六堡茶總黃酮對小鼠化學性肝損傷的保護作用

錢波，周燕園，王程強，任源，顧廉潔，宋家樂，3，4，*

（1.桂林醫學院公共衛生學院/預防醫學研究所，廣西桂林541000；2.廣西高校預防醫學重點實驗室，廣西桂林541000；3.CHA醫科大學食品生命工學系/生物技術研究所，韓國抱川11160；4.重慶市功能性食品協同創新中心，重慶400067）

六堡茶總黃酮對小鼠化學性肝損傷的保護作用

錢波1，2，周燕園1，王程強1，2，任源1，2，顧廉潔1，宋家樂1，2，3，4，*

（1.桂林醫學院公共衛生學院/預防醫學研究所，廣西桂林541000；2.廣西高校預防醫學重點實驗室，廣西桂林541000；3.CHA醫科大學食品生命工學系/生物技術研究所，韓國抱川11160；4.重慶市功能性食品協同創新中心，重慶400067）

探討六堡茶總黃酮（LBTFE）對小鼠化學性肝損傷的保護作用及機制。給予肝損傷小鼠不同劑量LBTFE灌胃15 d后，測定體重并計算肝臟指數。檢測血清肝功能相關指標酶（天門冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶）和炎性因子（腫瘤壞死因子-α和白介素-6）水平。測定肝臟超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、過氧化氫酶和丙二醛及離子通道酶活性。LBTFE能降低肝損傷小鼠血清肝功能相關指標酶、炎性因子和肝臟丙二醛水平。LBTFE還能增強抗氧化物酶，谷胱甘肽及離子通道酶的活力（p＜0.05）。結果顯示，LBTFE對小鼠化學性肝損傷有一定程度的保護作用，其機制可能與增強內源性抗氧化系統和調控離子通道酶的活性有關。

六堡茶；總黃酮；化學性肝損傷；抗氧化；ATP酶

六堡茶為我國傳統茶葉制品中黑茶的一種，原產于廣西壯族自治區蒼梧縣六堡鄉并因此得名[1]。在制茶工藝上，六堡茶屬富含礦物質的后發酵茶[2-3]。其湯紅味醇并具有檳榔口味，廣西當地群眾認為其是具有減肥、降脂療效的健康保健飲品，銷量不斷增加。近年的科學研究發現，六堡茶具有較好的抗氧化[4]、降血脂[5-6]、提高免疫力[7-8]，降低胰島素抵抗[9]、抗凝血[9]以及抗衰老[10]等多種生物學功效。

氧化應激所引發的肝臟損傷及炎癥反應是肝臟疾病發生的重要原因之一[11]。為進一步開發和利用六堡茶資源。本研究擬通過建立在保肝藥物活性篩選實驗中常用的CCl4誘導的化學性肝損傷動物模型[12]來觀察六堡茶總黃酮對化學性肝損傷的保護作用，為六堡茶的產業發展提供一定的試驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

成年昆明小鼠 42只，雄性，體重（20±2）g，由桂林醫學院實驗動物中心提供（許可證號：SCXK桂2013-0001），置于桂林醫學院公共衛生學院動物房進行飼養（室溫18℃～22℃，濕度60%～70%）。

1.2 實驗試劑

六堡茶（生產年份：2015年8月）：廣西梧州六堡茶廠；水飛薊素膠囊（每片含水飛薊素38.5 mg，批號：20160506）：上海朝輝制藥廠；四氯化碳CCl4（國產分析純）：濟南宏巨化工有限公司；冬氨酸氨基轉移酶（aspartate transaminase，AST）、丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）、超氧化物歧化酶（su peroxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、離子通道酶（Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase）酶測定試劑盒：南京建成生物工程研究所，其他化學試劑為國產分析純。

1.3 儀器與設備

EYELA N-1001S真空旋轉蒸發儀：日本東京理化器械株式會社；Eppendorf 5424R冷凍離心機：德國Eppendorf公司；ELx808酶標儀：美國BioTek公司。

