人參瑪咖片對運動小鼠抗疲勞活性的實驗研究

王雪，張欣蕊，安升淑，吳紅紅，姜雪，康杰，華正杰，張馨元，周毓麟，*

（1.吉林大學生命科學學院，吉林長春130012；2.通化百泉保健食品有限公司，吉林通化134000；3.吉林省社會科學院日本研究所，吉林長春130033）

人參瑪咖片對運動小鼠抗疲勞活性的實驗研究

王雪1，張欣蕊1，安升淑1，吳紅紅1，姜雪1，康杰2，華正杰2，張馨元3，周毓麟1，*

（1.吉林大學生命科學學院，吉林長春130012；2.通化百泉保健食品有限公司，吉林通化134000；3.吉林省社會科學院日本研究所，吉林長春130033）

研究人參瑪咖片對運動小鼠的抗疲勞作用。試驗設置人參瑪咖片3個劑量組和空白對照組，通過自主活動、疲勞轉棒、耐力跑及負重游泳試驗，考察人參瑪咖片對小鼠耐力的影響，通過檢測小鼠游泳前和游泳后即刻血清和肝臟中三磷酸腺苷（ATP）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、睪酮（T）、雌二醇（E2）和孕酮（PROG）水平，探究人參瑪咖片的抗疲勞作用機制。結果表明：自主活動實驗表明人參瑪咖片對小鼠中樞神經系統沒有損傷。與空白對照組相比，人參瑪咖片能夠顯著的延長小鼠轉棒、耐力跑及負重游泳力竭時間。與空白對照組相比，人參瑪咖片顯著提高了游泳后雌雄小鼠血清中ATP水平，同時顯著提高了血清和肝臟中T-SOD和GSH-Px水平。與空白對照組相比，人參瑪咖片提高了雌雄小鼠游泳后性激素T和PROG的水平。綜合以上實驗結果得知，人參瑪咖片具有提高運動耐力和緩解疲勞的功效，這一作用可能與其抑制脂質過氧化損傷有關，同時能夠改善小鼠體內性激素的分泌。

人參瑪咖片；抗疲勞；性激素；小鼠

疲勞是一個十分復雜的生理病理現象，是機體腦力和體力活動到一定程度必然發生的，并受到多種因素的影響[1-2]。疲勞實際上是一種防止機體發生對生命造成威脅的機能衰竭而產生的保護性機制，同時也是機體發展成病理狀態的前兆[3-4]。疲勞感在體內逐漸積累會導致過度緊張、內分泌失調，免疫系統功能低下，甚至臟器的病變[5]。近年來，在民間醫學和現代科學實驗基礎上，不少學者在尋求抗疲勞藥物方面做了大量的工作，特別是在中藥的化學成分和作用機理的研究中，因此，在天然植物中尋找、篩選具有抗疲勞作用的有效成分、探討其作用機制具有實際意義。

人參（Panax ginseng C.A.Mey）系五加科人參，屬多年生草本植物，以根入藥，俗稱人銜、鬼蓋、地精、孩兒參等，是古今著名的滋補強壯良藥。近年來，國內外學者對人參的有效成分，進行了藥理研究、臨床觀察和流行病學調查，結果均證實人參具有改善微循環、提高組織抗缺氧能力、抑制血小板聚集、抗腫瘤、抗衰老、抗輻射、抗疲勞等多種生物活性[6]。瑪咖Lepidium meyenii（Maca），又稱“秘魯人參”或“南美人參”，為形似蘿卜的塊根類植物，屬十字花科[7]，代醫學研究證明，瑪咖具有增強生育能力、改善性功能、抗疲勞、抗氧化、抗癌等藥理作用[8-9]。目前，以瑪咖為主要原料生產的各類保健品備受消費者的關注，因此成為當前研究的熱點。但是大部分抗疲勞實驗研究都是采用單一瑪咖原粉或瑪咖提取物，對瑪咖與傳統抗疲勞中草藥復配作用效果缺乏研究。為探討人參瑪咖片的保健作用，本研究以小鼠為實驗對象，采用“保健食品功能學評價程序和檢驗方法”中抗疲勞實驗規定的方法進一步驗證人參瑪咖片的抗疲勞作用，旨在開發一種功效顯著、專門針對疲勞人群的抗疲勞制劑。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

