熱帶假絲酵母五六碳糖共發(fā)酵產(chǎn)酒精研究

鄧永東，李靜紅，陳小舉，顧永忠，呂西軍，吳學(xué)鳳，鄭 志，姜紹通，李興江

（1.合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品精深加工安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230009；2.中國(guó)農(nóng)村技術(shù)開(kāi)發(fā)中心，北京100045；3.巢湖學(xué)院，安徽巢湖238000）

熱帶假絲酵母五六碳糖共發(fā)酵產(chǎn)酒精研究

鄧永東1，李靜紅2，陳小舉3，顧永忠1，呂西軍1，吳學(xué)鳳1，鄭 志1，姜紹通1，*李興江1

（1.合肥工業(yè)大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品精深加工安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥230009；2.中國(guó)農(nóng)村技術(shù)開(kāi)發(fā)中心，北京100045；3.巢湖學(xué)院，安徽巢湖238000）

為提高酵母菌代謝木糖和葡萄糖產(chǎn)乙醇的效率，以木糖為底物對(duì)熱帶假絲酵母菌進(jìn)行馴化培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)木糖質(zhì)量濃度由20～70 g/L的遞進(jìn)馴化培養(yǎng)后，對(duì)木糖的利用率提高了21.02%，混合糖的利用率達(dá)到94.21%，乙醇質(zhì)量濃度為22.21 g/L，木糖醇轉(zhuǎn)化率為0.39 g/g（酵母代謝木糖的理論得率為0.46 g乙醇/g木糖，葡萄糖乙醇發(fā)酵理論得率0.51 g乙醇/g葡萄糖），其對(duì)木糖利用率效果顯著提高。木糖還原酶活性對(duì)NADPH的親和力由≤1.3 U增加到11.0 U，NADH也由≤0.2 U增長(zhǎng)到1.4 U，木糖醇脫氫酶的活性也由322 U增長(zhǎng)到1 534 U。同時(shí)，對(duì)馴化后的酵母菌發(fā)酵工藝進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究發(fā)酵時(shí)間、轉(zhuǎn)速、發(fā)酵溫度、初始pH值對(duì)發(fā)酵的影響，結(jié)果表明發(fā)酵最佳條件為發(fā)酵時(shí)間72 h，轉(zhuǎn)速140 r/min，發(fā)酵溫度36℃，初始pH值4。

酵母菌；木糖；馴化；酶活

纖維質(zhì)原料是地球上最豐富的可再生資源，主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素構(gòu)成。利用木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)乙醇是目前研究的熱點(diǎn)，而對(duì)木糖和葡萄糖的有效利用又是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。我國(guó)每年可利用的纖維質(zhì)原料大約為7×108t，主要來(lái)自農(nóng)業(yè)、林業(yè)、工業(yè)及城市的廢棄物，這些都是酒精生產(chǎn)的豐富原料。隨著世界能源危機(jī)日趨惡化，利用成本低廉的纖維質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)燃料酒精已經(jīng)引起人們極大的興趣[1]。纖維素水解主要產(chǎn)物是六碳糖（如葡萄糖等），而半纖維素水解產(chǎn)物主要是五碳糖（如木糖等）。傳統(tǒng)用于酒精發(fā)酵的微生物只能利用六碳糖進(jìn)行發(fā)酵，研究所用的熱帶假絲酵母CICC1779能很容易地利用葡萄糖進(jìn)行酒精發(fā)酵，但不能利用木糖。充分利用纖維質(zhì)原料中的木糖，可使酒精的產(chǎn)量在原有基礎(chǔ)上增加25%[2-3]。因此，對(duì)該菌株進(jìn)行馴化，使其能利用五碳糖，從而能共發(fā)酵五碳糖和六碳糖生產(chǎn)酒精，對(duì)于實(shí)現(xiàn)纖維質(zhì)原料酒精工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。對(duì)熱帶假絲酵母進(jìn)行馴化，然后對(duì)其五碳糖利用的酶活進(jìn)行測(cè)定[4]，對(duì)比馴化前后的相關(guān)酶活，從而判定馴化的效果，使其能較好地利用五碳糖進(jìn)行發(fā)酵，最終具有五、六碳糖共發(fā)酵的能力[5]。

