青蒿琥酯對糖尿病腎病大鼠Toll樣受體及白細(xì)胞介素-8表達(dá)的影響

楊志剛，張南楠

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，福州350004；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，福州350001

青蒿琥酯對糖尿病腎病大鼠Toll樣受體及白細(xì)胞介素-8表達(dá)的影響

楊志剛1，張南楠2

1.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，福州350004；2.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，福州350001

目的通過檢測糖尿病大鼠Toll樣受體4(Toll-like receptor 4,TLR4)和白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)的表達(dá)，探討青蒿琥酯保護(hù)腎臟的機(jī)制。方法 將80只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為4組，每組20只。成功建立大鼠糖尿病腎病模型后，正常對照組與模型對照組均予1m L/(kg·d)生理鹽水灌胃；青蒿琥酯小劑量組予10mg/(kg·d)青蒿琥酯灌胃；青蒿琥酯大劑量組予30 mg/(kg·d)青蒿琥酯灌胃。給藥8周后，檢測大鼠24 h尿蛋白定量、血肌酐、血尿素氮、TLR4蛋白表達(dá)及IL-8表達(dá)。結(jié)果青蒿琥酯大劑量組、青蒿琥酯小劑量組的體重高于模型對照組，腎臟肥大指數(shù)低于模型對照組，腎組織TLR4蛋白表達(dá)、血清及腎組織IL-8水平均低于模型對照組（均<0.05）。結(jié)論青蒿琥酯能夠抑制腎組織TLR4蛋白表達(dá)，減少IL-8釋放，改善糖尿病腎病模型大鼠的炎癥反應(yīng)。

青蒿琥酯；糖尿病腎病；類Toll受體4；白細(xì)胞介素-8

近年來，糖尿病腎病（diabeticnephropathy,DN）已成為糖尿病最常見的并發(fā)癥之一。DN主要損傷微小血管，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣[1]。病理機(jī)制主要為血流動(dòng)力學(xué)障礙、紊亂的糖代謝、氧化應(yīng)激反應(yīng)、胰島素抵抗及免疫炎癥反應(yīng)[2]，其中免疫炎癥反應(yīng)能夠?qū)е陆K末期腎病[3]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)與炎癥因子白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)是介導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)的主要因素，隨著DN進(jìn)展TLR4及IL-8逐步升高[4]。青蒿琥酯是青蒿素合成的衍生物，具有延緩細(xì)胞增生和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等特點(diǎn)[5]。前期研究結(jié)果顯示青蒿琥酯能夠抑制腎臟的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)腎臟組織修復(fù)，降低腎臟間質(zhì)中TLR4及IL-8的表達(dá)水平，減少炎癥因子釋放，然而關(guān)于青蒿琥酯干預(yù)DN腎組織中TLR4與IL-8表達(dá)的研究尚少[6]。本研究通過青蒿琥酯治療DN模型大鼠，檢測腎臟組織中TLR4與IL-8的表達(dá)變化，探討青蒿琥酯保護(hù)腎臟的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取SPF級(jí)雄性Wistar大鼠80只分籠飼養(yǎng)，體重（230±30）g，由浙江司康科技生物公司提供，許可證號(hào)SCXK(2015-0001)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度在20℃～25℃，相對濕度50%～60%，根據(jù)動(dòng)物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行處置。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 鏈脲佐菌素(STZ)購于上海博得生物技術(shù)公司；青蒿琥酯購于深圳中聯(lián)制藥股份有限公司；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗兔IgG購于南京喬伊生物科技有限公司；大鼠血肌酐檢測試劑盒及尿素氮檢測試劑盒均購于上海科瑞達(dá)生物科技有限公司；大鼠IL-8酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒購于南京凱瑞生物科技有限公司；大鼠TLR4多克隆抗體購自上海利豐生物科技有限公司；硝酸纖維素膜購自上海圣武達(dá)生物科技有限公司；ECL發(fā)光試劑購于北京順萊生物科技有限公司。

1.3 方法 將80只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，每天測量大鼠體重，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、青蒿琥酯大劑量組和青蒿琥酯小劑量組，每組20只。其中正常對照組予普通飼料喂養(yǎng)，模型對照組、青蒿琥酯大劑量組和青蒿琥酯小劑量組等造模大鼠喂養(yǎng)高糖高脂飼料，根據(jù)實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)[5]調(diào)配飼料配方。造模大鼠喂養(yǎng)至第4周末，禁食12 h后腹腔注射STZ 30mg/kg，建立2型糖尿病大鼠模型。模型成功建立的指標(biāo)為連續(xù)3次隨機(jī)血糖>16.7 mmol/L，造模成功后繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)大鼠4周后開始給藥。正常對照組與模型對照組予1m L/(kg·d)生理鹽水灌胃；青蒿琥酯大劑量組與青蒿琥酯小劑量組分別給予30mg/(kg·d)和10 mg/(kg·d)青蒿琥酯灌胃。各組連續(xù)給藥8周后檢測大鼠24h尿蛋白定量、血肌酐(serum creatinine,Cr)、血尿素氮(blood ureanitrogen,BUN)、TLR4蛋白表達(dá)及IL-8表達(dá)。

