鐵皮石斛非傳統(tǒng)藥用部位葉中多糖及5種重金屬含量的測(cè)定

符德歡 王 麗 蒲星宇

云南省藥物研究所/云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心/云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111

鐵皮石斛非傳統(tǒng)藥用部位葉中多糖及5種重金屬含量的測(cè)定

符德歡 王 麗 蒲星宇

云南省藥物研究所/云南白藥集團(tuán)創(chuàng)新研發(fā)中心/云南省中藥和民族藥新藥創(chuàng)制企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650111

目的：測(cè)定鐵皮石斛葉中多糖及5種重金屬元素的含量，了解鐵皮石斛葉中多糖及重金屬含量情況，為更深入研究開發(fā)鐵皮石斛葉提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：采用微波消解法進(jìn)行樣品前處理；電感耦合等離子體質(zhì)譜法測(cè)定5種重金屬元素的含量；紫外分光光度法測(cè)定多糖的含量。結(jié)果：9個(gè)鐵皮石斛葉樣品中的多糖含量在9%～19%之間；鐵皮石斛葉對(duì)重金屬元素具有一定的蓄積作用，除1號(hào)、8號(hào)和9號(hào)樣品符合限量標(biāo)準(zhǔn)外，其余6個(gè)樣品均超標(biāo)。結(jié)論：鐵皮石斛葉中含有一定量的多糖，對(duì)拓寬鐵皮石斛的藥材來(lái)源具有重要的參考價(jià)值，但部分樣品中重金屬含量超標(biāo)，在進(jìn)一步開發(fā)利用鐵皮石斛葉時(shí)，應(yīng)重視重金屬元素含量的控制。

鐵皮石斛葉；多糖；重金屬；含量測(cè)定

鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo是蘭科石斛屬植物，收載于2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》一部[1]。主產(chǎn)于貴州、云南和廣西。本品始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有益胃生津、滋陰清熱的功效。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)多糖能夠治療免疫系統(tǒng)受損而引發(fā)的一些疾病，是一類具有很大開發(fā)潛力的免疫調(diào)節(jié)劑[2]。目前，關(guān)于鐵皮石斛莖中的多糖已有很多研究報(bào)道，但對(duì)鐵皮石斛葉中多糖的研究少見。

目前，國(guó)際上對(duì)于藥材中的有毒重金屬含量限制極為嚴(yán)格，中藥材中重金屬含量超標(biāo)的事件時(shí)有報(bào)道，其重金屬含量的高低直接影響到藥材的質(zhì)量[3]。筆者對(duì)非傳統(tǒng)藥用部位鐵皮石斛的葉中多糖及5種重金屬含量展開研究，以便在綜合開發(fā)利用鐵皮石斛葉時(shí)，提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)指導(dǎo)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Speedwave 4微波消解系統(tǒng)(Berghof，Inc.德國(guó))；7700X電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(7700X ICP-MS，美國(guó)Agilent 公司)；101A-2E型鼓風(fēng)干燥箱(上海安亭科學(xué)儀器廠)，TYS-500A型高速多功能粉碎機(jī)(浙江省永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司)；聚四氟乙烯罐；FA2004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；UV-2501PC紫外分光光度計(jì)(SHIMADZU，日本)；ML-3-4可調(diào)式電熱板(北京市永光明醫(yī)療儀器廠)；移液槍(北京大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；Milli-Q超純水發(fā)生器(ADVANTAG A10，美國(guó)密理博公司)。

1.2 試劑 銅、鎘、鉛、砷、汞標(biāo)準(zhǔn)溶液，硝酸(優(yōu)級(jí)純)，鹽酸(優(yōu)級(jí)純)，D-無(wú)水多糖(批號(hào)：110833-201205，中國(guó)食品藥品檢定研究院)、苯酚(汕頭市光華化學(xué)廠)、無(wú)水硫酸(批號(hào)：20111101，重慶川東化工集團(tuán)有限公司)、無(wú)水乙醇(批號(hào):0910073301，安徽安特生物化學(xué)有限公司)

1.3 藥材的采集 1～7號(hào)樣品采集于家種鐵皮石斛的新鮮葉片，8號(hào)樣品采集于普洱野生鐵皮石斛的新鮮葉片，9號(hào)樣品采集于文山野生鐵皮石斛的新鮮葉片，原植物均經(jīng)云南省藥物研究所鑒定，為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛DendrobiunofficinaleKimura et Migo。

1.4 藥材折干率 將剛剛采摘的新鮮葉片分別進(jìn)行稱重，記下各自重量(鮮重)，再將葉片放于鼓風(fēng)干燥箱中(60℃)烘烤干后再進(jìn)行稱重，記下各自重量(干重)。結(jié)果見表1。

表1 鐵皮石斛葉折干率

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖的測(cè)定2.1.1 實(shí)驗(yàn)方法 按照《中國(guó)藥典》2015年版一部，鐵皮石斛含量測(cè)定項(xiàng)下多糖檢測(cè)的方法[1]。照紫外-可見光分光光度法(通則0401)測(cè)定吸光度。

2.1.2 對(duì)照品溶液的制備 取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加超純水稀釋為每1mL含90μg的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 分別取9種樣品的粉末(過3號(hào)篩)約0.3g，精密稱定后，加超純水200mL加熱回流2h，放冷，轉(zhuǎn)移至250mL容量瓶，加少量超純水分次洗滌容器，洗液并入同一容量瓶中，加水至刻度，搖勻，濾過，精密量取溶液2mL，至15mL離心管中，精密加無(wú)水乙醇10mL，搖勻，冷藏1h，取出，離心(轉(zhuǎn)速為4000r/min)20min，棄去上清液，沉淀加80%的乙醇洗滌2次，每次8mL，離心，棄去上清液。沉淀加熱水溶解，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，放冷，加水至刻度，即得。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度試驗(yàn) 測(cè)定10次標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度，計(jì)算RSD值為2.3%，儀器滿足樣品檢測(cè)要求。

2.1.4.2 重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn) 取8號(hào)樣品6份，按照樣品處理方法處理后，測(cè)定樣品吸光度，結(jié)果RSD均小于5%。將處理好的樣品放置2、4、8、12、24h后分別進(jìn)行測(cè)定，各元素的含量變化較小，RSD均小于5%。2.1.4.3 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知無(wú)水葡萄糖含量的8號(hào)樣品9份，每3份分別按照含量的80%、100%、120%精密加入無(wú)水葡萄糖對(duì)照品，照樣品測(cè)定項(xiàng)下方法測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果無(wú)水葡萄糖的平均回收率為97.85%，RSD為1.23%。其結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置10mL具塞試管中，加水補(bǔ)至1.0mL，精密加入5%苯酚溶液1mL，搖勻，再精密加硫酸5mL，搖勻，置沸水浴中加熱20min，取出，置冰浴中冷卻5min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(《中國(guó)藥典》2015年版四部通則0401)，在488nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。見表3。

表3 鐵皮石斛回歸方程、相關(guān)系數(shù)

2.1.6 樣品的測(cè)定 精密量取供試品溶液1mL，置10mL具塞試管中，精密加入5%苯酚溶液1mL，搖勻，再精密加硫酸5mL，搖勻，置沸水浴中加熱20min，取出，置冰浴中冷卻5min，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法(通則0401)，在488nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，依照吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出無(wú)水葡萄糖的量，計(jì)算，即得。1～9號(hào)鐵皮石斛葉中均含有多糖，含量介于9%～19%之間，野生鐵皮石斛8號(hào)、9號(hào)的多糖含量高于家種鐵皮石斛1～7號(hào)的多糖含量。見表4。

表4 鐵皮石斛葉多糖含量

2.2 重金屬元素的測(cè)定條件

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備2.2.1.1 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 分別取濃度為1.000g/L含Ge、In、Bi的內(nèi)標(biāo)溶液100μL于100mL的容量瓶中，用2%的硝酸定容至100mL，作為內(nèi)標(biāo)溶液，濃度即為10ug/L。

2.2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 分別取一定量的Cu、Cd、Pb、As、Hg5個(gè)梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于5個(gè)容量瓶中，用10%的硝酸定容至刻度。配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度見表5。

表5 標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度

2.2.2 供試品溶液的制備 分別取不同產(chǎn)地的鐵皮石斛葉制備為細(xì)粉，分別取藥材細(xì)粉0.3g，精密稱定，置聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，加硝酸7.5 mL，混勻，浸泡過夜，蓋好內(nèi)蓋和防爆膜，旋緊外套，置微波消解系統(tǒng)內(nèi)，進(jìn)行消解(按表6微波消解程序操作)。消解完全后，取出消解罐，冷卻至室溫，將消解罐內(nèi)的液體轉(zhuǎn)移至三角瓶中，用適量去離子水清洗消解罐，清洗液倒入三角瓶中，再將三角瓶放置于電熱板上加熱至紅棕色蒸氣揮盡，放冷，用去離子水轉(zhuǎn)入50 mL的容量瓶中，并稀釋至刻度，在分別向其中加入200uL金元素，搖勻，放置過夜，并離心(4000r/min)即得。同法制備樣品空白試液。

