黃菖蒲有機酸組分對銅綠微囊藻細胞質膜透性的影響

陳國元，李青松，何彩慶

（廈門理工學院環境科學與工程學院，福建 廈門 361024）

0 引言

近幾十年來，水體富營養化及藻類水華已成為一個世界性環境問題。水生植物化感抑藻作用的發現使其開始應用于富營養化水體藻類控制領域，并已成為世界環境研究的熱點和前沿[1]。現在，許多植物的浸提液和提取物都發現對藻類生長具有很好的抑制作用[2-5]，并從中分離到具有很好抑藻效果的化感物質[6]，為藻類水華控制提供了新的思路和材料。作者在前期的研究中，發現具有很好氮、磷去除能力的挺水景觀植物-黃菖蒲(Iris pseudacorus L)[7]能對藻類生長產生嚴重影響[8]，已從黃菖蒲水浸提液中鑒定出15種脂肪酸類物質和9種酚酸類物質，并進一步研究表明，這些有機酸成分能夠明顯抑制銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)超氧化物歧化酶(SOD)的活性，引起細胞的氧化損傷，促進葉綠素的分解[9]。

本實驗繼續以黃菖蒲為材料，采用液液萃取的方法得到黃菖蒲水浸提液的有機酸組分，研究其對銅綠微囊藻細胞質膜透性的影響，具體包括細胞內超氧陰離子自由基(O2-·)的產生，K+、可溶性蛋白及核酸滲出量，非電解質外滲率及藻液電導率等，旨在探討黃菖蒲有機酸組分化感作用下，銅綠微囊藻細胞膜系統的變化，為進一步闡明黃菖蒲有機酸組分的化感抑藻機制提供理論依據，以期最終為將其應用到富營養化水體水華防治中提供有價值的研究資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃菖蒲購至福建省龍海市興濤花木專業合作社。銅綠微囊藻(FACHB-905)由中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫提供，先用BG-11培養液于MGC-450BPY-2智能型光照培養箱中進行擴大培養，培養條件為：恒溫光照(25±1℃，3000lx)，明、暗比 12h/12h。然后取適量藻液，3 000 r/min離心10 min，去掉上清液，獲得銅綠微囊藻細胞，加入新鮮的高溫滅菌的BG11培養基培養6d，使之處于對數生長期。

1.2 有機酸組分的獲得

黃菖蒲洗凈、晾干、粉碎，室溫下60.0 g粉末用1 L超純水浸提48 h，濾紙濾去提取液中的殘渣后經0.45 μm Whatman GF/C玻璃纖維膜抽濾，濾液用2 mol/L的NaOH調節pH值到12，以6 000 r/min離心10 min，上清液移至分液漏斗，色譜純正己烷萃取3次，收集水相用2 mol/L的HCl調節pH值至2，乙酸乙酯萃取4次，收集乙酸乙酯組分，無水硫酸鈉干燥，35℃下旋轉蒸發去除溶劑，獲得浸膏58.6 mg，4℃保存備用。

1.3 實驗設計

分別稱取適量浸膏，加入二甲亞砜（DMSO）溶解，加入高溫滅菌的BG11培養基，使DMSO體積分數為0.05%[10]，隨后接入處于對數生長期的銅綠微囊藻，接種密度約為5×106個/mL，浸膏最終質量濃度分別為2，20和50 mg/L。同時設定不添加浸膏的BG11培養基培養銅綠微囊藻為對照組。每組設定3個平行。培養瓶置于MGC-450BPY-2智能型光照培養箱中。第 1，3，5 天取樣，測定藻液電導率(EC)、非電解質外滲量、可溶性蛋白質及核酸滲出量和銅綠微囊藻細胞內含量。

對K+釋放的影響：首先取適量浸膏，加入DMSO溶解后加入生理鹽水分別配制成質量濃度4，40和100 mg/L的浸膏溶液。然后取擴大培養后的銅綠微囊藻，加入高溫滅菌的BG11培養基使銅綠微囊藻密度約為1.0×107個/mL，取藻液10 mL于15 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，去掉上清液，加入10 mL生理鹽水，輕輕搖勻后離心，獲得銅綠微囊藻細胞，共制備15管。3管中加入10 mL生理鹽水作為對照，其它9管中分別加入5 mL生理鹽水和5 mL浸膏溶液，使有機酸組分質量濃度分別為2，20和50 mg/L，搖勻后置于MGC-450BPY-2智能型光照培養箱中，3 d后取樣測定藻液中K+濃度。最后3管加入10 mL生理鹽水,100℃水浴10 min,3 000 r/min離心10 min，上清液用于測定K+濃度,表示細胞膜完全破壞后K+滲出總量[11]。

