正交實驗法優化發酵蜈蚣粉中總黃酮提取工藝研究

王彥多，劉春雨,呂世潔，王集會，陳 智*

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

正交實驗法優化發酵蜈蚣粉中總黃酮提取工藝研究

王彥多1，劉春雨1,呂世潔1，王集會2，陳 智2*

(1.山東中醫藥大學藥學院，山東 濟南 250355；2.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355)

目的:探究發酵蜈蚣粉中總黃酮的最佳提取工藝。方法:通過紫外可見分光光度法測定發酵蜈蚣粉中總黃酮含量，以總黃酮浸出量為考察指標，采用正交實驗法，優化發酵蜈蚣粉中總黃酮的最佳提取工藝。結果:回流提取法提取總黃酮的最佳提取工藝為：提取溫度70 ℃，提取時間1.5 h，料液比1:25。

正交實驗;總黃酮;提取工藝

蜈蚣為蜈蚣科動物少棘巨蜈蚣(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch)。辛，溫；有毒[1]。蜈蚣是傳統中藥材，具有通絡止痛，解毒散結，息風止痙的作用[2]。臨床常用其治療腫瘤、原發性高血壓、神經性頭痛、糖尿病及并發癥、偏頭痛等[3-4]。

黃酮類化合物具有抗氧化壓力、抗炎和抑制癌基因表達的作用[5],因此黃酮類化合物成為人們研究的熱點。通過使用球孢白僵(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill)對蜈蚣進行發酵可以提高蜈蚣中黃酮類物質的含量，增強其解毒散結的功效，還可以較大幅度的改變藥性、降低毒副作用和提高療效[6]。

本實驗采用紫外可見分光光度法對發酵蜈蚣粉總黃酮類化合物含量進行最佳提取工藝優化研究。通過參考文獻資料確定以提取溫度、提取時間、料液比作為考察因素,通過設計正交實驗來探究三種因素對發酵蜈蚣粉總黃酮提取量的影響,從而確定最佳提取工藝條件。本實驗采用發酵蜈蚣粉,具有創新性，有關發酵蜈蚣的文獻實驗未見報道。

1 實驗材料

1.1 儀器設備

UV9100B型紫外可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)； ST 16R高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；SHB-III循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；FA1004N電子天平(上海精密科學儀器有限公司)；SK-1快速混勻漩渦器(中國 深圳)；遠紅外輻射干燥箱(上海陽光實驗儀器有限公司)；梅特勒-托利多分析天平(上海先悅機電有限公司)。

1.2 實驗試劑

蘆丁對照品(中國醫藥上海化學試劑公司生產)，亞硝酸鈉，無水乙醇，六水氯化鋁，氫氧化鈉等試劑均為分析純。

1.3 供試品

本實驗所使用的蜈蚣粉購自安徽亳州市(批號：20150730)，經山東中醫藥大學藥學院高德民教授鑒定為少棘巨蜈蚣粉(Scolopendra subspinipes mutilans L.Koch)。發酵蜈蚣粉(批號：20160301)由山東中醫藥大學化學實驗室自制。

2 實驗方法

2.1 標準曲線的繪制

精密稱取蘆丁對照品0.02000 g，用60 % 的乙醇溶解并定容至 100 mL。分別取此溶液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00和5.00 mL ，加入30 % 的乙醇至5 mL，再加入5 % 的NaNO2溶液0.30 mL ，搖勻后靜置6 min ，加入10 % 的AlCl3·6H2O溶液0.60 mL ，搖勻后靜置 5 min ，然后加入4 % 的NaOH溶液2.00 mL，加入30 % 的乙醇定容至10 mL 刻度，搖勻，于510 nm 處測定吸光度，以吸光度對濃度做標準曲線。蘆丁對照品溶液在此濃度范圍內與吸光度成良好線性關系，線性回歸方程為A=0.9543C，A為吸光度，C為總黃酮含量，線性相關系數為r=0.9996[7-8]。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取發酵蜈蚣粉1.0000 g ，按料液比加入80 % 乙醇，回流提取兩次,進行抽濾，取上清液于3000 r/min 離心10 min ，收集上清液于50 mL容量瓶中定容。置于4 ℃ 冰箱保存備用[9]。

2.3 顯色方法及波長測定

采用NaNO2-AlCl3-NaOH顯色法、紫外可見分光光度法測定發酵蜈蚣粉中總黃酮含量,待測樣品于510 nm 處有最大吸收。

2.4 正交實驗設計

以提取溫度(A)、提取時間(B)、料液比(C)為三個因素，根據文獻及實驗資料選取三個較優水平:提取溫度60,70,80 ℃ ;提取時間1,1.5,2 h ;料液比1:15,1:20,1:25 g/mL，做正交試驗。實驗平行3次，取平均值。正交實驗因素見表1。

