TNF—α、COX—2、P53及CK7在Barrett食管中的表達(dá)及其意義分析

黃川鋒　劉安麗　賀生

【摘要】 目的 探索研究腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）、P53以及細(xì)胞角蛋白7（CK7）在Barrett食管（BE）中的表達(dá)情況， 分析其變化的意義。方法 38例明確BE診斷患者， 通過(guò)免疫組織化學(xué)對(duì)BE患者術(shù)后組織進(jìn)行切片染色， 將患者BE病變區(qū)域組織設(shè)為BE組（42例）， 將BE邊緣食管炎部分組織作為食管炎組（27例）， 將BE病變部位外5 cm正常食管黏膜作為正常組（29例）。比較三組TNF-α、COX-2、P53及CK7的表達(dá)情況。結(jié)果 正常組TNF-α陽(yáng)性率為20.7%， 食管炎組為92.6%， BE組為81.0%， 正常組TNF-α陽(yáng)性率低于食管炎組、BE組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；食管炎組和BE組TNF-α陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。正常組COX-2陽(yáng)性率低于食管炎組、BE組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；食管炎組和BE組COX-2陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。正常組P53蛋白陽(yáng)性率低于食管炎組、BE組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；BE組P53蛋白陽(yáng)性率高于食管炎組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。正常組、食管炎組CK7蛋白陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， BE組CK7蛋白陽(yáng)性率均高于正常組和食管炎組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 TNF-α、COX-2、P53及CK7與BE的發(fā)生具有密切聯(lián)系， 通過(guò)檢測(cè)其表達(dá)量能夠?qū)E診斷提供一定指導(dǎo)意義。

【關(guān)鍵詞】 腫瘤壞死因子-α；環(huán)氧化酶-2；P53；細(xì)胞角蛋白7；Barrett食管

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.20.002

【Abstract】 Objective To explore and study the expression of tumor necrosis factor-α （TNF-α）， cyclooxygenase-2 （COX-2）， P53， cytokeratin 7 （CK7） in Barrett esophagus （BE）， and analyze the significance of their changes. Methods A total of 38 confirmed BE patients， and their postoperative tissue was stained by immunohistochemistry. The BE lesion tissue was taken as group BE （38 cases）， the BE marginal esophagitis tissue was taken as esophagitis group （27 cases）， and the normal esophageal mucosa of 5 cm outside the site of BE lesion was taken as normal group （29 cases）. Comparison were made on expression of TNF-α， COX-2， P53 and CK7 in three groups. Results The normal group had TNF-α positive rate as 20.7%， which was 92.6% in esophagitis group and 81.0% in BE group. The normal group had lower TNF-α positive rate than esophagitis group and BE group， and their difference had statistical significance （P<0.05）. The esophagitis group and BE group had no no statistically significant difference in TNF-α positive rate （P>0.05）. The normal group had lower COX-2 positive rate than the esophagitis group and BE group， and their difference had statistical significance （P<0.05）. The esophagitis group and BE group had no no statistically significant difference in COX-2 positive rate （P>0.05）. The normal group had lower P53 protein positive rate than the esophagitis group and BE group， and their difference had statistical significance （P<0.05）. The BE group had higher P53 protein positive rate than the esophagitis group， and the difference had statistical significance （P<0.05）. The normal group and esophagitis group had no statistically significant difference in CK7 protein positive rate （P>0.05）. The BE group had higher CK7 protein positive rate than the normal group and esophagitis group， and the difference had statistical significance （P<0.05）. Conclusion TNF- α， COX-2， P53 and CK7 are closely related to the BE development， and the detection of their expression can provide some guidance for the diagnosis of Barrett esophagus.