人參瑪咖片中黑瑪咖含量60%，池底參20%，剩余輔料為木糖醇、麥芽糖及微晶纖維素。使用前用0.9%生理鹽水配成不同濃度灌胃小鼠。其劑量分別為0.4、0.8、1.6 g/kg體重，空白對照組給予等體積的0.9%生理鹽水。

1.2 實驗動物和檢測條件

實驗動物：選用SPF級健康昆明品系小鼠160只，雌雄各半，質量18 g～22 g，由遼寧長生生物技術有限公司提供（許可證號：SCXK（遼）2015-0001）。

檢測環境條件：溫度范圍20℃～25℃，相對濕度范圍40%～70%。小鼠試驗前在動物房環境中適應5 d。

1.3 材料與儀器

三磷酸腺苷（ATP）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽還原酶（GSH-Px）測定試劑盒：購自南京建成生物工程技術公司；睪酮（T）、雌二醇（E2）和孕酮（PROG）ELISA測定試劑盒：購自上海源葉生物技術公司；0.9%生理鹽水：吉林科倫康乃爾制藥有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒：Novagen，USA。SYNERGY4酶標儀：美國博騰儀器有限公司；96孔板：無錫耐思生物科技有限公司；OL-901漩渦混合器：江蘇海門市麒麟醫用儀器廠；101A-1E電熱鼓風干燥箱：上海實驗儀器廠有限公司；GSY-II恒溫水浴鍋：北京市醫療設備廠；Mini Spin高速離心機：德國Eppendorf；FT-200動物跑步機：成都泰盟科技有限公司；ZZ-6自主活動記錄儀：成都泰盟科技有限公司；ZB-200疲勞轉棒儀：成都泰盟科技有限公司。

1.4 實驗方法[10]

1.4.1 動物分組及給藥

用國家標準鋸齒類動物干燥飼料適應性喂養3 d后（室溫控制在25℃左右），將小鼠隨機均分為4組：空白對照組、人參瑪咖片低劑量組、人參瑪咖片中劑量和人參瑪咖片高劑量組，每組20只，分籠飼養。在每天固定時間段分別以 0.4、0.8、1.6 g/kg·bw 低、中、高劑量灌胃給藥，灌胃體積為0.2 mL/20 g·BW，空白對照組灌以等體積0.9%的生理鹽水，連續灌胃14 d，末次給藥后禁食2 h（可自由飲水）。參考衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范》（2003年版）中緩解體力疲勞功能檢驗方法，實驗結束后進行各項抗疲勞指標的測定。

1.4.2 自主活動實驗（曠場實驗）

將各組灌胃后小鼠置于安靜陰涼處，靜置30 min，放入自主活動箱中，蓋上避光板，使小鼠適應2 min后，記錄小鼠5 min內的站立次數和活動次數，平行3次。

1.4.3 疲勞轉棒實驗

末次給藥30 min后，將各組小鼠分別放在轉棒儀上，使肌肉處于靜力緊張狀態，轉速為20 r/min。各組小鼠進行實驗前，對其進行適當訓練，小鼠在轉棒上跌落3次后，開始記錄小鼠由于肌肉疲勞從轉棒上跌下的時間，平行3次。

1.4.4 耐力跑實驗

末次給藥30 min后，將小鼠置于FT-200動物跑步機中，放置好動物后，對小鼠進行訓練，使其了解逃離帶電區域后，將轉速設為20 r/min，電流調到最高，記錄小鼠被電擊5次的時間，以此作為力竭時間。

1.4.5 負重游泳實驗

取昆明種小鼠160只，雌雄各半。隨機分為4組，每組20只。按劑量設計連續灌胃14 d，于末次灌胃后30 min，將小鼠放入水中游泳，水深30 cm，水溫（25±0.5）℃，鼠尾根部負荷10%體重的鉛塊，記錄小鼠自游泳開始至力竭，作為小鼠的力竭游泳時間。以小鼠頭部沉水后超過8 s還無法上浮，并且放在平面上不能完成翻正反射作為力竭判斷標準。