1.4 六堡茶總黃酮乙醇提取物的制備

取經冷凍干燥后的六堡茶粉碎品100 g，依料液比1∶25（g/mL）比例，加入60%的乙醇溶液混合提取3次，每次提取1.5 h[13]。在4 000 r/min的速度下將所以提取液離心20 min后收集上清液。低溫旋轉蒸發制備得六堡茶總黃酮提取物，并將提取物抽真空包裝后置于-80℃條件下保管待用。經三氯化鋁比色法測定六堡茶提取物中總黃酮含量為3.57%[10]。

1.5 實驗方法

總42只小鼠適應性飼養1周后。禁食8h后，所有小鼠隨機分為正常對照組、CCl4模型組、水飛薊陽性對照組、六堡茶總黃酮提取物低、中、高劑量組，每組7只。除正常對照組小鼠外，其他小鼠均按照10 mL/kg的劑量一次性腹腔注射0.1%的CCl4溶液（以玉米油配制）建立小鼠化學性肝損傷模型。造模成功后，六堡茶總黃酮低、中、高處理組分別經口給予50、100、200 mg/kg六堡茶總黃酮提取物灌胃處理。水飛薊組給予50 mg/kg劑量灌胃處理，正常對照組和CCl4模型組給予等容量的蒸餾水，每天1次，連續15 d。末次給藥后禁食12 h，實驗動物乙醚麻醉后自腹部中央靜脈處取血，3 000 r/min離心15 min制備血清。依照試劑盒說明書用比色法測定肝臟損傷指標酶AST、ALT、ALP、LDH水平及炎性細胞因子TNF-α、IL-6的含量。在超凈臺無菌狀態下取出已犧牲小鼠的肝臟，用預冷的生理鹽水制備10%肝勻漿，3 000 r/min離心15 min后取上清液比色法測定肝臟中SOD、GSH、CAT、MDA水平及Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活性，詳見試劑盒操作方法。

1.6 統計學處理

數據應用SPSS17.0統計軟件分析，實驗結果均以均數加減標準差表示（所有實驗均重復3次），用單因素方差分析（ANOVA）進行多組之間均數的差異性檢驗，p＜0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 六堡茶總黃酮提取物對實驗小鼠體重以及一般狀態的影響

六堡茶總黃酮對CCl4誘導化學性肝損傷小鼠體重、肝臟重量以及肝臟臟器指數的影響見表1。

如表1所示，CCl4模型組與正常組相比，體重、肝臟重量、肝臟臟器指數均出現明顯升高（p＜0.05）。六堡茶總黃酮提取物100、200 mg/kg組與CCL4模型組相比，小鼠肝臟重量和肝臟臟器指數顯著降低（p＜0.05）。

2.2 六堡茶總黃酮提取物對CCl4誘導肝損傷小鼠血清AST、ALT、ALP和LDH水平的影響

氧化損傷和炎癥反應的發生是CCl4引起肝臟損傷的主要機制。CCl4在細胞色素氧化酶P450作用下生成大量自由基引起生物膜功能與結構被破壞，造成肝臟細胞壞死，并最終導致肝臟炎癥的發生及肝臟細胞中大量壞死性生物酶釋放入血[14]。六堡茶總黃酮對CCl4誘導肝損傷小鼠血清AST、ALT、ALP和LDH水平的影響見表2。

表1 六堡茶總黃酮對CCl4誘導化學性肝損傷小鼠體重、肝臟重量以及肝臟臟器指數的影響Table 1 Effect of Liubao tea total flavonoid on body weight，liver weight and liver index in CCl4-treated mice

表2 六堡茶總黃酮對CCl4誘導肝損傷小鼠血清AST、ALT、ALP和LDH水平的影響Table 2 Effect of Liubao tea total flavonoid on the serum levels of AST，ALT，ALP and LDH in CCl4-treated mice

