不同果齡羅漢果中甜苷含量分布研究

劉 雯，王志宏，楊裴慶，崔麗杰，李珊珊，李桂銀，周治德

(桂林電子科技大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 廣西 桂林 541004)

不同果齡羅漢果中甜苷含量分布研究

劉 雯，王志宏，楊裴慶，崔麗杰，李珊珊，李桂銀，周治德*

(桂林電子科技大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 廣西 桂林 541004)

目的： 研究不同果齡羅漢果中甜苷IV、甜苷V的檢測(cè)方法及含量分布。方法： 以不同果齡羅漢果鮮果為原材料，采用超聲波輔助提取，D101大孔樹(shù)脂吸附純化，得到羅漢果中甜苷提取液；采用HPLC法對(duì)羅漢果甜苷提取液進(jìn)行含量測(cè)定，得到不同果齡羅漢果的甜苷IV、甜苷V含量數(shù)值。結(jié)果： 采用HPLC法檢測(cè)羅漢果甜苷提取液，甜苷IV、甜苷V吸收峰能明顯分開(kāi)，并且具有可讀性；羅漢果甜苷IV的含量從30天到50天呈遞增趨勢(shì)，在50天之后含量驟減，70天以后苷IV的含量極低。羅漢果甜苷 V 含量在30 天到70天不斷增加，而在70天之后，苷V的含量趨于穩(wěn)定。結(jié)論：HPLC法能同時(shí)檢測(cè)出羅漢果苷IV、苷V含量，得到了不同果齡羅漢果中甜苷IV、甜苷V含量分布規(guī)律。

果齡；羅漢果苷 IV；羅漢果苷V；含量

羅漢果(Siraitia grosvenorii)的果味甘性涼，有止咳化啖、清熱潤(rùn)肺、潤(rùn)腸通便的功效，生活中常用于降肺火止咳，緩解咽喉失音，緩解腸燥便秘等癥，是清涼飲料的佳品。以廣西桂林產(chǎn)的羅漢果最出名，享譽(yù)著“東方神果”、“神仙果”的稱(chēng)號(hào)。李俊等人[1]的研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果有2個(gè)多糖，經(jīng)檢測(cè)分析分為SGPS1和SGPS2。羅漢果中黃酮具有抑菌作用、抗氧化和平滑血管等功效有來(lái)源于黃酮類(lèi)物質(zhì)[2]。陳全斌等人[3]利用RP-HPLC法，證實(shí)羅漢果有黃酮苷元山奈酚成分，發(fā)現(xiàn)含有黃酮苷元槲皮素[4]。葫蘆烷三萜類(lèi)化合物具有該類(lèi)骨架的化合物大多具有廣泛的生物活性,諸如抗腫瘤、消炎抗菌等[5]。研究表明這類(lèi)化合物是羅漢果的主要有效成分，它們?cè)诹_漢果干果中的總含量為3.75%-3.85%。其中mogroside V是主要甜味成分。日本人竹本常松等從干燥果實(shí)中分離得到如賽門(mén)苷Ⅰ( sianenosideⅠ)、羅漢果苷ⅡE(mogrosideⅡE) 、羅漢果苷Ⅲ (mogrosideⅢ) 、羅漢果苷 ⅢE(mogrosideⅢE)、羅漢果苷Ⅳ(mogrosideⅣ)、羅漢果苷Ⅴ(mogrosideⅤ) 等葫蘆烷三萜苷類(lèi)化合物[6]。羅漢果具有糖尿病防治作用、防齲齒作用、抗炎癥的作用[7-10]，其有效成分被用來(lái)做成消炎止痛藥并投入市場(chǎng)。有祛痰作用、增加免疫細(xì)胞的數(shù)量、保肝降酶作用[11-12]；近期有報(bào)道稱(chēng)羅漢果苷Ⅳ有預(yù)防治療丙肝作用。