表1 正交實驗因素

3 結果與討論

3.1 正交實驗結果

本實驗考察了3個影響因素和3個水平,故選用4因素3水平9次實驗的正交實驗表,記為L9(34)，正交實驗設計及實驗結果見表 2。

表2 正交實驗表

表3 方差分析表

注:F0 .01(2,2)=99%

由方差分析得出: 提取溫度 (A)、料液比 (B)、提取時間(C)對實驗結果都具有顯著性影響。各因素對發酵蜈蚣粉總黃酮提取的顯著性影響次序為: 提取溫度 (A) >料液比 (B) >提取時間 (C)。由此，得到正交實驗范圍內的最佳提取條件A2B3C2，即提取溫度為70 ℃ ，料液比為1:25，提取時間為1.5 h。

3.2 驗證實驗結果

于最佳提取條件A2B3C2下重復進行3次實驗,進行實驗驗證,結果見表4。

表4 實驗結果驗證

由表4可知：按最佳提取條件從1.0000 g發酵蜈蚣粉中提取總黃酮的平均提取量為20.311 mg/g,提取量高且具有重復性, 驗證了所選提取工藝參數的合理性。

4 討論

由方差分析得出:提取溫度對發酵蜈蚣粉總黃酮的提取影響最大,其中當提取時間為70℃時提取量最高。料液比對發酵蜈蚣粉的提取影響次于提取溫度的影響,且隨著料液比增大,提取效果提高。提取時間對于發酵蜈蚣粉總黃酮提取量的影響也較大,但次于提取溫度和料液比的影響,其中1.5 h提取效果最好。實驗采用正交實驗法優化發酵蜈蚣粉總黃酮提取的最佳提取工藝條件，實驗結果表明提取溫度是影響黃酮提取的關鍵性因素。通過最佳提取工藝得到發酵蜈蚣粉中的總黃酮含量為20.311 mg/g。

研究表明，黃酮類化合物具有抗炎、抑制癌細胞基因表達的作用[5]。近年來，隨著抗腫瘤藥理作用研究的不斷深入，其在臨床抗腫瘤的應用上也更加廣泛。通過發酵可以提高脂溶性黃酮的含量，因此，對發酵后蜈蚣提取黃酮的藥理學研究還有待進行。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典一部(2010年)[M].北京：中國醫藥科技出版,2010:335-336.

[2] 王賢純.蜈蚣的藥用研究進展[J].動物學雜志,2002,37(3):88-91.

[3] 張 艷,劉西建.抗腫瘤的有毒中藥現代研究進展[J].中國中醫藥現在遠程教育,2012(24):154-158.

[4] 張 敬,洪月光，翟鑫宏，等.久香巖痛寧鎮痛作用的實驗研究[J].河北中醫藥學報,2001,16(2):33-34.

[5] 黃華藝,查錫良.黃酮類化合物抗腫瘤作用研究進展[J].中國新藥與臨床雜志,2002,21(7):428-433.

[6] 王延年,董 雪，喬延江， 等.中藥發酵研究進展[J].2010 ,12(3):437-440.

[7] 陳建平，王金輝，王艷杰，等.蒙藥瞿麥中總黃酮超聲提取工藝研究及含量測定[J].中華中醫藥，2013(9):2580-2584.

[8] 左麗麗，趙 路，雷麗麗.正交實驗法優化西蘭花總黃酮提取工藝研究[J].吉林醫藥學院學報，2016(8):245-248.

[9] 張吉祥，歐來良.正交實驗法優化棗核黃酮的最佳提取工藝[J].食品工業科技，2012(10):280-283.

[10] 李玉賢，張佳樂，劉金浩.正交實驗法優化咖啡因提取工藝研究[J].實驗室科學，2011(4):105-107.

(本文文獻格式：王彥多，劉春雨,呂世潔，等.正交實驗法優化發酵蜈蚣粉中總黃酮提取工藝研究[J].山東化工，2017，46(06)：16-17.)

Study on Ultrasonic Extraction of Total Flavone from Ferment Centipede Powder with Orthogonal Experiment

WangYanduo1,LiuChunyu1,LyuShijie1,WangJihui2，ChenZhi2*

(1. College of pharmacy,Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2.Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China)

Objective:To explore the best extraction process of total flavone from ferment centipede powder.Method：UV-vis was used to determine the content of total flavone and using orthogonal experiment to optimize it. Result:The best extracting process to extract total flavone with reflux extraction is under the power of ultrasound wave of 1:25 g/mL, 70 ℃ of the extraction temperation and 1.5 h of the extraction time.Under these conditions,the content of flavone in extraction is 20.311 mg/g.

orthogonal test；total flavone；extraction process

2017-02-13

山東中醫藥大學大學生研究訓練(SRT)計劃資助項目，校編號：2016054

王彥多(1997—)，女，山東濟南人，2015級中藥學專業本科生；通信作者：陳 智，講師，研究方向：中藥新藥與中藥炮制原理研究。

R283

A

1008-021X(2017)06-0016-02