【Key words】 Tumor necrosis factor-α； Cyclooxygenase-2； P53；Cytokeratin 7； Barrett esophagus

BE是食管癌的主要癌前病變， 其主要病理表現(xiàn)為食管鱗狀上皮細(xì)胞化生為柱狀上皮， 目前認(rèn)為與食管癌的發(fā)生具有密切聯(lián)系[1]。目前對(duì)于BE的診斷主要依靠通過(guò)組織活檢發(fā)現(xiàn)柱狀上皮， 但是有時(shí)病理觀察很難發(fā)現(xiàn)杯狀上皮與柱狀上皮之間的差異， 因此很難進(jìn)行準(zhǔn)確診斷[2]。本研究主要通過(guò)研究TNF-α、COX-2、P53、CK7等在BE中的表達(dá)情況， 探索其在臨床應(yīng)用中的意義。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選擇本校第一附屬醫(yī)院2015年4月～2017年3月收治的38例明確BE診斷患者為研究對(duì)象， 其中男29例， 女9例， 患者年齡30～72歲， 平均年齡（48.2±14.3）歲。將患者BE病變區(qū)域組織設(shè)為BE組， 將BE邊緣食管炎部分組織作為食管炎組， 將BE病變部位外5 cm正常食管黏膜作為正常組。BE診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]：①胃鏡檢查下胃和食管連接處近端局部出現(xiàn)紅色柱狀上皮區(qū)域（見(jiàn)圖1）， 在疑似病變區(qū)域取1～2塊組織進(jìn)行病理檢查， 病理檢查結(jié)果顯示為典型柱狀上皮。②患者病理檢查結(jié)果排除食管癌。

1. 2 方法 將BE患者手術(shù)標(biāo)本或蠟塊存檔組織采用10%福爾馬林進(jìn)行固定， 采用梯度酒精對(duì)組織進(jìn)行脫水， 對(duì)蠟塊存檔組織進(jìn)行常規(guī)脫蠟。采用石蠟對(duì)組織進(jìn)行包埋， 之后進(jìn)行石蠟組織切片， 切片厚度為4 μm， 同一部位連續(xù)切片6張。將載玻片進(jìn)行 3-氨丙基-3-甲氧基硅烷（APEs）防脫片處理， 將切片后組織置于載玻片上， 通過(guò)顯微鏡觀察組織形態(tài)。將組織采用磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行洗滌， 分別將TNF-α、COX-2、P53蛋白、CK7抗體分別加在不同切片表面， 4℃環(huán)境下孵育抗體過(guò)夜。孵完一抗后將切片用PBS清洗4次， 5 min/次。組織片孵育二抗， 二抗為山羊抗兔免疫球蛋白G

（IgG）， 37℃環(huán)境下孵育30 min， 之后將組織片進(jìn)行二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色蘇木素復(fù)染。復(fù)染后對(duì)組織片進(jìn)行脫水、透明等處理， 之后用封片劑對(duì)組織進(jìn)行封片， 通過(guò)顯微鏡進(jìn)行觀察。正常組、食管炎組、BE組有效例數(shù)分別為29、27、42例。

1. 3 觀察指標(biāo)及判定標(biāo)準(zhǔn) 觀察三組TNF-α、COX-2、P53及CK7蛋白在正常食管黏膜、慢性食管炎以及BE部位的表達(dá)情況。經(jīng)過(guò)DAB顯色后TNF-α、COX-2、P53、CK7蛋白會(huì)呈現(xiàn)棕褐色或棕黃色， 呈顆粒狀分布在細(xì)胞包漿、細(xì)胞膜以及細(xì)胞核內(nèi)。根據(jù)細(xì)胞染色情況進(jìn)行判定， 染色細(xì)胞數(shù)目為0視為陰性， 記為陰性（-）， 1%～25%細(xì)胞染色視為弱陽(yáng)性陽(yáng)性， 記為（+）；染色細(xì)胞占26%～50%視為陽(yáng)性， 記為（++）；染色細(xì)胞數(shù)目>50%視為強(qiáng)陽(yáng)性， 記為（+++）。將（++）、（+++）視為高表達(dá)， 陽(yáng)性（+）視為低表達(dá)。

1. 4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)研究數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2. 1 TNF-α表達(dá)情況 TNF-α蛋白經(jīng)過(guò)染色后呈棕黃色， 正常組TNF-α陽(yáng)性率為20.7%， 食管炎組為92.6%， BE組為81.0%， 正常組TNF-α陽(yáng)性率低于食管炎組、BE組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；食管炎組和BE組TNF-α陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2. 2 COX-2表達(dá)情況 COX-2蛋白經(jīng)過(guò)染色后呈棕黃色， 主要分布在表層上皮細(xì)胞以及發(fā)生化生的腺上皮細(xì)胞中。正常組COX-2陽(yáng)性率為10.3%， 食管炎組為74.1%， BE組為83.3%， 正常組COX-2陽(yáng)性率低于食管炎組、BE組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；食管炎組和BE組COX-2陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表2。