如表2所示，模型組小鼠血清中ALT、AST、ALP、LDH水平較正常組小鼠呈顯著升高趨勢（p＜0.05）。六堡茶總黃酮100、200 mg/kg組中的血清ALT、LDH的水平及六堡茶總黃酮提取物各劑量組中的AST、ALP水平與模型組相比均出現顯著降低（p＜0.05）。

2.3 六堡茶總黃酮對CCl4誘導肝損傷小鼠血清TNF-α和IL-6水平的影響

體內自由基過多蓄積可以激活肝庫普弗細胞內NF-κB介導的信號通路并產生大量的TNF-α、白介素等促炎癥細胞因子進而引發肝臟炎癥反應[15]。六堡茶總黃酮對CCl4誘導肝損傷小鼠血清TNF-α和IL-6水平的影響見表3。

表3 六堡茶總黃酮對CCl4誘導肝損傷小鼠血清TNF-α和IL-6水平的影響Table 3 Effect of Liubao tea total flavonoid on the serum levels of TNF-α and IL-6 in CCl4-treated mice

如表3所示，模型組小鼠血清炎性細胞因子TNF-α和IL-6的水平較正常組小鼠顯著升高（p＜0.05），六堡茶總黃酮100、200 mg/kg組血清中TNF-α和IL-6水平與模型組相比均出現明顯降低（p＜0.05）。

2.4 六堡茶總黃酮對CCl4誘導肝臟損傷后肝臟氧化損傷指標酶活性的影響

氧化應激導致的生物膜破壞是CCl4引起肝臟損傷主要原因[11]。抗氧化物酶SOD和CAT以及非酶抗氧化物質GSH所構成的內源性抗氧化系統是機體防御自由基導致的氧化應激損傷的重要參與者[16]。SOD負責將機體內自由基轉化為過氧化氫，而CAT、GSH又將過氧化氫降解為水，以此構成了抗氧化防御鏈[17]。六堡茶總黃酮對CCl4誘導肝損傷小鼠肝臟SOD、GSH、CAT和MDA水平的影響見表4。

如表4所示，CCl4模型組與正常組相比抗氧化酶SOD和CAT的活性，GSH水平出現不同程度降低（p＜0.05），脂質過氧化物產物MDA水平顯著升高（p＜0.05）。六堡茶總黃酮200 mg/kg組肝臟組織中SOD、CAT酶活性，GSH水平與CCl4模型組相比出現顯著升高（p＜0.05），同時六堡茶總黃酮各劑量組肝臟組織中MDA水平也顯著降低（p＜0.05）。

表4 六堡茶總黃酮對CCl4誘導肝損傷小鼠肝臟SOD、GSH、CAT和MDA水平的影響Table 4 Effect of Liubao tea total flavonoid on the liver levels of SOD，GSH，CAT and MDA in CCl4-treated mice

2.5 六堡茶對CCl4誘導肝臟損傷后離子通道酶的影響

肝損傷的機制十分復雜，近年有研究顯示CCl4會通過自由基的產生抑制離子通道酶的活性進而導致細胞的壞死[18]。離子通道酶Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase存在于內質網膜、線粒體膜和細胞膜上，它們對維持細胞正常代謝，保證細胞內離子平衡等生物學功能具有重要作用。Ca2+/Mg2+-ATPase酶活性受到抑制后會使Ca2+內流增加而引起細胞內Ca2+超載，導致線粒體內能量代謝障礙、膜電位降低，引起組織中ATP含量下降，激發胞漿內磷脂酶、蛋白酶等酶而引起一系列的細胞損傷[19]。肝臟細胞由于是體內物質合成代謝的主要器官，存在較多的線粒體。Na+/K+-ATPase是維持線粒體膜流動性正常的關鍵酶，其活性下降會引起胞內Na+超載進而激活Na+-Ca2+交換蛋白，加重胞內Ca2+超載，阻礙線粒體膜的正常流動性，從而造成線粒體功能障礙[20]。六堡茶總黃酮對CCl4誘導肝損傷小鼠肝臟Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase水平的影響見表5。

