槲皮素對異煙肼聯用利福平致大鼠肝損傷的防護作用

魏 來，趙春景

（重慶醫科大學附屬第二醫院藥劑科，重慶 400010）

·實驗研究·

槲皮素對異煙肼聯用利福平致大鼠肝損傷的防護作用

魏 來，趙春景

（重慶醫科大學附屬第二醫院藥劑科，重慶 400010）

目的 觀察槲皮素對異煙肼（INH）和利福平（RFP）聯用致大鼠肝損傷的防護作用，并探討其作用機制。方法 選擇雄性Wistar大鼠50只，自由進食飼料和水，適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為空白對照組，肝損傷模型組和槲皮素低、中、高劑量組，各10只。除空白對照組外，其余組大鼠每天一次性給予異煙肼和利福平各 75 mg／kg，用藥 4周制備大鼠肝損傷動物模型，空白對照組僅給予等體積生理鹽水，槲皮素低、中、高劑量組給予INH和RFP 2 h后，分別給予低、中、高劑量（50，100，200 mg／kg）槲皮素，空白對照組和肝損傷模型組均灌胃等體積的蒸餾水。4周后，測定大鼠血清中天門冬酸氨基轉移酶（AST）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）和總膽紅素（TBIL）的水平，肝臟指數，以及肝組織勻漿中的丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）水平和超氧化物歧化酶（SOD）的活性，并作肝組織病理學檢測。結果 槲皮素能降低大鼠肝臟指數，AST，ALT和TBIL及肝勻漿中MDA水平，升高肝勻漿中GSH及SOD水平（P＜0.05），還能減輕肝組織變性和壞死程度，緩解肝組織損傷的病理改變。結論 槲皮素對INH和RFP聯用所致大鼠肝損傷有保護作用，其作用機制可能與槲皮素抑制脂質過氧化反應有關。

槲皮素；大鼠；肝損傷；異煙肼；利福平；作用機制

異煙肼（isoniazid，INH）和利福平（rifampin，RFP）均為臨床一線抗結核藥，目前，在世界衛生組織（WHO）推薦的抗結核化學治療（簡稱化療）標準方案[1]及衍生方案中仍不可替代。兩藥對繁殖期和靜止狀態的結核桿菌均有較強作用，且聯用有協同作用，可增強殺菌效果，但會增加肝毒性，甚至出現嚴重的肝功能障礙[2]，其致肝損傷的機制尚不清楚[3]。目前的研究認為，異煙肼的肝毒性與其代謝產物肼及單乙酰衍生物有關；利福平則通過誘導肝藥酶活性，導致乙酰肼代謝的活性中間體增多而加重異煙肼的肝毒性[4]。如何防治肝損傷已成為抗結核化療亟待解決的問題。槲皮素（quercetin）為五羥基黃酮類化合物，不溶于冷水，難溶于熱水，溶于堿溶液，已證實其具有抗氧化、抗血小板聚集、降壓等多種藥理作用[5－7]，且已觀察到槲皮素對四氯化碳（CCl4）所致大鼠肝損傷有防護作用[8]，但有關槲皮素對結核藥所致肝損傷的防護作用未見報道。對此，本研究中觀察了INH和RFP聯用致肝損傷大鼠在給予槲皮素后各指標的變化，以此探討槲皮素對INH和RFP聯用致肝損傷的保護作用及其作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

動物：Wistar大鼠 50只，雄性，清潔級，體質量180～200 g，鼠齡6～7周，購于重慶醫科大學實驗動物中心，實驗動物使用許可證號為 SYXK（渝）2012－0001。飼養條件：溫度 21～26℃，相對濕度 40% ～70%，10／14 h明暗交替照明。

儀器：AEG－220型電子天平，UV－1601型紫外分光光度計（日本島津公司）；J2－MC型低溫離心機（美國Beckman公司）；MDF－U333型低溫冰箱，日本Sanyo公司）；7070型全自動生化分析儀（日本日立公司）；玻璃勻漿器（規格為20 mL，涿州市長虹玻璃儀器廠）。

試藥：槲皮素（南京標科生物科技有限公司）；異煙肼片（西南藥業有限公司，批號為091124）；利福平膠囊（重慶科瑞制藥有限公司，批號為100228）。超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號為20100412），丙二醛（MDA）試劑盒（批號為 20100829）和谷胱甘肽（GSH）試劑盒（批號為20100923），均購自南京建成生物工程研究所。

