圍內的Z90值為3.69 ℃，表觀活化能Ea=481.90 kJ/mol。相比于其他來源的蛋白質，海蜇傘部PSC反應級數較低，表觀活化能較高。熱變性動力學是研究膠原穩定性的重要組成部分，是生物材料進行實際應用的基本原理，可為海蜇活性膠原蛋白的開發利用提供理論參考。

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Thermal Denaturation of Pepsin-Solubilized Collagen from Rhopilema esculentum Umbrella

SUN Rui1, WANG Xusong1, QIN Lei1,2,*, ZHANG Yuying1, XU Xianbing1,2, DU Ming1,2, DONG Xiuping1,2, LI Dongmei1,2
(1. School of Food Science and Technology, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China; 2. National Engineering Research Center of Seafood, Dalian 116034, China)

In order to elucidate the thermal denaturation mechanism of pepsin-solubilized collagen (PSC), intact PSC was extracted from jellyf i sh umbrella. The denaturation temperature of PSC under different heating rates, and the rates of residual PSC after heating at different temperatures for different times were investigated by a microcalorimeter. The thermal denaturation kinetics of PSC was analyzed as well. The results showed that the endothermic peak gradually moved towards lower temperature area with the decrease in heating rate, suggesting that the denaturation temperature of PSC declined with the decrease in heating rate. However, the change in heating rate did not show any signif i cant impact on the heat of reaction. As the temperature rose, the increase of energy per unit time, namely the quantity of heat, could increase the degeneration rate of PSC, thereby shortening the degeneration time of PSC. The thermal denaturation process of PSC could be described by a regression equation with a reaction order of 0.9. At 34, 35, 36, 37, 38 and 39 ℃, the D90values (time required for 90% denaturation) were 53.76, 26.11, 15.75, 4.89, 4.26 and 2.55 min, respectively. The Z90value (temperature change for 90% reduction of D value) was 3.69 ℃. The apparent activation energy was 481.90 kJ/mol. This research can provide a theoretical guideline for further development and utilization of jellyf i sh collagen.

jellyf i sh; pepsin-solubilized collagen; thermal denaturation; kinetics

10.7506/spkx1002-6630-201715016

TS254

A

1002-6630（2017）15-0095-06

孫睿, 王煦松, 秦磊, 等. 海蜇傘部酶促溶性膠原蛋白的熱變性動力學[J]. 食品科學, 2017, 38(15): 95-100. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201715016. http://www.spkx.net.cn

SUN Rui, WANG Xusong, QIN Lei, et al. Thermal denaturation of pepsin-solubilized collagen from Rhopilema esculentum umbrella[J]. Food Science, 2017, 38(15): 95-100. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201715016. http://www.spkx.net.cn

2016-06-24

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD04B09）；國家自然科學基金青年科學基金項目（31401519；31401520）；遼寧省高等學校優秀科技人才支持計劃項目（LJQ2013061）

孫睿（1991—），男，碩士研究生，研究方向為食品科學與工程。E-mail：794599010@qq.com

*通信作者：秦磊（1984—），男，講師，碩士，研究方向為水產品加工理論與技術。E-mail：qinlei@dlpu.edu.cn