1.4 測定方法

取藻液15 mL，3 000 r/min離心10 min后，獲得上清液和藻細胞。取上清液進行下列參數測定：電導率(EC)采用臺式電導率儀(優特CON 510)測定；非電解質外滲量采用紫外吸收法[12]，用UV-2550型紫外分光光度計(日本島津)測定,以OD264值表示；藻可溶性蛋白質和核酸滲出量分別用OD280[13]和OD260值[14]表示。藻細胞中O2-·的產生情況參照蕭華山等[15]的方法測定，以OD530值表示其相對含量。K+濃度在上清液經0.2 μm玻璃纖維濾膜過濾后采用AA-6300C型火焰原子吸收分光光度計(日本島津)測定。

1.5 數據處理與統計

運用SPSS10.0軟件及Sigmaplot10.0軟件對數據進行統計分析和計算。

2 結果與討論

2.1 黃菖蒲有機酸組分對銅綠微囊藻細胞內O2-·的影響

不同濃度黃菖蒲有機酸組分對銅綠微囊藻細胞內O2-·含量的影響見圖1。

圖1 不同濃度黃菖蒲有機酸組分對銅綠微囊藻細胞內O2-·質量濃度的影響

由圖1可知，有機酸質量濃度為2 mg/L時，藻細胞中O2-·含量在培養過程中與對照組沒有顯著性差異（配對t檢驗，p＞0.05）；而有機酸質量濃度為20mg/L時，培養第3天，藻細胞中O2-·含量明顯上升，為初始值的2.38倍，第5天進一步增加，為初始值的4.03倍，顯著高于對照組（配對t檢驗，p＜0.05）；有機酸質量濃度為50 mg/L時，藻細胞中含量在培養過程中也是顯著高于對照組（配對t檢驗，p＜0.05），在第3天和第5天分別為初始值的5.06和7.78倍，說明隨著有機酸的增加，培養時間延長，有機酸組分對銅綠微囊藻產生了嚴重的氧化脅迫。已有大量研究表明，有機酸類物質是非常重要的一類化感抑藻物質[16-21]。如適量的焦性沒食子酸、乳酸等都能對銅綠微囊藻產生氧化脅迫，導致藻細胞內含量上升[18-19]。而作者在前期研究中，已從黃菖蒲水浸提液中鑒定出15種脂肪酸類物質和9種酚酸類物質[9]，其中包括了已被證明具有化感抑藻活性的琥珀酸、肉豆蔻酸、十五烷酸、辛酸、葵酸、月桂酸、軟脂酸、硬脂酸、丁酸、油酸和戊酸等[10,16,22]。這些有機酸類物質可引起藻細胞內O2-·的產生，但是濃度較低的時候，自由基的產生與消除之間處于動態平衡狀態，而隨著有機酸濃度的增加，培養時間延長，有機酸組分對銅綠微囊藻的氧化脅迫加重，O2-·的產生與清除失去平衡，導致O2-·積累。

2.2 黃菖蒲有機酸組分對銅綠微囊藻培養液EC及K+滲出的影響

細胞膜通透性的存在，對細胞內外各種物質的交換，滲透壓的維持，胞內環境的相對穩定等均有著重要的生理意義。脅迫環境下，細胞質膜一般最先受到破壞，其結構和功能發生變化，細胞內小分子物質外滲，EC增加[19,23]。因此，細胞膜的通透性可以用EC表示，見圖2。

圖2 不同質量濃度黃菖蒲有機酸對銅綠微囊藻培養液EC的影響

由圖2可知，對照組和有機酸質量濃度為2 mg/L組，EC值都略有降低，第5天分別為初始值的83.9%和87.3%。而有機酸質量濃度為20 mg/L時，培養第3天，EC值略有上升，為初始值的1.07倍，第5天明顯上升，為初始值的1.26倍；有機酸組分為50 mg/L時，培養第3天，EC值明顯上升，為初始值的1.28倍，第5天繼續增加，為初始值的1.40倍，這主要是因為，藻細胞內積累的O2-·又可以轉化成H2O2和OH·，這些自由基很容易與細胞膜成分、核酸、蛋白質等物質反應，導致細胞脂質過氧化，膜結構受到破壞、膜透性發生變化[24]。