1.2.1 造模及分組

大鼠自由進食飼料和水，適應性喂養1周后，按隨機數字表法分為空白對照組，肝損傷模型組和槲皮素低、中、高劑量組，各10只。槲皮素臨用前用生理鹽水配成質量濃度為10 g／L的溶液灌胃治療4周。空白對照組和肝損傷模型組按體質量換算等體積生理鹽水灌胃4周。INH直接溶于無菌注射用水，制成質量濃度為30 g／L的灌胃液，RFP溶于pH＝3.0的鹽酸溶液，制成質量濃度為30 g／L的灌胃液[9]。除空白對照組外，其余4組大鼠每天一次性灌胃INH和RFP各75 mg／kg，連續4周，灌胃體積為20 mL／kg，以制備肝損傷模型，INH和RFP用量為人用劑量的 5.5倍[10－11]。空白對照組則灌胃等體積生理鹽水。在給予INH和RFP 2 h后，槲皮素低、中、高劑量組分別灌胃 50，100，200 mg／kg槲皮素，空白對照組和肝損傷模型組均灌胃等體積的蒸餾水，各組灌胃體積均為20 mL／kg，每天1次，連續給藥4周。

1.2.2 標本采集及制備

全部動物于末次給藥后禁食不禁水12 h，乙醚麻醉，眼眶取血。摘取肝臟，稱定質量，然后取部分肝臟用生理鹽水漂洗數次后，濾紙拭干，精確稱取0.5～0.6 g，加入4℃生理鹽水5～6 mL，倒入玻璃勻漿器中，放入冰水中碾磨，制成10%肝勻漿，4℃下以10 000 r／min的速率離心30 min，取上清液分裝，保存于－70℃冰箱中，待測。另取部分肝葉，用4℃生理鹽水漂洗數次后，迅速用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，切片，蘇木素－伊紅（HE）染色，作肝臟病理組織學檢查。

1.3 觀察指標[9]

一般狀態：觀察大鼠的一般情況，包括精神、運動、飲食、排便、皮毛色澤、死亡等情況，每周稱定大鼠體質量，記錄其變化。

肝臟指數：肝臟指數（mg／g）＝肝質量（mg）／體質量（g）。

肝臟損傷程度：“－”為正常；“＋”表示變性是以肝細胞質疏松化為主，變性的肝細胞占肝細胞總數的1／3以下，壞死以單個或幾個肝細胞壞死為主，占肝細胞總數的10%以下，炎性細胞浸潤每個高倍視野0～10個；“＋＋”表示變性是以肝細胞氣球樣變為主，變性的肝細胞占肝細胞總數的1／3～1／2，壞死以肝細胞小片狀壞死為主，占肝細胞總數的10%～20%，炎性細胞浸潤每個高倍視野10～20個；“＋＋＋”表示變性是以肝細胞氣球樣變為主，變性的肝細胞占肝細胞總數的1／2以上，壞死以肝細胞大片壞死為主，占肝細胞總數的20%以上，炎性細胞浸潤每個高倍視野20個以上。每張病理切片隨機取3個視野，取平均值。“－”按0分計算，“＋”按0.1分計算，“＋＋”按0.2分計算，“＋＋＋”按0.3分計算[11]。

處于成長期內的農作物，如果不防控各類作物病蟲害，則會存在較大可能威脅到作物的存活與生長。嚴重的情形下，欠缺全方位的病蟲害防控還將會引發減產，并且損害當地農戶的經濟收益。在當前階段中，針對防治病蟲害可以選擇靈活性的防控措施，其中包含生物手段、化學手段及其他防治舉措。防治農作物感染各類病蟲害的舉措應當建立于綠色植保的基礎上，確保將保護農作物的思路全面融入防控病蟲害的流程與環節中。

肝功能：大鼠眼眶取血約2 mL，用全自動生化分析儀測定丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天門冬酸氨基轉移酶（AST）和總膽紅素（TBIL）水平，并判斷其活性。

肝勻漿檢測：按試劑盒說明檢測肝勻漿中丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和超氧化物歧化酶（SOD）的水平。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 一般情況

空白對照組大鼠精神狀態良好，攝食正常，皮毛有光澤，糞便及尿液等均無異常；肝損傷模型組大鼠出現不同程度皮毛蓬亂，糞便、尿液呈橘紅色改變；槲皮素各劑量組大鼠一般情況優于肝損傷模型組。整個實驗過程中無大鼠死亡。