本研究以不同果齡的羅漢果為原料，采用超聲波輔助水提，D101大孔樹(shù)脂吸附，以羅漢果的苷IV、苷V含量為指標(biāo)，采用HPLC法為檢測(cè)方法，探索不同果齡羅漢果中甜苷含量分布規(guī)律，為羅漢果種植技術(shù)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Water HPLC 515高效液相色譜儀 美國(guó)沃特斯公司；40*500mm層析柱 上海禾汽玻璃儀器有限公司；D101大孔樹(shù)脂 滄州寶恩斯吸附材料科技有限公司；SB-5200D超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；DLS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠(chǎng)。

1.2 材料與試劑

羅漢果鮮果，桂林永福縣基地，青毛果；羅漢果甜苷Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品≥98%，羅漢果甜苷Ⅴ標(biāo)準(zhǔn)品≥98%，成都百盈生物科技有限公司；乙腈色譜純美國(guó)TEDIA進(jìn)口試劑；鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鈣、甲醇都為AR 西隴化工股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羅漢果甜苷提取步驟

羅漢果鮮果→搗碎→粗提取→過(guò)濾除渣→大孔吸附樹(shù)脂分離→減壓濃縮→干燥制粉

1.3.2 提取要點(diǎn)

取新鮮羅漢果2個(gè)，搗碎，以固液比1:2加入60%乙醇后置于超聲波儀器中，超聲30min后取出，冷卻過(guò)濾，取濾液；相同法提取3次，合并3次濾液。往濾液中加入15%鮮果重量濃度為10%的 Ca(OH)2懸濁液，絮凝；用離心機(jī)以2500r/min的離心15min，抽濾得到羅漢果提取液。將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏，烘干。取一定的粉末，用甲醇定容至10mL，用HPLC測(cè)定羅漢果甜苷的含量，計(jì)算羅漢果甜苷的提取率。

1.3.3 D101大孔樹(shù)脂吸附

上柱，將羅漢果提取液調(diào)pH值在9以下，上樣速度為2BV/h，柱體積為200mL；用蒸餾水進(jìn)行清洗直到流出液為澄清透明狀；用65%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液500mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。

1.3.4 羅漢果甜苷的含量測(cè)定，采用高效液相色譜法

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品液制備

精密稱(chēng)取羅漢果苷Ⅳ對(duì)照品3.0mg和苷Ⅴ對(duì)照品8.2mg，用甲醇定容到10mL，超聲波處理 20min，用微孔濾膜對(duì)溶液進(jìn)行過(guò)濾。取上清液用高效液相色譜測(cè)定。為防止羅漢果不同甜苷之間的干擾，取適量對(duì)照品配好的標(biāo)準(zhǔn)液混合進(jìn)樣，觀察其圖譜。

1.3.4.2 樣品液制備

分別取不同果齡的羅漢果即30、35、 50、55、60、65、70、75、85、90 天羅漢果鮮果各2個(gè)，搗碎置于燒杯中，提取制得甜苷品。稱(chēng)重，用高效液相色譜儀測(cè)定其苷Ⅳ和苷Ⅴ的含量。

1.3.4.3 色譜柱條件[13]

C18反相(4.6 mm×150 mm)、乙腈-水溶液 21:79、檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為203nm、流速1mL/min 、柱溫 25℃、進(jìn)樣量10ul、跑柱30min

