地衣芽孢桿菌發酵土鱉蟲前后水溶性活性物質含量比較及抗凝血活性

王立娜，王 穎，朱明珠，桑 曉，毛會秀，邢佰穎，孫 鵬

(山東中醫藥大學 藥學院,山東 濟南 250355)

地衣芽孢桿菌發酵土鱉蟲前后水溶性活性物質含量比較及抗凝血活性

王立娜，王 穎，朱明珠，桑 曉，毛會秀，邢佰穎，孫 鵬*

(山東中醫藥大學 藥學院,山東 濟南 250355)

目的：比較未發酵和經地衣芽孢桿菌發酵后蛋白質、多糖含量的差別，并研究土鱉蟲經地衣芽孢桿菌發酵后的抗凝血活性；方法：通過改良Lowry 法、苯酚-硫酸法分別測定蛋白質、多糖含量，以凝血酶原時間 (PT)、部分活化凝血活酶時間 (APTT) 、凝血酶時間 (TT) 為指標評價抗凝血活性。結果：水溶性蛋白質發酵前后含量為65.2061 mg/g，55.9015 mg/g，多糖為46.9724 mg/g，84.8736 mg/g；發酵后能顯著延長小鼠的 APTT、TT值，但對PT 值則無明顯影響。結論：土鱉蟲經地衣芽孢桿菌發酵后能顯著提高多糖含量，明顯降低蛋白質含量，并且發酵后具有更強的抗凝效果。

地衣芽孢桿菌；土鱉蟲；活性物質；抗凝血

土鱉蟲又名地鱉、土別蟲，是鱉蠊科昆蟲地鱉(Eupolyphaga sinesis Walker)或冀地鱉(Eupolyphaga sinesis(Boleny))的雌蟲干燥體[1]，性寒味咸，通心肝脾，是傳統的活血化瘀類中藥[2]。地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)，屬芽孢桿菌科細菌，為革蘭氏陽性桿菌[3]，能產生多種營養物質，如纖溶酶。蟲類中藥發酵是生物轉化技術的最新應用，其微生物通過本身含有或者經生物轉化產生的酶及其強大的分解轉化能力，不僅可以對培養基中的纖維、糖類和蛋白加以利用[4]，而且在代謝的過程中可以對中藥中的成分進行轉化修飾，把一些難以吸收的大分子蛋白質、糖類分解成葡萄糖氨基酸，易于吸收[5]。且研究表明，中藥紅花經地衣芽孢桿菌C2-13發酵炮制后，可以明顯使內源性及外源性凝血系統得到抑制，纖溶酶活性顯著提高[6]。受此啟發，本實驗以地衣芽孢桿菌為發酵菌，土鱉蟲粉為底物，進行雙向固體發酵，比較其發酵前后水溶性蛋白質、多糖的含量差異，為其發酵過程中有效成分的鑒別提供依據，以及研究土鱉蟲經地衣芽孢桿菌發酵后抗凝血活性，并與未發酵土鱉蟲粉作為對比，探究其抗凝活性是否有所提高，為抗凝血活性成分的制備和新藥研發提供新思路和新方法，豐富蟲類中藥發酵炮制的研究。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級小鼠，雄性，體質量(18-20)g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供。

1.2 藥品與試劑

土鱉蟲粉(山東中醫藥大學實驗室自制，批號20160821)，經山東中醫藥大學高德民老師鑒定為鱉蠊科昆蟲地鱉；地衣芽孢桿菌活菌膠囊(東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司)；復方丹參片(山東仙河藥業有限公司)；水合氯醛(天津市大茂化學試劑廠)；枸櫞酸鈉；活化部分凝血活酶時間(APTT)測試盒(武漢中太生物技術有限公司)；凝血酶原時間(PT)測試盒(武漢中太生物技術有限公司)；凝血酶時間(TT)測試盒(武漢中太生物技術有限公司)；牛血清蛋白(BSA，國藥集團化學試劑有限公司)；福林酚(國藥集團化學試劑有限公司)、碳酸鈉、酒石酸鉀、無水硫酸銅、氫氧化鈉皆為分析純。

1.3 實驗儀器

高速冷凍離心機(賽默飛世爾科技有限公司)；UV9100B型可見分光光度計(北京萊伯泰科儀器有限公司)； KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；FA1004N型電子分析天平(上海精密儀器有限公司)；半自動凝血儀(南京瑞邁科技有限公司)。