1.4.6 血清中ATP、T-SOD和GSH-Px的測定

末次給小鼠受試物30 min后，在溫度為（25±0.5）℃的水中不負重游泳30 min。取出小鼠擦干后，立即拔眼球采血0.8 mL，離心制備血清后放于-80℃冰箱保存待測。依照各自的試劑盒測定方法進行測定。

各指標的計算公式如下：

血清中總SOD活力/（U/mL）=（測定管吸光值-對照管吸光值）÷對照管吸光度÷50%×反應體系的稀釋倍數

血清中GSH-Px酶活力（U）=（非酶管吸光值-酶管吸光值）÷（標準管吸光度-空白管吸光值）×標準管濃度（μmol/L）×稀釋倍數×樣本測試前稀釋倍數

ATP濃度（μmol/gprog）=（測定管吸光值-對照管吸光值）÷（標準吸光度-空白吸光度）×標準品濃度（μmol/L）×樣本測定前稀釋倍數÷血紅蛋白濃度（gHb/L）

1.4.7 血清中性激素T、E2和PROG的測定

末次給小鼠受試物30 min后，在溫度為（25±0.5）℃的水中不負重游泳30 min。取出小鼠擦干后，立即拔眼球采血0.8 mL，4℃放置20 min后，離心取血清，依照T、E2和PROG ELISA試劑盒測定方法，測定小鼠游泳前和游泳后即刻血清中相應的激素含量。

1.4.8 肝臟中T-SOD和GSH-Px的測定

末次灌胃給藥30 min后，每組隨機抽取10只小鼠，采用1.4.5負重游泳模型，致小鼠力竭游泳后，脫頸處死，立即取同部位的一小塊肝，稱質量，冰浴下勻漿制備成10%肝勻漿液，以3 500 r/min的轉速離心15 min，取上清，按照試劑盒上的說明測定肝臟勻漿液中的T-SOD和GSH-Px含量。

各指標的計算公式如下：

組織中總SOD活力/（U/mgprog）=（測定管吸光值-對照管吸光值）÷對照管吸光度÷50%×反應液總體積（mL）÷取樣量（mL）÷組織中蛋白含量（mgprog/mL）

組織中GSH-Px酶活力（mgprog/mL）=（非酶管吸光值-酶管吸光值）÷（標準管吸光度-空白管吸光值）×標準管濃度（μmol/L）×稀釋倍數÷反應時間（min）÷（取樣量（mL）×樣本蛋白含量（mgprog/mL））

1.5 實驗數據處理

實驗數據用平均值±標準差（X±SD）表示，統計分析采用SPSS13.0統計軟件包，相關組間比較用t檢驗，差異具顯著性水平為P＜0.05，差異具高度顯著性水平為 P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 人參瑪咖片對小鼠質量的影響

人參瑪咖片對小鼠體重的影響見表1。

表1 人參瑪咖片對小鼠體重的影響（n=10，x±sd）Table 1 Effect of PL tablet on weight of mice（n=10，x±sd）

由表1可見，經口灌胃不同劑量的樣品14 d，人參瑪咖片各劑量組小鼠在實驗初期、中期和末期體重與空白對照組比較均無顯著性差異（F檢驗，P＞0.05）。

2.2 人參瑪咖片對小鼠抗疲勞活性的影響

2.2.1 小鼠自主活動情況

人參瑪咖片對小鼠自主活動的影響見表2。

表2 人參瑪咖片對小鼠自主活動的影響（n=10，x±sd）Fig.2 Effect of PL tablet on autonomic activities of mice（n=10，x±sd）

由表2可見，經口灌胃給藥14 d后，試驗結果顯示，人參瑪咖片各劑量組與空白對照組相比，對雌雄小鼠的活動次數沒有顯著性影響，對雌雄小鼠的站立次數也沒有顯著性影響，均無統計學意義，因此，推測人參瑪咖片對小鼠中樞神經系統可能無影響即不能對中樞神經造成損傷。

2.2.2 小鼠疲勞轉棒時間

人參瑪咖片對小鼠抗疲勞活性的影響見圖1。

經口灌胃給藥14 d后，與空白對照組相比，均能延長小鼠的轉棒時間。在雌性小鼠中，低、中劑量影響極為顯著（P＜0.01，圖1A），尤其是中劑量效果最佳，不呈線性關系。在雄性小鼠中，中、高劑量影響極為顯著（P＜0.01，圖1A），以高劑量效果最佳，藥效呈劑量依賴性。