五碳糖發(fā)酵機(jī)理：木糖在不同微生物細(xì)胞中主要有2種途徑被異構(gòu)成木酮糖，絕大多數(shù)細(xì)菌和放線菌是通過(guò)木糖異構(gòu)酶1步生成木酮糖；而在真菌和酵母菌中，木糖則通過(guò)2步氧化還原反應(yīng)生成木酮糖，即木糖首先在木糖還原酶（Xylose reductase）的作用下，被還原成木糖醇，木糖醇再在木糖醇脫氫酶（Xylitol dehydrogenase）的作用下，再轉(zhuǎn)化成木酮糖。這2步反應(yīng)需要輔酶I（NAD+，NADH）或輔酶II（NADP+，NADPH）的參與，然后在木酮糖激酶（Xylulose kinase）的作用下轉(zhuǎn)變成磷酸木酮糖，再經(jīng)過(guò)磷酸戊糖途徑，生成中間產(chǎn)物3-磷酸甘油醛和6-磷酸果糖。6-磷酸果糖可以加入磷酸戊糖途徑，而3-磷酸甘油醛則經(jīng)過(guò)脫羧、還原等步驟，最后轉(zhuǎn)化成乙醇[6]。

酵母菌發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的主要代謝過(guò)程見(jiàn)圖1。

圖1 酵母菌發(fā)酵木糖生產(chǎn)乙醇的主要代謝過(guò)程

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

熱帶假絲酵母CICC1779，合肥工業(yè)大學(xué)保藏。

1.1.2 試劑

葡萄糖（AR）、木糖（AR）、硫酸銨（AR）、KH2PO4（AR）、MgSO4·7H2O（AR）、瓊脂（BR）、蛋白胨、酵母粉、NaH2PO4（AR）、Na2HPO4（AR）。

1.1.3 培養(yǎng)基

YPD液體培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，酵母粉10 g。

葡萄糖-木糖發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖-木糖60 g，硫酸銨5 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，酵母粉0.5 g。

混合糖發(fā)酵培養(yǎng)基（1 L）：葡萄糖30 g，木糖30 g，硫酸銨5 g，磷酸二氫鉀1 g，七水合硫酸鎂0.5 g，酵母粉0.5 g。

酵母馴化用固體培養(yǎng)基（1 L）：木糖20～70 g，硫酸銨5 g，尿素5 g，酵母膏2 g，牛肉粉2 g，磷酸二氫鉀2 g，七水合硫酸鎂1 g，瓊脂14 g。

1.2 儀器與設(shè)備

LY-B0.025型壓力蒸汽滅菌器，武漢市鴻雁醫(yī)療器械制造有限公司產(chǎn)品；AR1140/C型電子分析天平，奧豪斯（上海）公司產(chǎn)品；SWO-CJ-IP型超凈工作臺(tái)，蘇靜集團(tuán)安泰公司產(chǎn)品；756MC紫外分光光度計(jì)，上海第三分析儀器廠產(chǎn)品；ZHP-Y2102L型智能恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；FE20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品；MC型酒精計(jì)，上海長(zhǎng)城儀器廠產(chǎn)品；WYT-4型手持糖量計(jì)，泉州中友光學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；RE-85Z型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海五相儀器儀表有限公司產(chǎn)品；溫度計(jì)，鄭州澤銘科技有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌種的活化

菌種復(fù)水活化：將保存在冰箱的熱帶假絲酵母CICC1779接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)液中，然后將活化后的菌液接種到Y(jié)PD固體培養(yǎng)基，放置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h（溫度為30℃）；挑選培養(yǎng)基茁壯的菌落接種到新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，重復(fù)2～3次，從而得到生長(zhǎng)良好的菌落。

1.3.2 菌種的馴化

通過(guò)五、六碳糖分別發(fā)酵可知，該酵母菌具備對(duì)六碳糖的發(fā)酵能力，可是對(duì)五碳糖發(fā)酵效率極低。因此，需將酵母馴化為可以利用木糖發(fā)酵產(chǎn)酒精的酵母菌，使其成為五、六碳糖共發(fā)酵型菌株。

配制木糖固體馴化培養(yǎng)基，將菌株接入酵母木糖馴化培養(yǎng)基馴化培養(yǎng)數(shù)代，并逐步提高發(fā)酵液中的初始木糖含量，初始木糖質(zhì)量濃度為20 g/L，培養(yǎng)72 h，挑選生長(zhǎng)茁壯的菌落再接種到30 g/L的培養(yǎng)基，以此逐步增加到70 g/L。每次都挑選培養(yǎng)基中茁壯的菌落接種到新的馴化培養(yǎng)基中培養(yǎng)，不斷重復(fù)此步驟，直至得到能在木糖高質(zhì)量濃度培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好的菌種。