2 結(jié)果與分析

2.1 確定羅漢果甜苷的最佳檢測(cè)波長(zhǎng),為203nm

先對(duì)羅漢果甜苷IV和甜苷V的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC檢測(cè)，確定相應(yīng)的出峰時(shí)間，從而推算樣品的甜苷含量。確定流動(dòng)相比例為乙腈:水=21:79，此時(shí)羅漢果的苷IV峰與苷V峰能明顯拉開(kāi)，并且與其他雜質(zhì)峰不至于混在一起。由羅漢果苷V標(biāo)準(zhǔn)品圖譜可以看出峰保留時(shí)間大概是7.8min，峰面積為2465292。由羅漢果苷IV標(biāo)準(zhǔn)品圖譜可以看出峰保留時(shí)間大概是17min, 峰面積為1031910。 苷V的S標(biāo)=2465292，M標(biāo)=8.2mg，W標(biāo)=98.56%； 苷IV的S標(biāo)=1031910，M標(biāo)=3.0mg，W標(biāo)=98.79%。圖1為羅漢果甙IV+甙V的3D圖譜，圖2為羅漢果苷Ⅳ和苷 V 標(biāo)準(zhǔn)品混合進(jìn)樣 HPLC 圖譜。根據(jù)3D圖譜可以看出，甜苷的峰在檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm出現(xiàn)最高，因此確定甜苷的最佳檢測(cè)波長(zhǎng)為203nm。

圖1 羅漢果甙IV+甙V的3D圖譜

圖2 羅漢果苷Ⅳ和苷 V 標(biāo)準(zhǔn)品混合進(jìn)樣 HPLC 圖譜

2.2 羅漢果的提取實(shí)驗(yàn)結(jié)果

(1)以50天果齡的羅漢果為原料進(jìn)行提取，D101大孔樹(shù)脂吸附，結(jié)果如下：超聲波平均提取率為2.20%，甜苷V平均提取率為0.22%，甜苷IV平均提取率為0.0307。將羅漢果提取液過(guò)D101大孔樹(shù)脂吸附，檢測(cè)前后羅漢果苷V以及苷IV的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 羅漢果甜甙經(jīng)過(guò)D101樹(shù)脂的含量

由表1數(shù)據(jù)可知，通過(guò)優(yōu)化后的工藝，樹(shù)脂 D101 對(duì)羅漢果甜苷有較好的分離效果，通過(guò)提取能得到甜苷 V 含量為 20%左右的羅漢果甜苷粉，苷IV的含量很低，但是也起到了一定的提純作用。

(2) 將30、35、 50、55、60、65、70、75、85、90 天羅漢果鮮果提取物用HPLC進(jìn)行檢測(cè)，部分圖譜如下。

圖3 30 天果齡羅漢果甜苷粉 HPLC 圖譜

圖4 50 天果齡羅漢果甜苷粉 HPLC 圖譜

圖5 70天果齡羅漢果甜苷粉 HPLC 圖譜

圖6 90天果齡羅漢果甜苷粉 HPLC 圖譜

整理圖譜對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)得到表2。

表2 不同果齡羅漢果皂苷含量表

表2結(jié)果表明，羅漢果甜苷 V含量從30 天到70天不斷增加，而在70天之后，苷V的含量趨于穩(wěn)定；甜苷IV的含量從30天到50天呈遞增趨勢(shì)，在50天之后苷IV含量驟減，70天以后苷IV的含量很低。

4 結(jié)論

(1)通過(guò)HPLC的檢測(cè)方法,采用C18反相(4. 6 mm×150 mm)、乙腈-水溶液 21:79、波長(zhǎng)為203nm，流速1mL/min 、柱溫 25℃、進(jìn)樣量10?L、跑柱30min，將羅漢果提取液中甜苷IV、甜苷V吸收峰能明顯分開(kāi)，實(shí)現(xiàn)同步檢測(cè)羅漢果甜苷IV、甜苷V。

(2)羅漢果甜苷,V 隨著羅漢果果齡的增加而出現(xiàn)增加的趨勢(shì)，并且在70天后含量趨于穩(wěn)定；羅漢果甜苷IV的含量在30天到50天的坐果中出現(xiàn)顯著提升，在50天之后含量驟減；說(shuō)明羅漢果苷IV的形成是在50天果齡之前，在50天之后可能轉(zhuǎn)變成其他甜苷。

[1] 梁 靜,劉曉宇,雷小丹.廣西特色資源-羅漢果研究現(xiàn)狀與展望[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊), 2010, 6(7): 70-72.

[2] 張 維,王 斌,周 麗,等.羅漢果成分及藥理研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技, 2014, 35(12):393-397.