圖1 人參瑪咖片對小鼠抗疲勞活性的影響Fig.1 The anti-fatigue effects of PL tablet on mice

2.2.3 小鼠耐力跑時間

經口灌胃給藥14 d后，人參瑪咖片組小鼠的跑步時間明顯高于空白對照組，在雌性小鼠中，中、高劑量影響極為顯著（P＜0.01，圖1B），低劑量組無統計學意義。在雄性小鼠中，與空白對照組相比，低劑量影響顯著（P＜0.05，圖 1B），中、高劑量影響極顯著（P＜0.01，圖1B），從圖中可以看出，中劑量更能緩解雌雄小鼠的疲勞程度。

2.2.4 小鼠負重游泳時間

經口灌胃給藥14 d后，試驗結果顯示，雌性小鼠中，低、中劑量組的負重游泳力竭時間明顯高于空白對照組，其中低劑量組具有顯著性（P＜0.05，圖1C），雄性小鼠中，高劑量組的負重游泳力竭時間高于空白對照組，具有極顯著性（P＜0.01，圖 1C）。

2.3 人參瑪咖片對小鼠血清中ATP、T-SOD和GSHPx水平的影響

2.3.1 人參瑪咖片對小鼠血清中ATP水平的影響

人參瑪咖片對小鼠游泳前后血清中ATP水平的影響見圖2。

圖2 人參瑪咖片對小鼠游泳前后血清中ATP水平的影響Fig.2 Effects on ATP status in serum of PL tablet in mice before and after swimming

人參瑪咖片低、中、高劑量組相比較空白對照組均能顯著的提高雌雄小鼠游泳前后血清中的ATP含量，在游泳前雌雄小鼠中，高劑量組較空白對照組有顯著性影響（P＜0.05，圖2A）。游泳后雌性小鼠中，低劑量組較空白對照組具有顯著性影響（P＜0.05，圖2B），中劑量組具有極顯著影響（P＜0.001，圖2B）。在游泳后雄性小鼠中，低、中劑量組較空白對照組有顯著性影響（P＜0.05），高劑量組較空白組有極顯著性影響（P＜0.001，圖 2B）。

2.3.2 人參瑪咖片對小鼠血清中T-SOD和GSH-Px水平的影響

人參瑪咖片對小鼠游泳前后血清中SOD和GSHPx水平的影響見表3。

表3 人參瑪咖片對小鼠游泳前后血清中SOD和GSH-Px水平的影響Table 3 The effects of PL tablet in serum of SOD and GSH-Px status in mice before and after swimming

由表3可見，與空白對照組相比，人參瑪咖片明顯提高了游泳前雌雄小鼠血清中SOD的含量，雌性小鼠中，低、高劑量組較空白組有極顯著性差異（P＜0.01），游泳后雌雄小鼠血清中的SOD水平相比空白對照組有一定程度的升高，但無統計學意義。

2.4 人參瑪咖片對小鼠血清中T、E2和PROG性激素水平的影響

2.4.1 對T含量的影響

人參瑪咖片對小鼠游泳前后血清中3種性激素水平T、E2和PROG的影響見表4。

表4 人參瑪咖片對小鼠游泳前后血清中3種性激素水平T、E2和PROG的影響Table 4 The effects of PL tablet in serum of T，E2 and PROG sex hormones status in mice before and after swimming

續表4 人參瑪咖片對小鼠游泳前后血清中3種性激素水平T、E2和PROG的影響Continue table 4 The effects of PL tablet in serum of T，E2 and PROG sex hormones status in mice before and after swimming

由表4可見，人參瑪咖片劑量組雌雄小鼠游泳前血清中T的含量無明顯變化，游泳后血清中T的含量雖無統計學意義，但是相對空白對照組都有不同程度的提高，說明人參瑪咖片可能具有較弱的升高T的作用。

2.4.2 對E2、PROG含量的影響

由表4可見，雌雄小鼠中，游泳前E2和PROG均沒有升高趨勢。游泳后雌雄小鼠血清中E2和PROG的含量較空白組有所提高，尤其是雄性小鼠中PROG含量，高劑量組較空白對照組有極顯著性影響（P＜0.01）。