1.4 測(cè)定方法

1.4.1 粗酶液的制備

100 mL菌液30℃過(guò)夜培養(yǎng)，于4℃條件下以轉(zhuǎn)速8 000 r/min離心15 min，用pH值7.4的PBS緩沖液洗滌2次，采用20 mL pH值7.4的PBS緩沖液重懸，-20℃凍融后，超聲波破碎。破碎后離心20 min，上清液即為酶粗提液。

1.4.2 指標(biāo)檢測(cè)

木糖還原酶和木糖脫氫酶活性測(cè)定參考文獻(xiàn)[7]，發(fā)酵液中乙醇含量測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[8-9]，發(fā)酵液中殘?zhí)橇康臏y(cè)定方法參考文獻(xiàn)[10]。

1.5 計(jì)算方法

1.6 單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)

選取發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH值為單因素進(jìn)行各因素試驗(yàn)，且在單因素的基礎(chǔ)上選擇發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、初始pH值進(jìn)行正交試驗(yàn)[11]。

正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與討論

2.1 馴化后的細(xì)胞篩選

經(jīng)過(guò)以木糖質(zhì)量濃度20～70 g/L的遞進(jìn)馴化，得到了能適應(yīng)在較高木糖質(zhì)量濃度的酵母菌。在70 g/L木糖質(zhì)量濃度下生長(zhǎng)茁壯的菌株挑選出來(lái)保存并進(jìn)行增殖培養(yǎng)，然后進(jìn)行試驗(yàn)[12]。

2.2 酵母菌生長(zhǎng)情況

2.2.1 酵母菌在葡萄糖環(huán)境下的生長(zhǎng)情況

酵母菌在葡萄糖環(huán)境下的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2。

圖2 酵母菌在葡萄糖環(huán)境下的生長(zhǎng)曲線

由圖2可知，馴化前、后酵母菌在以葡萄糖為唯一碳源條件下生長(zhǎng)曲線差別不大，前9 h菌體生長(zhǎng)緩慢，處在滯后期，之后生物量急劇增加；9～14 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；11 h為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期，此時(shí)酵母菌代謝旺盛，活性最強(qiáng)；14 h之后進(jìn)入穩(wěn)定期[13]。

2.2.2 酵母菌在木糖環(huán)境下的生長(zhǎng)情況

酵母菌在木糖環(huán)境下的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖3。

圖3 酵母菌在木糖環(huán)境下的生長(zhǎng)曲線

由圖3可知，馴化前、后酵母菌在以木糖為唯一碳源條件下生長(zhǎng)曲線有明顯差異，馴化后酵母菌生長(zhǎng)密度明顯增大，其OD值增速快、數(shù)值高，說(shuō)明經(jīng)過(guò)馴化后的酵母能以木糖為唯一碳源進(jìn)行自身的生長(zhǎng)繁殖[14-16]。

2.3 馴化后蛋白酶活性測(cè)定與分析

2.3.1 木糖還原酶活性

木糖還原酶的酶活力測(cè)定：取1 mL測(cè)定底物液I，加入0.1 mL酶提取液，保持30℃，于波長(zhǎng)340 nm處掃描反應(yīng)液OD值的變化速率，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程求出NADPH的氧化速率。以1 min氧化1 μmol NADPH所對(duì)應(yīng)的酶量定義為1 U。

關(guān)鍵酶活見(jiàn)表2。

表2 關(guān)鍵酶活/U

由表2可以看出，所表達(dá)的木糖還原酶蛋白有活性，但活性較低，而且對(duì)輔酶NADPH的親和力比NADH要高。

2.3.2 木糖醇脫氫酶活性

取1 mL測(cè)定底物液Ⅱ，加入0.1 mL酶提取液，保持30℃，10 min，于波長(zhǎng)340 nm處掃描反應(yīng)液OD值的變化速率，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方程求出NAD+的還原速率。以每1 min還原1 μmol NAD+所需的酶量定義為1 U。最終測(cè)得其結(jié)果為初始菌株約322 U，馴化后菌株約1 534 U。

2.4 酵母菌利用五、六碳糖發(fā)酵產(chǎn)酒精性能研究

2.4.1 馴化前、后酵母菌利用五碳糖發(fā)酵產(chǎn)酒精

初始酵母菌利用木糖生產(chǎn)酒精見(jiàn)圖4，馴化后酵母菌利用木糖生產(chǎn)酒精見(jiàn)圖5。

由圖4可以看出，初始酵母菌株對(duì)木糖的利用率很低。在48 h時(shí)，木糖利用率為41.01%，乙醇質(zhì)量濃度為3.30 g/L，乙醇得率為29.81%；在96 h時(shí)，乙醇質(zhì)量濃度達(dá)到最大值7.02 g/L，乙醇得率達(dá)到理論值的43.03%，木糖利用率為59.02%。

