中藥天龍發(fā)酵前后與酶解提取物抗腫瘤效果比較研究

朱明珠，王 穎，邢佰穎，劉春雨，劉雙雙，王集會，劉玉紅，閆 濱

(1.山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學 實驗中心，山東 濟南 250355；3.山東中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院，山東 濟南 250355 )

中藥天龍發(fā)酵前后與酶解提取物抗腫瘤效果比較研究

朱明珠1，王 穎1，邢佰穎1，劉春雨1，劉雙雙1，王集會2，劉玉紅1，閆 濱3*

(1.山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學 實驗中心，山東 濟南 250355；3.山東中醫(yī)藥大學 中醫(yī)學院，山東 濟南 250355 )

目的:比較不同方法處理的天龍水提物對乳腺癌MCF-7細胞株的抑制作用。方法:使用酶解法和甲基噻唑藍(MTT)法，以蛋白質(zhì)水解度、對乳腺癌細胞MCF-7的抑制率為指標，評價混合酶對發(fā)酵前后天龍粉的水解效果，以天龍粉水提物作為對照組，比較天龍粉酵解物和發(fā)酵前、后分別經(jīng)胰蛋白酶和彈性蛋白酶混合酶解水提物對乳腺癌細胞的抑制作用。結(jié)果:混合酶對天龍粉的水解度(52.46%)大于對發(fā)酵天龍粉的水解度(10.71%)；天龍粉混合酶解水提物對乳腺癌細胞的抑制率為正值，隨濃度成正相關(guān)，天龍粉與發(fā)酵天龍粉酶前、酶后水提物對乳腺癌細胞的抑制率為負值。結(jié)論 ：天龍粉混合酶解水提物對乳腺癌MCF-7細胞起到抑制作用，天龍粉與發(fā)酵天龍粉酶前、酶后水提物對乳腺癌細胞無抑制作用。

天龍；混合酶解；酵解；MTT法；抗腫瘤

中藥天龍又名壁虎，為壁虎科動物無蹼壁虎或多疣壁虎的干燥全體，性寒，有小毒，具有止咳平喘、解毒散結(jié)、祛風定驚、通絡(luò)止痛等功效[1]。大量臨床研究發(fā)現(xiàn)，天龍對多種惡性腫瘤都具有一定抑制作用，包括肝癌、食道癌、胃癌、肺癌、甲狀腺癌等[2]。天龍含有蛋白質(zhì)、多糖、組織胺類、脂肪酸、核苷等多種化學成分[3]，天龍體內(nèi)的抗腫瘤活性成分及藥理作用機制的研究一直是天龍研究的熱點。研究表明，天龍抗腫瘤的藥理機制可能與誘導腫瘤細胞凋亡和分化，抑制腫瘤新生血管生成，增強細胞免疫活性等相關(guān)，但是其抗腫瘤活性成分依然不明確。

本實驗以天龍凍干粉為底物，使用白僵菌孢子粉進行發(fā)酵，并分別將天龍粉與發(fā)酵天龍粉用胰蛋白酶、彈性蛋白酶2種蛋白酶進行混合水解。分為天龍組、發(fā)酵天龍組、天龍酶組、發(fā)酵天龍酶組共四組，以天龍組作為對照組，同時以對乳腺癌細胞(MCF-7)的抑制率為指標，比較發(fā)酵、混合酶法、以及發(fā)酵混合酶解法處理后天龍抗腫瘤效果。

1 實驗材料

1.1 藥材

天龍購自安徽亳州，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學生藥系高德民老師鑒定為無蹼壁虎 Gekko swinhonis Gunther。天龍粉，批號: 20150501; 發(fā)酵天龍粉，批號: 20150801;以上天龍粉均由山東中醫(yī)藥大學實驗中心化學實驗室自制。白僵菌孢子粉( 100億/g，山東省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所自篩菌株-桃5)。