2 方法

2.1 地衣芽孢桿菌發酵土鱉蟲粉的制備

精密稱取一定量的土鱉蟲干粉，加入活的地衣芽孢桿菌菌粉，并且加少量嗜酸乳酸桿菌來抑制霉菌的生長，用一定的量滅菌水將其稀釋成為含2×108個孢子的混懸液，取適量，拌勻潤濕，在35～37℃，濕度為40%，在恒溫恒濕滅菌培養箱中發酵2天左右，待其表面長滿白色的菌絲后停止發酵。

2.2 水溶性活性物質制備

稱取未土鱉蟲粉、地衣芽孢桿菌發酵土鱉蟲粉各100g加20倍量蒸餾水，超聲提取10 min，抽濾，傾出濾液，重復上述步驟1次，將2次所得抽濾液混合,3000 r/min，離心，冷凍干燥成粉。

2.3 蛋白質含量的測定[7]

2.3.1 牛血清蛋白標準曲線制備

取六支干燥潔凈試管，分別編號，各自精密加入標準溶液0 ,0.2 ,0.4 ,0.6 ,0.8 ,1 mL，添加蒸餾水補充至1 mL，搖勻，立即加入5 mL堿性銅溶液，混勻靜置10 min，然后加入0.5 mL福林酚試劑，混勻靜置30 min，在可見光下660 nm處測定吸光度。以質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，Y=1.7984X+0.0049,R2=0.9983。

2.3.2 樣品蛋白質含量的測定

分別精密稱取10 mg未發酵土鱉蟲和地衣芽孢桿菌發酵土鱉蟲水提液凍干粉，用一定量的蒸餾水溶解，定容到10 mL 容量瓶中，取1 mL 溶液，其余步驟同2.3.1"自立即加入5 mL"起 在660 nm 下測定吸光度，帶入標準曲線求得濃度，見表1。

2.4 多糖含量的測定[7]

2.4.1 葡萄糖標準曲線的制備

分別精密吸取0 ,1.0 ,2.0 ,3.0 ,4.0 ,5.0 mL葡萄糖標準溶液于10 mL 容量瓶中，加水定容，編號。分別吸取2.0 mL 溶液于具塞試管，精密加入5 %的苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻，并在40℃下水浴保溫15 min，照紫外可見分光光度計490 nm處測定吸光度，繪制標準曲線，Y=1.8557X-0.0158,R2=0.9986。

2.4.2 樣品多糖含量的測定

稱取未發酵土鱉蟲和發酵土鱉蟲水提液凍干粉10 mg，加適量的蒸餾水溶解，定容到10 mL 容量瓶中，取2 mL 溶液，其余步驟同2.4.1“自精密加入5%的苯酚溶液1 mL”起 在490 nm 下測定吸光度，帶入標準曲線求得濃度，見表1。

2.5 蛋白質與多糖含量

表1 土鱉蟲發酵前后活性成分的含量對比

注：土鱉蟲發酵前后水溶性活性成分含量比較**P<0.01，*p<0.5

由表1可知土鱉蟲蛋白質經地衣芽孢桿菌發酵后，明顯減少，這可能是由于蛋白質在發酵的過程中被轉化修飾或者被分解為其他小分子物質，如氨基酸。而多糖發酵后的含量與發酵前相比則具有極顯著差異，呈現明顯增加的趨勢，表明了土鱉蟲中的某些成分在與地衣芽孢桿菌發生相互作用后可以促進活性物質的產生，如多糖。

2.6 PT、APTT、TT 的測定[8]

取SPF級小鼠 60 只，分為 6 組，每組各10 只，分別為空白對照組(蒸餾水)、丹參對照組、發酵后高劑量組(900 mg/kg)、發酵后中劑量組(450 mg/kg)、發酵后低劑量組(225 mg/kg)，發酵前高劑量組(900 mg/kg)，各組小鼠連續給7 d，每日給藥 1 次，給藥體積為 1 ml/100g。于最后一次給藥 1h 后，用 10% 水合氯醛腹腔麻醉，眼球取血，0.109 mol/L 枸椽酸鈉 1:9抗凝，3000 r/min 離心 10 min，取上清液，參照試劑盒操作步驟，應用半自動血液凝固分析儀依次測定 PT、APTT 、TT，見表2。

表2 土鱉蟲地芽孢桿菌發酵物抗凝血活性( X±S)