由圖5可知，馴化后酵母菌對(duì)木糖的利用情況相比馴化之前有所好轉(zhuǎn)，發(fā)酵效率大幅度提高。在48 h時(shí)，乙醇質(zhì)量濃度7.02 g/L，木糖利用率62.03%，乙醇得率達(dá)到理論得率的41.01%；在96 h時(shí)，乙醇質(zhì)量濃度12.96 g/L，木糖利用率80%，乙醇得率達(dá)到理論得率的58%。相比馴化之前，酵母菌對(duì)木糖的利用率提升了21.02%，乙醇質(zhì)量濃度高出將近6.03 g/L。

2.5 馴化后酵母菌利用五、六碳糖發(fā)酵產(chǎn)酒精的最適發(fā)酵條件研究

2.5.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖6。

圖4 初始酵母菌利用木糖生產(chǎn)酒精

圖5 馴化后酵母菌利用木糖生產(chǎn)酒精

圖6 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響

由圖6可以看出，隨著發(fā)酵時(shí)間增加，馴化前的酵母菌利用五、六碳糖共發(fā)酵產(chǎn)酒精的酒精質(zhì)量濃度有明顯提高。在72 h時(shí)達(dá)到最高值，隨著發(fā)酵時(shí)間繼續(xù)增加，酒精質(zhì)量濃度沒(méi)有明顯的變化。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48～72 h時(shí)，發(fā)酵時(shí)間越長(zhǎng)，酒精質(zhì)量濃度越大[17]；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)72 h時(shí)，發(fā)酵速度明顯降低，酒精質(zhì)量濃度沒(méi)有明顯增加。因此，72 h是改良型酵母菌發(fā)酵產(chǎn)酒精的最佳發(fā)酵時(shí)間。此時(shí)，木糖利用率為85.01%，乙醇質(zhì)量濃度為20.02 g/L，木糖醇轉(zhuǎn)化率為0.39 g/g。

2.5.2 發(fā)酵溫度對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響

發(fā)酵溫度對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖7。

圖7 發(fā)酵溫度對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響

由圖7可以看出，隨著發(fā)酵溫度升高，改良型酵母菌利用五、六碳糖共發(fā)酵產(chǎn)酒精的酒精質(zhì)量濃度有明顯提高。在36℃時(shí)達(dá)到最高值，隨著發(fā)酵溫度繼續(xù)升高，酒精質(zhì)量濃度有明顯降低。當(dāng)發(fā)酵溫度低于36℃時(shí)，發(fā)酵溫度越高越有利于酒精發(fā)酵[18]；而發(fā)酵溫度高于36℃時(shí)，由于發(fā)酵溫度過(guò)高，會(huì)影響酒精質(zhì)量濃度。因此，36℃是改良型酵母菌發(fā)酵產(chǎn)酒精的最適發(fā)酵溫度。此時(shí)，木糖利用率為90.02%，乙醇質(zhì)量濃度為20.20 g/L，木糖醇轉(zhuǎn)化率為0.38 g/g，

2.5.3 轉(zhuǎn)速對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響

轉(zhuǎn)速對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖8。

圖8 轉(zhuǎn)速對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響

由圖8可以看出，隨著轉(zhuǎn)速升高，馴化前的酵母菌利用五、六碳糖共發(fā)酵產(chǎn)酒精的酒精質(zhì)量濃度有明顯提高。在140 r/min時(shí)達(dá)到最高值，隨著發(fā)酵轉(zhuǎn)速繼續(xù)升高，酒精質(zhì)量濃度明顯降低。當(dāng)轉(zhuǎn)速為100～140 r/min時(shí)，轉(zhuǎn)速越高，酒精質(zhì)量濃度越高；當(dāng)轉(zhuǎn)速為140～180 r/min時(shí)，轉(zhuǎn)速越高越不利于酵母菌的生長(zhǎng)，酒精質(zhì)量濃度越低。因此，140 r/min是改良型酵母菌發(fā)酵產(chǎn)酒精的最適轉(zhuǎn)速。此時(shí)，木糖利用率為91%，乙醇質(zhì)量濃度為20.30 g/L，木糖醇轉(zhuǎn)化率為0.372 g/g。