2.5 對肝臟中T-SOD和GSH-Px含量的影響

人參瑪咖片對小鼠游泳前后肝臟中SOD和GSHPx水平的影響見表5。

表5 人參瑪咖片對小鼠游泳前后肝臟中SOD和GSH-Px水平的影響Table 5 The effects of PL tablet on liver SOD and GSH-Px status in mice before and after swimming

從表5可見，游泳前后雌雄小鼠肝臟中總SOD含量較空白對照組有明顯的升高，雌性小鼠中，低劑量和中劑量組具有極顯著性差異（P＜0.01）。游泳后雌雄小鼠肝臟中GSH-Px水平相比較空白對照組有明顯的上升，中劑量組具有顯著性差異（P＜0.05），雄性小鼠中，高劑量組較空白對照組具有極顯著差異（P＜0.01）。

3 結論與討論

運動性疲勞是引起機體運動能力下降的主要原因，運動性力竭是疲勞的一種特殊形式，是運動性疲勞發展的最后階段。耐力學實驗和血清生化指標均可以反應動物運動疲勞的程度，是評價受試物是否具有抗疲勞活性的客觀指標。運動耐力的提高是抗疲勞能力加強的主要指標，力竭時間是機體抗應激能力、抗疲勞能力等多種作用的綜合體現，是衡量機體運動能力的重要直接參數[11]。本研究采用疲勞轉棒、耐力跑和負重游泳耐力學實驗考察人參瑪咖片對運動小鼠的抗疲勞作用，與空白對照組相比，人參瑪咖片顯著延長了雌雄小鼠的轉棒時間、耐力跑時間以及負重游泳力竭時間，本研究結合了3種耐力學實驗方法，其結果更為可靠。

ATP作為生命活動的直接能源，是機體的主要供能物質，體內ATP含量變化可直接反應機體的供能狀態和運動能力[12]。本研究中，人參瑪咖片劑量組顯著的提高雌雄小鼠游泳后血清中ATP含量，供能及時，延緩疲勞的產生。SOD和GSH-Px是生物體內重要的氧自由基清除劑，可以緩解機體運動后的疲勞感，具有一定的抗疲勞作用[13-14]，與空白對照組相比，人參瑪咖片明顯提高了游泳前雌雄小鼠血清中SOD的含量，游泳后雌雄小鼠血清中的SOD水平相比空白對照組有一定程度的升高，但無統計學意義，這可能與所選擇的運動時間和強度有關，短時間運動后可使抗氧化酶系統活性升高，清除自由基效率明顯，而較長時間的亞極限或高強度運動，尤其是力竭運動后，這些酶的活性則呈下降趨勢，清除自由基的效率下降，因此，使人參瑪咖片有較弱的升高SOD的作用，但在統計學上可能未表現出來。雌雄小鼠游泳前人參瑪咖片劑量組血清的GSH-Px含量無明顯變化，但是游泳后血清中GSH-Px含量較空白對照組均有所升高，說明人參瑪咖片能有效提高小鼠血清中SOD和GSH-Px的活性，阻止或降低脂質過氧化反應，保護機體細胞免受損傷，延緩疲勞。Harman的“自由基學說”指出，過多的自由基會破壞體內氧化攻擊和抗氧化保護的平衡，最終導致機體處于疲勞。正常的生理狀態下，機體代謝產生的自由基會被體內的一些抗氧化酶和非酶成分如SOD和GSH-Px等清除[15-16]，從而達到一個穩定的狀態，我們的研究結果證實了抗氧化與抗疲勞之間有密切關系。

已有研究表明，長時間大運動量訓練造成的運動性低血睪酮癥是機體運動能力下降和恢復過程延長的主要原因[17]，而睪酮作為人體內一個重要的促合成激素，它不僅可以維持男性性功能和副性特征，而且還可以刺激組織攝取氨基酸，促進核酸與蛋白質的合成[18]，人參瑪咖片劑量組對雌雄小鼠游泳后血清中T具有較弱的升高作用。E2和PROG是參與調節雌性動物生殖機能的主要性腺激素，人參瑪咖片對雌雄小鼠游泳前E2和PROG含量較空白對照組沒有顯著影響，但游泳后雌雄小鼠血清中E2和PROG的含量較空白組有所提高。根據“保健食品功能學評價程序和檢驗方法”中抗疲勞實驗結果判定規則：“若1項以上（含1項）運動試驗和2項以上（含2項）生化指標結果陽性，即可判定該受試樣品具有抗疲勞的作用。”綜合以上實驗結果，說明人參瑪咖片具有提高小鼠的運動耐力及緩解體力疲勞的功效。