1.2 主要儀器

FA-1004N型電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；766-2型遠紅外輻射干燥箱；HWLC型電熱恒溫水溫箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(LDZX-50FBS)；LDZ4-0.8 型離心機( 北京醫(yī)用離心機廠) ；EL340i型全自動酶標儀(Melecular Devices)；倒置顯微鏡(XDS-1B)；PHS-25型pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)等。

1.3 試劑

胰蛋白酶(國藥集團化學試劑有限公司);彈性蛋白酶(上海源葉生物科技有限公司);蒸餾水;注射用順鉑(齊魯制有限公司)等。

1.4 實驗細胞

乳腺癌MCF-7細胞株由山東省立醫(yī)院提供。

2 實驗方法

2.1 發(fā)酵天龍粉的制備

精密稱取一定量天龍干粉，加入活的白僵菌孢子粉，孢子粉加少量吐溫-80，用適量滅菌水將其稀釋成含1×108 個孢子的混懸液，取適量，拌勻潤濕，在25～28 ℃,濕度95 %恒溫恒濕培養(yǎng)箱中發(fā)酵8 d左右，待長滿菌絲后停止發(fā)酵。

2.2 水溶性活性物質(zhì)超聲提取

分別精密稱取發(fā)酵與未發(fā)酵的天龍粉各兩份，每份2.0000g，按照料液比1:30加入定量蒸餾水，超聲提取30min，抽濾、離心，定容100 mL。

2.3 混合酶酶解法

取2.2中發(fā)酵與未發(fā)酵的天龍水提液，分別置于150 mL錐形瓶中，各加入一定量氫氧化鈉溶液調(diào)pH值=8，加入胰蛋白酶0.08 g，彈性蛋白酶0.1334 g，置37 ℃電熱恒溫水溫箱中酶解4 h，酶解期間，用攪拌裝置勻速不斷攪拌，保證酶與原料充分接觸反應，將酶解液分別抽濾、離心，定容至250 mL的容量瓶中，得酶解液，2種蛋白酶的水解條件見表1。

表1 2種蛋白酶的水解條件

2.4 氨基肽氮含量測定

2.4.1 顯色劑茚三酮的配制

精確稱取果糖0.3 g，茚三酮0.5 g,磷酸二氫鉀6 g，磷酸氫二納10 g，加水定容至100 mL。

2.4.2 繪制標準曲線

精密稱取0.1000 g干燥后的甘氨酸，溶解定容至100 mL，取2 mL定容至100 mL為20 μg/mL的溶液，分別取0，1,2,3,4,5 mL定容至10 mL,配成濃度為0,2,4,6,8,10 μg/mL的標準溶液，分別取2 mL稀釋液于試管中，加入1mL茚三酮，沸水浴加熱15min，冷水冷卻，加入5.00 mL的40 %乙醇溶液搖勻，放置15min，570 nm測定吸光度，進行標準曲線的繪制。

2.4.3 測定樣品含量

取4中天龍粉的水解液稀釋到適宜濃度，按照“2.4.2”的方法測定樣品的吸光度，代入標準曲線求得-NH2的含量，由稀釋倍數(shù)得出水解液氨基肽氮的含量。

2.5 測定原料總氮量

凱氏定氮法[4]測定原料中總氮量。

2.6 測定水解度

水解度為蛋白質(zhì)水解過程中被裂解的肽鍵數(shù)與蛋白質(zhì)總肽鍵數(shù)的比值。由“2.4”方法測得水解液游離氨基肽氮的含量和“2.5”測得原料總氮量，從而計算水解度，公式如下：

A:原料中總氮量 B:水解液中氨基肽氮量 C:原料中游離的氨基肽氮量

2.7 MTT分析法[5]

2.7.1 細胞復蘇

將凍存的腫瘤細胞從超低溫冰箱取出，將其立即投入預先加熱到37 ℃的滅菌水中，待凍存的液體溶化后，進行2000 r/min離心3 min，收集溶化后的細胞，用含10 %胎牛血清1640的新鮮培養(yǎng)基在5 %CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進行細胞培養(yǎng)。