表6 微波消解程序

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 以標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)得的吸收值為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程，在所配置濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，各元素回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍見表7。

表7 回歸方程及相關(guān)系數(shù) (n=3)

2.2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 經(jīng)測(cè)定，供試品中所含砷(As)、鎘(Cd)、銅(Cu)、鉛(Pb)和汞(Hg)含量見表8。

表8 5種元素含量結(jié)果

根據(jù)《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》(2004)對(duì)重金屬的限量指標(biāo)： Hg≤0.2 mg/kg，Cd≤0.3 mg/kg，As≤2.0 mg/kg，Pb≤5.0 mg/kg，Cu≤20 mg/kg，檢測(cè)結(jié)果表明：除1號(hào)、8號(hào)、9號(hào)樣品符合限量標(biāo)準(zhǔn)外，其余6個(gè)樣品均超出了限量標(biāo)準(zhǔn)，其中Pb均超標(biāo)，3號(hào)、5號(hào)、6號(hào)、7號(hào)樣品中銅超標(biāo)，3號(hào)樣品中鎘略高于標(biāo)準(zhǔn)。

3 討論

現(xiàn)代社會(huì)人們?cè)絹?lái)越重視疾病的提前預(yù)防，而增加機(jī)體自身的免疫力是更為科學(xué)的選擇。研究表明：多糖具有增加機(jī)體免疫力的功效，在應(yīng)用中也被反復(fù)驗(yàn)證。其中鐵皮石斛的主要藥用成分即為多糖，但傳統(tǒng)使用的是莖，葉常被丟棄。通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛葉中含有9%～19%不等的多糖，為拓寬鐵皮石斛的藥用來(lái)源提供了重要的參考資料。但部分樣品中重金屬含量超標(biāo)，在進(jìn)一步開發(fā)利用鐵皮石斛葉時(shí)，應(yīng)重視重金屬元素含量的控制。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部) [M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：282-283.

[2]劉吉成，牛英才.多糖藥物學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：7.

[3]王麗，符德歡. 三七重金屬含量影響因素的初步研究[J] .云南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，37(5)：13-15.

The Determination of Polysaccharide and 5 Kinds of Heavy Metals In The Non-traditional Medicinal Parts of TheDendrobiumOfficinaleLeaf

FU Dehuan WANG Li PU Xingyu

Yunnan institute of Materia Medica/Yunnan Bai Yao Group Innovation and R&D Center Yunnan Province Company/Key Laboratory for TCM and Ethnic Drug of New Drug Creation,Kunming 650111, China

Objective Determination of polysaccharides indendrobiumofficinaleleaf and 5 kinds of heavy metal element content, understand the tin polysaccharides and heavy metal content in the leaves and stems of dendrobium stem situation, for the further research and development provides the theory basis for tinDendrobiumofficinalestem leaves. Methods Before the sample was processed by microwave dissolving method. Inductively coupled plasma mass spectrometry to determine the content of five heavy metal elements; Ultraviolet spectrophotometry measures the content of polysaccharides. Results The amount of polysaccharides in the samples of the nine tin dendrobium leaf were between 9% and 19%. TheDendrobiumofficinaleleaf has a certain cumulative effect on heavy metal elements, except for the 1、8 and 9 samples, the other 6 samples are above the standard. Conclusion This study found that theDendrobiumofficinaleleaf contains a certain amount of polysaccharide, to broaden the tin herbs caulis dendrobii source has an important reference value, but the heavy metal content in some samples, in the further development and utilization ofDendrobiumofficinaleleaf at the same time, should pay attention to control of heavy metal element content.

DendrobiumofficinaleLeaf; Polysaccharide; Heavy Metals;Content Determination

云南省技術(shù)創(chuàng)新人才培養(yǎng)計(jì)劃項(xiàng)目(2014HB069)。

符德歡(1976-)，男，高級(jí)工程師，研究方向?yàn)槊褡逅帯⒅兴庂Y源研究。E-mail：fudehuan@126.com

R284.1

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1007-8517(2017)16-0017-04

2017-06-15 編輯：鄧佳麗)