注：**P<0.01，*p<0.5

表2表明，與空白對照組比較，土鱉蟲經地衣芽孢桿菌發酵后能顯著延長小鼠的 APTT、TT值(P<0.01)，但對PT 值無顯著性影響，提示地衣芽孢桿菌發酵物可能是通過抑制內源性系統以及促使血漿纖維蛋白原轉變為纖維蛋白而發揮抗凝作用的。

3 討論

本實驗通過測定APTT、PT 和 TT三個指標檢測土鱉蟲經地衣芽孢桿菌發酵后對抗凝血作用的強度。發酵后低劑量組有一定程度的抗凝血效果，但當增大給藥濃度，抗凝作用逐漸增強，與空白對照組比較具有顯著性差異。發酵后高劑量組與發酵前高劑量組相比，發酵炮制后的土鱉蟲能明顯提高抗凝作用。PT主要反映外源性凝血系統的作用，但是在本試驗中，土鱉蟲發酵后，對PT并無顯著的影響，而對APTT、TT則能顯著延長其作用時間，表明了土鱉蟲發酵炮制后并不是通過阻止外源性凝血系統的途徑來抑制凝血過程，從而發揮抗凝作用，但是真正影響抗凝血的機制還需要進一步研究。

[1] 王鳳霞. 中華真地鱉(Eupolyphaga sinensis)抗腫瘤蛋白分離純化及其體外抗轉移活性研究[D].濟南：山東大學,2013.

[2] 蘇永華. 活血化瘀土鱉蟲[N].上海中醫藥報,2013-09-27(004).

[3] 李福彬. 地衣芽孢桿菌的理化特性及對蛋雞生產性能影響機理的研究[D].保定：河北農業大學,2010.

[4] 王立娜,馬明珠,王 穎,等. 中藥土鱉蟲發酵前后活性成分的含量對比[J].湖南中醫雜志,2016,32(8):200-202.

[5] 劉亞明.發酵技術在中醫藥中的應用[M]. 北京: 中國中醫出版社,2010:17.

[6] 馮志華. 產纖溶酶地衣芽孢桿菌與中藥紅花相輔相成作用的研究[D].成都：四川大學,2004.

[7] 藥典委員會. 中華人民共和國藥典[四部]. 北京: 中國醫藥科技出版社, 2015: 96.

[8] 王 娜,馮艷風,范會平,等. 大棗粗多糖體外抗凝血活性的差異化研究[J].中國食品學報,2013,13(12):34-39.

(本文文獻格式：王立娜，王 穎，朱明珠，等.地衣芽孢桿菌發酵土鱉蟲前后水溶性活性物質含量比較及抗凝血活性[J].山東化工，2017，46(10)：102-104.)

The Comparison of Active Ingredients for Fermented and UnfermentedEupolyphaga Sinesis Walker by Bacillus Licheniformis and the Anticoagulant Activity

WangLina,WangYing,ZhuMingzhu,SangXiao,MaoHuixiu,XingBaiying,SunPeng*

(1.College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine,Jinan 250355, China)

Objective: To compare the protein and polysaccharide content between unfermented and fermented, and to research the anticoagulant activity of Eupolyphaga sinesis Walke after fermentation of Bacillus licheniformis; Methods: By using the improved Lowry method and sulfuric acid method to deteimine the content of protein and phenol.To investigate the role of anticoagulant activity about the prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), thrombin time (TT) the prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), thrombin time (TT). Results: The Eupolyphaga sinesis Walker before fermentation of water soluble protein content was 65.2061 mg/g, 55.9015 mg/g after fermentation, the polysaccharide content before fermentation was 46.9724 mg/g. After fermentation was 84.8736 mg/g; And The Eupolyphaga sinesis Walker after fermentation of Bacillus licheniformis could significantly prolong the mice of APTT, TT, but had no obvious effect on PT. Conclusion: The Eupolyphaga sinesis Walker after fermentation of Bacillus licheniformis can obviously increase the content of polysaccharide and significantly decrease the content of protein. And it has stronger anticoagulant effect after fermentation.

bacillus licheniformis;eupolyphaga sinesis walker; aactive ingredients; anticoagulant

2017-03-27

2016年國家級大學生創新創業訓練計劃項目(項目編號：201610441045);山東中醫藥大學大學生研究訓練(SRT)計劃資助項目(項目編號：2016052)

王立娜，女，研究方向制藥工程;通信作者：孫 鵬，研究方向 ：中藥活性成分與活性評價。

R284.1

A

1008-021X(2017)10-0102-03