表5 六堡茶總黃酮對CCl4誘導肝損傷小鼠肝臟Na+/K+-ATPase和Ca2+/Mg2+-ATPase水平的影響Table 5 Effect of Liubao tea total flavonoid on the liver levels of Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase in CCl4-treated mice

如表5所示，CCl4模型組與正常組相比離子通道酶Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase活性出現降低（p＜0.05）。六堡茶總黃酮200 mg/kg處理組中Ca2+/Mg2+-ATPase活性和六堡茶總黃酮100、200 mg/kg組中Na+/K+-ATPase的活性與CCl4模型組相比均出現升高（p＜0.05）。

3 結論

本研究中，我們發現六堡茶總黃酮能有效降低CCl4所致肝損傷小鼠體內肝功能相關指標酶（ALT、AST、ALP、LDH）和血清炎性因子（TNF-α、IL-6）水平。同時，六堡茶總黃酮也可以抑制小鼠受損肝臟組織發生氧化損傷（即抑制MDA水平的升高）。此外，六堡茶總黃酮還能有效地提高肝損傷小鼠肝臟中抗氧化物酶（SOD、CAT）活性和非酶抗氧化物質GSH的含量，并同時上調Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase這兩種離子通道酶的活性。綜合上述，結果提示六堡茶總黃酮可能主要通過增強小鼠肝臟中內源性抗氧化體系的活力和通過調控Na+/K+-ATPase、Ca2+/Mg2+-ATPase的活性來緩解CCl4對肝臟所造成的損傷。

[1] 蘇悅娟,孔瓔紅,孔祥軍,等.茶葉生態原產地產品保護分析-以六堡茶為例[J].食品研究與開發,2014,35(10):124-128

[2] 韋靜峰,文兆明.廣西六堡茶[J].廣西農學報,2008,23(3):45-47

[3] 張雪紅,謝蘭強,黃淑媛.輻照和充氧處理對六堡茶中礦物質含量的影響[J].食品研究與開發,2011,32(9):23-26

[4] 郝再彬,吳瓊,蔣澤軍,等.廣西六堡黑茶生物學功效的研究[J].東北農業大學學報,2013,44(11):68-72

[5] 黃宇聲,張栩顏,劉冠萍,等.六堡茶降脂作用試驗研究[J].中國保健營養,2013(3):875-876

[6] 黃麗,彭靜靜,夏寧,等.六堡茶調節高血脂癥與抗凝血的功能特性研究[J].食品科技,2013,38(8):123-128

[7] 鄧聿胤,黃宇聲,劉冠萍,等.六堡茶對小鼠免疫功能的影響[J].云南中醫中藥雜志,2013,34(2):50-51

[8] 劉冠萍,黃宇聲,張栩顏,等.六堡茶對小鼠免疫功能的影響[J].中國醫藥指南,2013,11(3):484-485

[9] 滕翠琴,劉仲華,龔受基,等.六堡茶對胰島素抵抗3T3-L1脂肪細胞糖脂代謝的影響[J].茶葉科學,2014,34(3):230-238

[10]宋家樂,周燕園,趙超超,等.六堡茶總黃酮對老齡小鼠抗氧化功能的影響[J].食品研究與開發,2016,37(20):173-176

[11]吳娜,蔡光明,何群.氧化應激與肝臟損傷[J].世界華人消化雜志,2008,16(29):3310-3315

[12]Weber LWD,Boll M,Stampfl A.Hepatotoxicity and Mechanism of Action of Haloalkanes:Carbon Tetrachloride as a Toxicological Model[J].Critical Reviews in Toxicology,2003,187(2):511-517

[13]羅艷,蘇志恒,蔣艷萍.六堡茶中總黃酮的提取工藝研究[J].食品工業,2014,35(1):161-164

[14]Karakus E,Karadeniz A,Simsek N,et al.Protective effect of Panax ginseng against serum biochemical changes and apoptosis in liver of rats treated with carbon tetrachloride(CCL4)[J].J Hazard Mater,2011,195(1):208-213