2.7.2 接種

等腫瘤細胞長至80 %融合時，用0.25 %的胰酶細胞消化液(含0.02 %EDTA)對其消化，將處于對數(shù)生長期的腫瘤細胞以100 μL/孔進行接種，分別接種于96孔板中，預先留下三個調(diào)零孔，在調(diào)零孔只加不含血清的1640培養(yǎng)基，不加腫瘤細胞。

2.7.3 加藥

稱取10mg凍干粉，溶于10 mL1640培養(yǎng)液，配成含有效分2 mg/mL的初始濃度，無菌環(huán)境中用0.22 μm濾膜過濾，用已經(jīng)慮菌的1640培養(yǎng)液依次稀釋，配成2、1、0.5、0.25、0.125 mg/mL藥物濃度梯度，待96孔板中細胞長滿單層后，棄去培養(yǎng)基，調(diào)零組、空白對照組各加入100 μL不含血清的1640培養(yǎng)基，陽性對照組加100 μg/mL的順鉑100 μL，其他給藥組每孔分別加入含不同濃度篩選藥物的1640培養(yǎng)基100 μL，每個濃度的藥物重復加加5個孔。以天龍粉水提液組為對照，將細胞在37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.7.4 MTT 法測定細胞抑制率

每孔各加入5 mg/ml MTT溶液20 μL,培養(yǎng)箱內(nèi)避光反應4個小時,吸去上清液，加入100 μLDMSO，用酶標儀于492 nm測OD值,按如下公式計算細胞抑制率。

3 結(jié)果

3.1 氨基肽氮含量測定

3.1.1 標準曲線測定

C=3.4792A+0.0267(μg/mL) R2=0.9983

C:氨基肽氮濃度 A:吸光度

3.1.2 氨基肽氮含量

水解液中氨基肽氮含量見表2。

表2 水解液中氨基肽氮含量

3.2 樣品水解度測定

凱氏定氮法測得1.0000g天龍發(fā)酵前、后總氮量分別為13.1841mg/g，28.1187mg/g。由公式計算水解度,見表3。

表3 樣品水解度

3.3 MTT法測定樣品對乳腺癌細胞MCF-7的抑制率

天龍水提液、發(fā)酵天龍酶前、后水提液對乳腺癌細胞無抑制作用，天龍混合酶解液對乳腺癌細胞具有抑制作用，且抑制率曲線隨酶解液濃度呈正相關(guān)，見圖1。

圖1 不同濃度天龍混合酶解液對乳腺癌MCF-7的抑制率曲線

4 討論

研究表明，蛋白質(zhì)、多糖、核酸是動物藥中的水溶性活性成分。生物技術(shù)的快速發(fā)展，使酶法和酵法逐漸被廣大醫(yī)學工作者所重視，被廣泛應用于中藥研究領(lǐng)域。酶法在中藥提取中的應用研究始于20世紀90年代中期，廣泛應用于多種中藥活性成分的提取研究中，并取得了較好的效果，某些動物藥經(jīng)酶解后釋放出活性多肽和其它活性小分子物質(zhì)[6]，表現(xiàn)出較原藥更強的生物活性。酶具有專一性，彈性蛋白酶只專一水解丙氨酸、甘氨酸及短脂肪鏈氨基酸的羧基形成的肽鍵，胰蛋白酶只專一水解賴氨酸、精氨酸羧基形成的肽鍵，彈性蛋白酶和胰蛋白酶最適pH值在8.0左右,弱堿性條件利于中和蛋白質(zhì)水解過程斷裂的羧基，利于水解和活性小分子釋放，更好的發(fā)揮藥理活性[7]。發(fā)酵過程中，微生物可將中藥中糖類、蛋白質(zhì)等成分進行分解轉(zhuǎn)化，生成一些具有活性的小分子水溶性物質(zhì)，同時將中藥的細胞壁進行破損，使細胞里水溶性成分溶出[8]，進而發(fā)揮藥理作用。