SOD和GSH-Px是機體內抗氧化系統中重要的酶，在清除自由基方面起到非常關鍵的作用。本實驗中，人參瑪咖片明顯提高了游泳前后雌雄小鼠血清和肝臟中SOD和GSH-Px的水平，表明抗自由基途徑是人參瑪咖片發揮抗疲勞作用的途徑之一。ATP被稱為最直接，最快速的能量來源，急性或力竭運動會使肌肉內[H+]含量升高，抑制肌原纖維ATP酶，導致ATP合成受阻，人參瑪咖片劑量組能夠提高游泳后雌雄小鼠血清中ATP水平，雌性小鼠中，低劑量組具有顯著性影響（P＜0.05），中劑量組具有極顯著影響（P＜0.01）。在雄性小鼠中，低、中劑量組較空白對照組有顯著性影響（P＜0.05），高劑量組較空白對照組有極顯著性影響（P＜0.01）。同時研究結果還顯示，人參瑪咖片劑量組會刺激游泳后雌雄小鼠體內性激素的分泌。根據“保健食品功能學評價程序和檢驗方法”中抗疲勞實驗結果判定規則：“1項以上（含1項）運動試驗和2項以上（含2項）生化指標結果陽性，即可判定該受試樣品具有抗疲勞的作用。”綜合以上實驗結果，說明人參瑪咖片能夠提高小鼠的運動耐力及緩解體力疲勞的功效。

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Study on Anti-fatigue Effects of Panax ginseng Lepidium meyenii Tablet

WANG Xue1，ZHANG Xin-rui1，AN Sheng-shu1，WU Hong-hong1，JIANG Xue1，KANG Jie2，HUA Zheng-jie2，ZHANG Xin-yuan3，ZHOU Yu-lin1，*
（1.School of Life Sciences，Jilin University，Changchun 130012，Jilin，China；2.Tonghua Baiquan Health Food Co.，Ltd.，Tonghua 134000，Jilin，China；3.Institute of Japanese Studies of Jilin Academy of Social Sciences，Changchun 130033，Jilin，China）

Anti-fatigue effects of Panax ginseng Lepidium meyenii（PL）tablet was studied by exercise mice model experiment.Mice were randomly divided into 3 groups：low-dose，medium-and high-dose PL tablettreated groups and control group.Autonomic activities number，rotating time，running time and exhaustive swimming time were determined to evaluate the endurance effect of PL tablet，the levels of adenosine triphosphate（ATP），total superoxide dismutase（T-SOD），glutathione reductase（GSH-Px）and the content of testosterone（T），estradiol（E2）and progesterone（PROG）before and after swimming immediately in blood and liver samples were detected to reaserch the anti-fatigue mechanism of PL tablet.Autonomic activity test showed that PL tablet did not damage the central nervous system of mice.Compared with the control group，PL tablet significantly prolonged the time of rod，endurance and weight-bearing swimming.PL tablet significantly increased ATP levels in serum after swimming compared with the control group，as well as significantly increased T-SOD and GSH-Px levels in serum and liver compared with the control group，PL tablet significantly improved the sexhormone T and PROG levels of male and female mice.Combined with the above experimental results，it can be concluded that PL tablet had improved exercise tolerance and relieve fatigue effect，this may be related to its inhibition effect on lipid peroxidation.，this may be related to its inhibition effect on lipid peroxidation.

Panax ginseng Lepidium meyenii tablet（PL）；anti-fatigue；sex hormone；mice

2016-11-24

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.039

吉林省重大科技招標專項（20150203002NY）

王雪（1990—），女（漢），博士研究生，主要從事微生物與生化藥學研究。

*通信作者：周毓麟（1982—），男（漢），工程師，研究方向：微生物與生化藥學。