[15]Yang BY,Zhang XY,Guan SW,et al.Protective Effect of Procyanidin B2 against CCl4-Induced Acute Liver Injury in Mice[J].Molecules,2015,20(7):12250-12265

[16]Bachschmid MM,Schildknecht S,Matsuir R,et al.Vascular aging:chronic oxidative stress and impairment of redox signaling-consequences for vascular homeostasis and disease[J].Ann Med,2013,45(1):17-36

[17]Wang X,Wang W,Li L,et al.Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease[J].BiochimBiophysActa,2014,1842(8):1240-1247

[18]韓志強,巴圖德力根,娜日蘇,等.蒙藥德都紅花-7味散對慢性肝損傷大鼠肝組織SOD,MDA及肝線粒體鈉鉀ATP酶活性的影響[J].中華中醫藥學刊,2013(5):1076-1078

[19]陳振興,趙瑞芝.醋柴胡不同部位對肝郁模型大鼠肝臟Na+-K+ATP酶、Ca2+-Mg2+ATP酶活性及P-糖蛋白mRNA表達的影響[J].中國中醫藥雜志,2016(9):3721-3724

[20]Shattock MJ,Ottolia M,Bers DM,et al.Na+/Ca2+exchange and Na+/K+-ATPase in the heart[J].J Physiol,2015,593(6):1361-1382

Protective Effect of Liubao Tea Total Flavonoid on Chemical Induced Liver Injury Mice

QIAN Bo1，2，ZHOU Yan-yuan1，WANG Cheng-qiang1，2，REN Yuan1，2，GU Lian-jie1，SONG Jia-le1，2，3，4，*
（1.School of Public and Health/Institute of Preventive Medicine，Guilin Medical University，Guilin 541000 Guangxi，China；2.Guangxi Colleges and University Key Laboratory of Preventive Medicine，Guilin 541000 Guangxi，China；3.Department of Food Science and Biotechnology/Institute of Biotechnology，CHA Medical University，Pocheon 11160，Korea；4.Chongqing Collaborative Innovation Center of Functional Food，Chongqing 400067，China）

To study the protective effect of Liubao tea total flavonoid（LBTFE）on chemical induced liver injury mice，the treated mice were treated with different dose of LBTFE for 15 days.The body weight and liver index was measured at the end of experimental period.The serum levels of aspartate transaminase （AST），alanine aminotransferase（ALT），alkaline phosphatase（ALP），lactate dehydrogenase（LDH）and tumor necrosis factor（TNF）-α，interleukin（IL）-6 were determined by commercial assay kits.Hepatic levers of superoxide dismutase（SOD），catalase（CAT），glutathione（GSH），malondialdehyde（MDA），and Na+/K+-ATPase，Ca2+/Mg2+-ATPase were determined by commercial assay kits.LBTFE treatment reduced the serum levels of ALT，ALP，LDH，TNF-α，IL-6 and MDA in liver damage mice.LBTFE also increased the liver levels of SOD，CAT，GSH and Na+/K+-ATPase，Ca2+/Mg2+-ATPase in liver damage mice（p＜0.05）.These results suggested that the LBTFE exhibited a protective effect to against the liver injury may associated with the increasing of endogenous antioxidant system and regulating the activity of Na+/K+-ATPase and Ca2+/Mg2+-ATPase in chemical induced liver damage mice.

Liubao tea；total flavonoid；chemical liver injury；antioxidant；ATPase

2016-12-29

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.038

廣西壯族自治區教育廳中青年教師基礎能力提升項目（KY2016YB328、KY2016YB321）；廣西壯族自治區“大學生創新創業訓練計劃”資助項目（201510601076,201510601080）；桂林醫學院引進人才科研啟動基金（04010150001）

錢波（1989—），男（漢），講師，碩士，研究方向：食品毒理學。

*通信作者：宋家樂（1983—），男（漢），副教授，博士，研究方向：功能性食品學。