[3] 陳全斌,楊瑞云,義祥輝,等. RP-HPLC法測(cè)定羅漢果鮮果及甜甙中總黃酮含量[J].食品科學(xué), 2003, 24(5): 133-135.

[4] 陳全斌,義祥輝,余麗娟,等.不同生長(zhǎng)周期的羅漢果鮮果中甜甙V和總黃酮含量變化規(guī)律研究[J].廣西植物, 2005, 25(3):274-277.

[5] 熊綿靖.羅漢果皂苷V提取工藝改進(jìn)及高產(chǎn)品種篩選[D].南寧:廣西大學(xué), 2012.

[6] 黃錫山.羅漢果化學(xué)成分的研究[D].桂林:廣西師范大學(xué), 2007.

[7] Qi X. Y., Chen W. J. , Liu L. G. , et al. Effect of a Siraitia grosvenori extractcontaining mogrosides on the cellular immune system of type 1 diabetes mel1itusmice[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2006, 50(13):732-738.

[8] Hanan S El-Abhar,Mona F Schaalan. Phytotherapy in diabetes: Review on potential mechanistic perspectives[J].World Journal of Diabetes,2014,05(02):176-197.

[9] 熊綿靖,唐其,馬小軍.羅漢果三萜皂苷生物合成規(guī)律研究探討[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào),2011, 27(5): 544-548.

[10] 饒 榮.羅漢果的果實(shí)與其莖葉提取物質(zhì)量分析及藥效學(xué)比較研究[D].武漢:湖北中醫(yī)藥大學(xué), 2012.

[11] 陳 瑤,范小兵,王永祥等.羅漢果甜苷的止咳祛痰作用研究[J].中國(guó)食品添加劑, 2006, 13(1): 41-43.

[12] 和衛(wèi)賓.羅漢果葉黃酮對(duì)力竭性運(yùn)動(dòng)大鼠免疫功能的影響[D].桂林:廣西師范大學(xué), 2013.

[13] 李 倩,饒力群,王輔恒等.羅漢果苷V提取條件優(yōu)化研究[J].食品與機(jī)械,2011,27(4):48-50.

(本文文獻(xiàn)格式：劉 雯，王志宏，楊裴慶，等.不同果齡羅漢果中甜苷含量分布研究[J].山東化工，2017，46(12)：12-15，17.)

The Research to Different Fruit Age ofMogrosides in Distribution and Separation

LiuWen,WangZhihong,YangPeiqing,CuiLijie,LiShanshan，LiGuiyin，ZhouZhide*

(School of Life and Environmental Sciences of Guilin University of Electronic Technology , Guilin 541004,China)

Objective Study of the test method and content distribution of Mogroside IV and Mogroside V from different fruit age of Momordica grosvenori. Methohd By means of ultrasonic assisted extraction and the D101 macroporous adsorption resin extract mogroside from different fruit age of Momordica grosvenori. Mogrosides is determined by HPLC method including the content of Mogroside IV and Mogroside V. Results Mogrosides is tested by HPLC method. It's easy to apart from the figure between Mogroside IV and Mogroside V. The content of Mogroside IV is increasing from the age of 30 days to 50 days ,decreasing after 50 days ,and hitting the minimum after 70 days. The content of Mogroside V is increasing from the age of 30 days to 70 days and maintaining after the age of 70 days. Conclusion The method of HPLC can test the content of Mogroside IV and Mogroside V at the same time and figure out regularities of distribution between Mogroside IV and Mogroside V from different fruit age of Momordica grosvenori.

fruit age; mogroside IV ; mogroside V; content

2017-04-22

廣西科技廳項(xiàng)目(桂科重1598005-3，2016GXNSFAA380011)，大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(C66JWA24SM16)

劉 雯(1995-)，女，研究方向：植物提取；通信作者：周治德(1971—)，高工，研究方向：植物提取與知識(shí)產(chǎn)權(quán)。

O657.7

A

1008-021X(2017)12-0012-04