2.2 對肝功能的影響

與空白對照組比較，肝損傷模型組大鼠血清中AST，ALT和TBIL活性均明顯升高（P＜0.01或 P＜0.05）、肝臟指數明顯增大；與肝損傷模型組比較，槲皮素低、中、高劑量組肝臟指數均降低（P＜0.05或 P＜0.01），槲皮素各劑量組血清中ALT及TBIL的活性明顯降低（P＜0.05或 P＜0.01），槲皮素高劑量組AST水平的升高明顯受抑（P＜0.05）。詳見表1。

2.3 對肝臟形態學的影響

空白對照組大鼠肝小葉結構完整，肝細胞形態正常，肝細胞索清晰，圍繞中央靜脈呈放射狀排列，肝竇及匯管區無異常，基本無炎性細胞浸潤；肝損傷模型組可見肝小葉失去正常的條索狀排列，胞漿疏松呈網狀，核深染。大部分細胞濁腫，中央靜脈周圍部分肝臟細胞發生氣球樣變。嗜酸性變、點狀壞死病灶并見炎性細胞浸潤。與空白對照組相比，肝損傷模型組病理損傷明顯（P＜0.05）；與肝損傷模型組比較，槲皮素各劑量組的大鼠肝臟病理損傷程度明顯減輕（P＜0.05）。詳見表2及圖1。

表1 槲皮素對大鼠肝功能的影響比較（±s，n＝10）

表1 槲皮素對大鼠肝功能的影響比較（±s，n＝10）

注：與空白對照組比較， P＜0.05， P＜0.01；與肝損傷模型組比較， P＜0.05， P＜0.01。表3同。

組別空白對照組肝損傷模型組槲皮素低劑量組槲皮素中劑量組槲皮素高劑量組劑量[mg／kg·d）]－INH 75＋RFP75槲皮素50＋INH 75＋RFP 75槲皮素100＋INH 75＋RFP 75槲皮素200＋INH 75＋RFP 75肝臟指數（mg／g）34.26±6.25 55.53±8.45 51.33±5.58 46.78±6.27 42.32±5.36 AST（U／L）235.20±29.46 450.80±39.30 368.90±41.30 305.60±40.55 288.10±37.66 ALT（U／L）49.40±10.32 69.80±12.44 55.60±7.87 34.70±7.44 32.30±6.58 TBIL（ mol／L）8.50±2.36 15.05±3.25 13.88±3.68 12.82±2.24 11.79±2.71

表2 槲皮素對大鼠肝臟病理改變和損傷程度分級的影響（n＝10）

圖1 光學顯微鏡下的肝臟病理組織（HE，×200）

2.4 對肝組織勻漿中MDA，GSH和SOD水平的影響

與空白對照組比較，肝損傷模型組MDA的水平明顯升高（P＜0.01），SOD活性明顯降低（P＜0.05），GSH含量明顯降低（P＜0.05）；與肝損傷模型組比較，槲皮素的中、高劑量組MDA水平降低，GSH水平升高（P＜0.05或 P＜0.01），槲皮素各劑量組SOD水平均升高（P＜0.05或 P＜0.01）。詳見表3。

3 討論

INH在肝臟被乙酰化為乙酰異煙肼，乙酰異煙肼又可被進一步氧化為乙酰肼，后者達一定濃度即可損傷肝細胞。RFP本身無毒，主要是通過累及肝內膽紅素的正常分泌代謝過程而導致膽紅素升高，但RFP自身可誘導CYP2E1的活性升高，通過協同作用加重INH所引起的肝損傷[12]。本研究中在確定肝損傷模型建立后，發現槲皮素低、中、高劑量組大鼠的肝臟指數和ALT、AST、TBIL水平均有不同程度下降，且與槲皮素劑量呈負相關（P＜0.05或 P＜0.01）。說明槲皮素對肝臟損傷具有一定預防和改善作用。

表3 槲皮素對肝損傷大鼠肝組織勻漿中MDA，GSH和SOD水平的影響（±s，n＝10）

表3 槲皮素對肝損傷大鼠肝組織勻漿中MDA，GSH和SOD水平的影響（±s，n＝10）

組別空白對照組肝損傷模型組槲皮素低劑量組槲皮素中劑量組槲皮素高劑量組劑量[mg／(kg·d）－INH75＋RFP75槲皮素50＋INH75＋RFP75槲皮素100＋INH75＋RFP75槲皮素200＋INH75＋RFP75 MDA（ mol／g）2.54±0.56 3.77±0.70 3.38±1.28 3.10±1.37 2.87±1.31 GSH（mg／g）104.47±28.32 76.50±17.46 91.36±24.55 93.57±19.71 94.58±18.94 SOD（U／mg）160.54±7.72 107.70±8.75 113.42±14.66 127.66±14.87 143.22±13.59