K+是外滲液中電解質的主要成分，因此K+含量可以用來衡量細胞膜損傷的程度[12],見圖3。

圖3 不同質量濃度黃菖蒲有機酸對銅綠微囊藻胞內K+釋放的影響

由圖3可知，黃菖蒲有機酸質量濃度為2，20和50 mg/L時，藻液中K+質量濃度分別為4.73，6.89和9.49 μg/L，分別為對照組的 1.14，1.66 和 2.28 倍，說明高濃度黃菖蒲有機酸組分處理后，銅綠微囊藻細胞膜的選擇透性被破壞，離子的滲出量大量增加。當藻細胞完全破壞時，藻細胞中K+全部釋放，質量濃度為10.15 μg/L，因此，黃菖蒲有機酸質量濃度為50 mg/L時，藻細胞中K+釋放程度達到了93.5%，表明，此時銅綠微囊藻細胞膜的選擇透性已經被嚴重破壞，藻細胞膜損傷非常嚴重。李鋒民等[11]研究了2-甲基乙酰乙酸乙酯（EMA）對銅綠微囊藻細胞膜選擇透性的影響，結果表明，高濃度(ρ＞1 mg/L)的EMA能顯著增加銅綠微囊藻內K+的滲出量。而K+的大量滲出導致藻細胞內K+的缺乏，從而引起細胞其它生理功能的改變，如胞內的離子平衡、光合作用及細胞生長等[25]，從而惡性循環，加劇對藻細胞的傷害。

2.3 黃菖蒲有機酸組分對銅綠微囊藻OD264的影響

藻的細胞質膜通透性增大的時候，除了電解質會滲出外，細胞內有機物也會大量滲出，導致藻培養液中的非電解質含量短時間內急劇增高[12]。見圖4。

圖4 不同質量濃度黃菖蒲有機酸對銅綠微囊藻OD264的影響

由圖4可知,有機酸質量濃度為2 mg/L時，在培養過程中藻細胞OD264與對照組沒有顯著性差異（配對t檢驗，p＞0.05）；而有機酸質量濃度為20 mg/L時，培養第3天，藻細胞OD264明顯上升，為初始值的1.70倍，第5天進一步增加，為初始值的2.66倍，顯著高于對照組（配對t檢驗，p＜0.05）；有機酸質量濃度為50 mg/L時，藻細胞OD264在培養過程中也是顯著高于對照組 （配對t檢驗，p＜0.05），在第3天和第5天分別為初始值的3.85和8.04倍。

藻液中蛋白質和核酸是非電解質外滲物的主要成分，其變化趨勢與OD264變化趨勢基本一致。見圖5和圖6。

圖5 不同質量濃度黃菖蒲有機酸對銅綠微囊藻OD280釋放的影響

圖6 不同質量濃度黃菖蒲有機酸對銅綠微囊藻OD260釋放的影響

由圖5和圖6可知，有機酸質量濃度為2 mg/L時，藻液可溶性蛋白和核酸含量在培養過程中與對照組沒有顯著性差異（配對t檢驗，p＞0.05）；而有機酸質量濃度為20 mg/L時，培養第3天，藻液可溶性蛋白和核酸含量輕微增加，分別為初始值的1.35和1.26倍，第5天有較大程度的上升，分別為初始值的1.89和172倍，顯著高于對照組（配對t檢驗，p＜0.05）；有機酸質量濃度為50 mg/L時，藻液可溶性蛋白和核酸含量在培養過程中顯著高于對照組（配對t檢驗，p＜0.05）,在第5天分別為初始值的5.15和4.69倍,說明隨著黃菖蒲有機酸組分含量的增加，銅綠微囊藻細胞受到化感作用增強，細胞膜通透性增大，胞內的蛋白質和核酸等有機物向胞外滲出，OD264增加。如加拿大一枝黃花(Solidagocanadensis L)提取物處理后，銅綠微囊藻的非電解質外滲率也顯著增加[3]。實驗中，藻細胞內蛋白質和核酸都在第5天爆發式釋放，而藻液電導率變化相對平緩，這主要是因為，細胞膜通透性增大的時候，細胞內的K+，PO43+等離子傾向優先釋放[26]，而經過持續的化感脅迫，藻細胞膜受到嚴重損傷，通透性進一步增大，從而促使胞內的蛋白質和核酸開始大量向胞外釋放。

3 結論

不同質量濃度的黃菖蒲有機酸組分對銅綠微囊藻細胞膜通透性具有明顯不同的影響。具體結果為：有機酸質量濃度為2 mg/L時對銅綠微囊藻細胞膜通透性沒有顯著影響，表現為，銅綠微囊藻胞內O2-·產生和K+、蛋白質及核酸釋放，藻液EC及OD264未發生明顯變化；而有機酸組分質量濃度為20和50 mg/L時，銅綠微囊藻細胞發生了嚴重的氧化損傷，胞內O2-·大量累積，膜的選擇透性發生顯著改變，表現為，K+大量釋放，藻液電導率增加，隨著化感時間的延長，細胞膜損傷嚴重，膜透性進一步增加，胞內蛋白質和核酸等有機物開始大量滲出。有機酸組分質量濃度越高，作用效果越明顯。