本實驗混合酶對天龍粉的水解度高于對發(fā)酵天龍粉的水解度，水解度越高，越有利于小分子釋放，發(fā)揮藥理活性。發(fā)酵天龍粉酶前、后對乳腺癌細胞無抑制作用，且水解度低，可能與發(fā)酵過程中白僵菌將藥物細胞壁破壞和白僵菌對天龍粉進行雙向固體發(fā)酵中，天龍中蛋白質(zhì)等成分與白僵菌的生長、代謝存在相互作用等有關(guān)。實驗采用胰蛋白酶和彈性蛋白酶混合酶解，可將多種肽鍵進行水解，使水解度提高，生成更小分子活性物質(zhì)，對乳腺癌細胞(MCF-7)的生長起抑制作用。

[1] 劉玉軍,李剛,馬 睿,等. 天龍抗腫瘤研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2011(07):262-264.

[2] 侯新楠. 壁虎抗腫瘤研究[D]. 北京:北京中醫(yī)藥大學,2008.

[3] 李 雯,王國才,張曉琦,等. 中藥壁虎化學成分研究[J].中國中藥雜志,2010,35(18):2412-2415.

[4] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

[5] 張金紅,耿朝暉,段江燕,等. MTT比色分析法在貼壁生長細胞藥物敏感性測定中的應用[J]. 南開大學學報(自然科學版),1996(04):109-112.

[6] 王愛華,柳美玲,戴志明,等.小肽的吸收機制與營養(yǎng)價值研究進展[J].江西飼料 , 2007(5):10-14.

[7] 焦方文,王集會,鄒 龑,等. 全蝎粉酶解工藝最佳用酶的初步篩選[J].時珍國醫(yī)國藥,2015(10):2407-2408.

[8] 王延年,董雪,喬延江,等. 中藥發(fā)酵研究進展[J].世界科學技術(shù)(中醫(yī)藥現(xiàn)代化),2010(03):437-441.

(本文文獻格式：朱明珠，王 穎，邢佰穎，等.中藥天龍發(fā)酵前后與酶解提取物抗腫瘤效果比較研究[J].山東化工，2017，46(06)：20-22.)

Comparative Study on Anti-tumor Effect of Chinese Herbal Medicine Tianlong Before and after Fermentation and Enzymatic Extract

ZhuMingzhu1,WangYing1,XingBaiying1,LiuChunyu1,LiuShuangshuang1,WangJihui2,LiuYuhong1,YanBin3*

(1. The Pharmacy College , Shandong Univerity of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China;2.The Experiment Center ,Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355,China;3.The College of Traditional Chinese Medicine ,Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355,China)

Objective To compare the different treatment methods of Tianlong water extract of inhibition effect on human breast cancer cell line MCF-7：Methods： Using enzyme hydrolysis method and methyl thiazolyl blue (MTT) method, the degree of protein hydrolysis and the inhibition rate on MCF-7 breast cancer cells as evaluating indicator,Evaluating the hydrolysis effect of mixed enzyme on the Tianlong powder before and after fermentation, Tianlong water extract as contrast group, comparing the inhibitory effect of water extract of Tianlong glycolysis and fermentation before and after are enzymatic hydrolysised by trypsin and elastase respectively on human breast cancer cells.Results:The hydrolysis degree(52.46%) of Tianlong on mixed enzyme hydrolysis is higher than the hydrolysis degree (10.71%) of fermentation Tianlong on it; Tianlong mixed enzymolysis water extract's inhibition rate on breast cancer cells is positive, with the positive correlation of concentration, Tianlong and fermentation Tianlong is enzymed before and after have negative inhibiting rate on breast cancer cells.Conclusion:Tianlong mixed enzymolysis water extract have inhibition on breast cancer cell MCF-7, Tianlong and fermentation Tianlong is enzymed before and after haven't inhibitory effect on breast cancer cells.

tianlong;mixed enzymatic hydrolysis;glycolysis;MTT method; antitumor

2017-02-18

山東中醫(yī)藥大學大學生研究訓練(SRT)計劃資助項目(項目編號2016031)

朱明珠(1996—)，女，山東曲阜人，本科在讀，研究方向：制藥工程；通信作者：閆 濱，副教授，研究方向：從事中藥的活性成分的研究。

R284.1

A

1008-021X(2017)06-0020-03