高濃度的活性氧是抗結核藥物在肝臟中代謝的產物，通過損傷細胞膜的結構誘導氧化應激反應導致機體損傷。脂質過氧化是氧化應激的重要標志，它在INH和RFP誘導的肝臟損傷中發揮著重要作用[13－15]。SOD是超氧陰離子自由基的清除劑，能抑制黃嘌呤脫氫酶轉化為黃嘌呤氧化酶，減少自由基產生，減輕肝細胞損傷，抑制自由基啟動的脂質過氧化反應。而MDA是脂質過氧化反應中分解的終產物之一，能使膜蛋白、酶發生交聯反應，使膜通透性增加，導致細胞膜結構、功能和代謝發生改變，對機體造成損害。因此，SOD和MDA水平的高低不僅能反映肝細胞膜脂質過氧化的強弱，還可間接反映機體組織、細胞損傷的程度。GSH可清除O2－，缺乏或耗竭GSH會促使許多化學物質或環境因素產生中毒或加重其中毒作用，這可能與增加氧化損傷有關，GSH水平是衡量機體抗氧化能力的重要因素[11]。本研究中通過檢測大鼠肝組織中MDA，GSH，SOD的活性來評價肝臟脂質過氧化損傷的程度，結果顯示，肝損傷模型組與空白對照組相比，肝組織中MDA水平升高，GSH和SOD水平降低，提示INH和RFP進入大鼠體內后會引起肝內GSH水平及抗氧化能力的下降，導致氧化應激反應，并引起肝內脂質過氧化，從而導致肝損傷，表明脂質過氧化與肝損傷的發病機制有關；而槲皮素的不同劑量組與肝損傷模型組相比，槲皮素能明顯降低MDA水平，提高GSH和SOD水平，說明槲皮素可通過抑制脂質過氧化反應，對INH和RFP聯用所致的大鼠肝損傷有一定防護作用。

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Protective Effects and Mechanisms ofQuercetin on Hepatic Injury Induced by Isoniazid Combined with Rifampicin in Mice

Wei Lai，Zhao Chunjing
（Department of Pharmacy，The Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing，China 400010）

Objective To investigate the protective effect and mechanism of quercetin on liver injury induced by isoniazid（INH）combined with rifampicin （RFP）in rats.Methods Totally 50 male Wistar mice were fed with feed and water，and 1 week after adaptive feeding，the mice were randomly divided into blank control group，liver injury model group and quercetin low，middle and high dose groups，10 mice in each group.In addition to the blank control group，the mice in the other groups were given INH and RFP（each 75 mg／kg）per day for 4 weeks to prepare the animal models of liver injury in mice，and the blank control group was given equal volume of normal saline，2 h after giving INH and RFP，the low，middle and high dose groups were given low dosage，middle dosage and high dosage of quercetin（50，100，200 mg／kg），the blank control group and the liver injury model group were filled with equal volume of distilled water.The serum levels of AST，ALT and TBIL，liver index，contents of MDA，GSH，and SOD in liver were measured after 4 weeks of giving quercetin，and the hepatic pathological changes were also observed.Results Quercetin could reduce the liver index，the serum level of AST，ALT，TBIL and the content of MDA，raise the liver GSH content，promote the the activities of SOD in liver in mice.The degeneration and necrosis of liver tissue were relieved，and the pathological changes of liver tissue injury were alleviated.Conclusion Quercetin has the protective effect on the hepatotoxicity induced by INH combined with RFP in mice，and the mechanism may be related to the inhibition of lipid peroxidation of quercetin.

quercetin；mice；hepatotoxicity；isoniazid；rifampicin；mechanism of action

R965

A

1006－4931(2017)16－0009－04

2017－04－09；

2017－05－26)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.16.003

重慶市醫學科研項目[2010－2－143]。

魏來，女，碩士研究生，研究方向為臨床藥理學及臨床藥學，（電話）023－63693137（電子信箱）501760092＠qq.com。