2.5.4 初始pH值對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響

初始pH值對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響見(jiàn)圖9。

圖9 初始pH值對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響

由圖9可以看出，隨著初始pH值升高，改良型酵母菌利用五、六碳糖共發(fā)酵產(chǎn)酒精的酒精質(zhì)量濃度有明顯提高。在初始pH值為4時(shí)達(dá)到最高值，隨著初始pH值繼續(xù)升高，酒精質(zhì)量濃度明顯降低。當(dāng)初始pH值低于4時(shí)，初始pH值越高越有利于酒精發(fā)酵；當(dāng)初始pH值高于4時(shí)，初始pH值越高越不利于酵母菌的生長(zhǎng)，酒精質(zhì)量濃度越低。因此，初始pH值為4是改良型酵母菌發(fā)酵產(chǎn)酒精的最佳初始pH值。此時(shí)，木糖利用率為91.14%，乙醇質(zhì)量濃度為21.20 g/L，木糖醇轉(zhuǎn)化率為0.387 g/g。

2.5.5 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表3極差分析可知，3個(gè)因素對(duì)酒精質(zhì)量濃度影響的主次順序?yàn)锽＞A＞C，即初始pH值＞發(fā)酵溫度＞轉(zhuǎn)速。初始pH值對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響最為顯著，pH值不僅影響細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促進(jìn)或抑制微生物的生長(zhǎng)，還可影響環(huán)境中有害物質(zhì)對(duì)微生物的毒性；影響培養(yǎng)基中某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分解或中間代謝產(chǎn)物的解離，從而影響微生物對(duì)這些物質(zhì)的利用。發(fā)酵溫度對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響次之，發(fā)酵溫度影響了微生物細(xì)胞內(nèi)生物大分子的活性。轉(zhuǎn)速對(duì)酒精質(zhì)量濃度的影響最低，轉(zhuǎn)速影響了培養(yǎng)基中CO2的含量。通過(guò)極差分析得到的最佳條件為A2B2C2，即發(fā)酵溫度36℃，轉(zhuǎn)速140 r/min，初始pH值4。此時(shí)，乙醇質(zhì)量濃度為22.21 g/L，木糖利用率達(dá)到94.21%，木糖醇轉(zhuǎn)化率為0.39 g/g。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)馴化后的改良型酵母菌在不同環(huán)境下的生長(zhǎng)曲線研究，在以五碳糖為唯一碳源的條件下，改良型菌株的生長(zhǎng)情況良好，同時(shí)對(duì)馴化后的菌株進(jìn)行發(fā)酵性能研究，發(fā)現(xiàn)其利用五碳糖進(jìn)行發(fā)酵時(shí)，酒精產(chǎn)量能達(dá)到71%，木糖利用率也達(dá)到76%。研究表明，馴化后的酵母菌對(duì)五碳糖的利用率大幅度增長(zhǎng)；并測(cè)定馴化前后木糖還原酶和木糖脫氫酶，結(jié)果木糖還原酶活性對(duì)NADPH的親和力由≤1.3 U增加到11.0 U，NADH也由≤0.2 U增長(zhǎng)到1.4 U，木糖醇脫氫酶的活性也由322 U增長(zhǎng)到1 534 U。通過(guò)對(duì)馴化后的改良型酵母菌五、六碳糖共發(fā)酵在不同條件下的發(fā)酵效率測(cè)定，進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間72 h，發(fā)酵溫度36℃，轉(zhuǎn)速140 r/min，初始pH值4；對(duì)混合糖利用率達(dá)到94.21%，乙醇質(zhì)量濃度為22.21 g/L，糖醇轉(zhuǎn)化率為0.39 g/g（酵母代謝木糖的理論得率為0.46 g乙醇/g木糖，葡萄糖乙醇發(fā)酵理論得率0.51 g乙醇/g葡萄糖）。

[1]Cai Z，Zhang B，Li Y.Engineering Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation：reflections and perspe ctive[J].Biotechnology Journal，2012，7（1）：34-46．

[2]張強(qiáng)，冀偉，王一東.五碳糖和六碳糖共發(fā)酵生產(chǎn)酒精菌株選育的研究進(jìn)展[J].化工進(jìn)展，2013（1）：151-155.

[3]高衛(wèi)華，張敏華，劉成，等.能利用五碳糖和六碳糖生產(chǎn)乙醇的基因工程菌菌株的構(gòu)建[J].工業(yè)微生物，2004（1）：56-62.