2. 3 P53蛋白表達(dá)情況 P53蛋白經(jīng)染色后呈棕黃色， 正常組P53蛋白陽(yáng)性率為13.8%， 食管炎組為40.7%， BE組為71.4%， 正常組P53蛋白陽(yáng)性率低于食管炎組、BE組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；BE組P53蛋白陽(yáng)性率高于食管炎組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2. 4 CK7蛋白表達(dá)情況 CK7蛋白經(jīng)染色后呈棕黃色， 正常組CK7蛋白陽(yáng)性率為0， 食管炎組為7.4%， BE組為95.2%， 正常組、食管炎組CK7蛋白陽(yáng)性率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）， BE組CK7蛋白陽(yáng)性率均高于正常組和食管炎組， 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表4。

3 討論

TNF-α存在于正常細(xì)胞中， 是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要細(xì)胞因子， 主要由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞釋放。在炎癥反應(yīng)中， 巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞激活， 會(huì)引起局部組織TNF-α水平增高[4]。本次研究中食管炎組和BE組TNF-α水平明顯較正常組高（P<0.05）， 說(shuō)明BE病變部位發(fā)生炎性反應(yīng)， 造成病變部位TNF-α水平增高， 食管慢性炎癥是BE前期癥狀， 其TNF-α增高說(shuō)明食管慢性炎癥是BE發(fā)展過(guò)程中的炎性改變。COX是合成前列腺素（PGs）重要的酶[5]， COX-2是COX同工酶， 在正常組織中COX-2表達(dá)量極低， 幾乎檢測(cè)不到[6]。PGs是一種炎性因子， 當(dāng)組織發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)， 炎性細(xì)胞增多COX-2表達(dá)量增多， 促進(jìn)PGs表達(dá)量增多， BE組和慢性食管炎組COX-2增多， 說(shuō)明病變部位發(fā)生明顯炎癥反應(yīng)， 因此說(shuō)明慢性炎癥反應(yīng)是BE的早期事件。P53基因是抑癌基因的一種[7]， P53蛋白是一種負(fù)性調(diào)節(jié)因子， 在DNA修復(fù)以及細(xì)胞增殖分化過(guò)程中具有重要作用， 在正常組織中P53蛋白會(huì)少量表達(dá)， 而在腫瘤細(xì)胞中P53會(huì)出現(xiàn)過(guò)表達(dá)情況， 本次研究中， 正常組中P53表達(dá)量明顯低于其他兩組， 而BE組P53又明顯高于食管炎組（P<0.05）。由于BE為食管癌癌前病變， 因此BE病變部位P53會(huì)出現(xiàn)明顯上調(diào)， 從P53變化趨勢(shì)可以看出從慢性食管炎到BE再到食管癌是食管癌發(fā)展的重要過(guò)程。CK7是一種堿性角蛋白， 在鱗狀上皮細(xì)胞中不表達(dá)而在腺上皮細(xì)胞中表達(dá)量較高[8-10]， 因此通過(guò)CK7可以反映食管上皮細(xì)胞是否發(fā)生腸上皮化生。本實(shí)驗(yàn)中， 正常組CK7陰性， 說(shuō)明正常食管上皮中不存在腸上皮化生， 而BE組CK7蛋白明顯增加， 說(shuō)明BE病變雖未出現(xiàn)癌變， 但是其已經(jīng)發(fā)生腸上皮化生。

綜上所述， TNF-α、COX-2、P53以及CK7在BE中均出現(xiàn)過(guò)表達(dá)， 因此可以通過(guò)檢測(cè)這些指標(biāo)對(duì)患者病情進(jìn)行評(píng)估， 對(duì)臨床治療以及評(píng)估預(yù)后具有指導(dǎo)意義。

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[收稿日期：2017-05-27]