[4]Aguilera A，Barrosj L.Surface roughness assessment on medium density fibreboard ripsawing using acoustic signals[J]. European Journal of Wood and Wood Products，2012，70（1/2/3）：369-372.

[5]Du Dai，Zhiyuan Hu，Gengqiang Pu，et al.Energy efficiency and potentials of cassava fuel ethanol in Guangxi region of China[J].Energy Conv Manag，2006，47：1 686-1 699.

[6]Arnado V.The Brazilian ethanol experiences fuelas fuel for transportation[R]．The Word Bank．Biomass Energy Workshop and Exhibition，2003.

[7]Chiotelli E，Le Meste M.Effect of small and large wheat starch granules on thermomechanical behavior of starch[J]. Cereal Chemistry，2002，79（2）：286-293.

[8]謝勇.氣相色譜法測(cè)定飲料中乙醇含量[J].分析測(cè)試技術(shù)與儀器，2002，8（1）：56-58.

[9]陳承.葡萄糖木糖混合發(fā)酵乙醇研究[D].北京：北京化工大學(xué)，2009.

[10]周穩(wěn)，付烈，王俊卿，等.重組運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇的研究[J].化學(xué)與生物工程，2011（5）：23-27.

[11]岳力.發(fā)酵木糖產(chǎn)乙醇菌株的篩選與鑒定[D].長(zhǎng)沙：湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2014（6）：16-25.

[12]張倩雯，王春霞，楊麗蕓，等.影響釀酒酵母發(fā)酵過(guò)程的因素分析[J].中國(guó)釀造，2015（12）：14-19.

[13]蔡其海.小麥B、C淀粉發(fā)酵乙醇的培養(yǎng)基優(yōu)化[J].安徽化工，2013（4）：57-59.

[14]陸冬梅.酒精工業(yè)分析[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2012：15-20.

[15]張軍合，饒平凡，張利真，等.小麥B淀粉酒精發(fā)酵工藝研究[J].食品科技，2015（7）：268-272.

[16]袁麗婷.玉米秸稈發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（3）：922-925.

[17]李海明，李瑞美，潘世明，等.木薯淀粉生產(chǎn)酒精的發(fā)酵工藝研究[J].福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013（6）：593-596.

[18]趙銀峰.小麥酒精發(fā)酵新工藝的研究[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2005.◇

Study of Candida Tropicalis Co-fermenting Ethanol Using Glucose and Xylose

DENG Yongdong1，LI Jinghong2，CHEN Xiaoju3，GU Yongzhong1，LV Xijun1，WU Xuefeng1，ZHENG Zhi1，JIANG Shaotong1，*LI Xingjiang1
（1.Key Laboratory of Intensive Processing of Agricultural Products in Anhui Province，Hefei University of Technology，Hefei，Anhui 230009，China；2.China Rural Technology Development Center，Beijing 100045，China；3.Chaohu College，Chaohu，Anhui 238000，China）

In order to improve the efficiency of xylose and glucose production by yeast，xylose is used as a substrate to cultivate Candida tropicalis.In the process of tame culture，the xylose concentration changed from 20～70 g/L，the xylose utilization rate increases by 21.02%，The utilization ratio of mixed sugar reach 94.21%，the ethanol content reach 22.21 g/L，and the sugar alcohol conversion rate reach 0.39 g/g（the theoretical yield of yeast xylose metabolism is 0.46 g ethanol/g xylose，glucose ethanol fermentation theoretical yield 0.51 g ethanol/g glucose）.The xylose reductase activity is also increased from≤1.3 U to 11.0 U affinity for NADPH，and NADH is increased from≤0.2 U to 1.4 U，and the activity of xylose dehydrogenase increased from 322 U to 1 534 U.The single factor and orthogonal experiments are carried out on the fermentation process of the domesticated yeast.The effects of fermentation time，rotational speed，fermentation temperature and nitial pH are studied.The results show that the optimum conditions are as follows：the fermentation time is 72 h，the rotational speed is 140 r/min，the fermentation temperature is 36℃，and the initial pH is 4.

yeast；xylose；domestication；enzyme activity

TQ223

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.08.001

1671-9646（2017）08a-0001-05

2017-06-14

安徽省重大科技專項(xiàng)“利用次淀粉漿廢液發(fā)酵酒精資源綜合利用的關(guān)鍵技術(shù)研究及產(chǎn)業(yè)化”（15CZZ03100）。

鄧永東（1992—），男，碩士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。

*通訊作者：李興江（1978—），男，博士，副教授，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程。