1.4 評(píng)價(jià)指標(biāo)

1.4.1 標(biāo)本采集 采用10%水合氯醛0.3m L/100 g腹腔注射麻醉大鼠，麻醉成功后從大鼠的心臟采血4～5mL，室溫下將血放置1 h，3 000 r/min離心10m in，收集上層血清并放入-80℃冰箱凍存。處死大鼠后取出大鼠左腎，用濾紙將大鼠腎臟血跡吸干，放置在電子天平測量大鼠腎臟質(zhì)量（g），計(jì)算大鼠腎臟肥大指數(shù)（kidney index,KI）=腎濕質(zhì)量（mg）/體重（g）。

1.4.2 檢測指標(biāo) 用代謝籠采集大鼠24h尿量，將標(biāo)本送至福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，檢測每只大鼠的24h尿蛋白。在各組大鼠禁食不禁水12h后采集大鼠靜脈血，檢測大鼠的體重與空腹血糖（fastingblood-glucose，F(xiàn)PG）、Cr及BUN。采用Western blot法檢測TLR4蛋白的表達(dá)，并用圖像分析軟件測量行TLR4蛋白灰度值，TLR4蛋白表達(dá)值=TLR4灰度值/內(nèi)參-actin灰度值。IL-8采用ELISA法進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照購買的試劑盒說明進(jìn)行操作，將大鼠標(biāo)本設(shè)定2個(gè)復(fù)孔，在450nm波長處檢測吸光度（optical density,OD）值，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線和OD值測量每個(gè)標(biāo)本的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組組間比較采用LSD-，<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FPG、體重及KI比較 青蒿琥酯大劑量組和青蒿琥酯小劑量組的體重高于模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。青蒿琥酯大劑量組和青蒿琥酯小劑量組的KI低于模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。見表1。

2.2 各組大鼠24 h尿蛋白、Cr及BUN比較 模型對照組、青蒿琥酯大劑量組及青蒿琥酯小劑量組24h尿蛋白、Cr和BUN水平均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。青蒿琥酯大劑量組及青蒿琥酯小劑量組的24h尿蛋白、Cr和BUN水平均低于模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。青蒿琥酯小劑量組24h尿蛋白、Cr和BUN水平均高于青蒿琥酯大劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠TLR4蛋白表達(dá)及IL-8水平比較 模型對照組、青蒿琥酯大劑量組和青蒿琥酯小劑量組的腎組織TLR4蛋白表達(dá)、血清及腎組織IL-8水平均高于正常對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。青蒿琥酯大劑量組和青蒿琥酯小劑量組的腎組織TLR4蛋白表達(dá)、血清及腎組織IL-8水平均低于模型對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。青蒿琥酯小劑量組腎組織TLR4蛋白表達(dá)、血清及腎組織IL-8水平均高于青蒿琥酯大劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）。見表3、圖1。

表1 各組大鼠FPG、體重及KI比較

表2 各組大鼠24 h尿蛋白、Cr及BUN比較

表3 各組大鼠TLR4蛋白表達(dá)及IL-8水平比較

圖1 各組大鼠腎組織TLR4蛋白表達(dá)

3 討論

胰島 細(xì)胞功能低下和胰島素抵抗是2型糖尿病的主要病因。老年人胰島細(xì)胞本身老化，靶細(xì)胞膜上胰島素受體數(shù)目減少，在胰島素抵抗的基礎(chǔ)上，胰島細(xì)胞長期過度負(fù)荷，分泌功能失去代償，致使血糖升高和糖代謝異常加重。因此老年人胰島素分泌顯著降低，血糖隨年齡的增長而升高。由于老年人糖尿病起病隱匿，更易誘發(fā)DN，臨床上尤為重視[7-8]。

近年來關(guān)于DN發(fā)病機(jī)制的研究已較為成熟。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病能夠干預(yù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的平衡，從而釋放炎癥介質(zhì)，導(dǎo)致機(jī)體的腎臟細(xì)胞出現(xiàn)損傷，嚴(yán)重者出現(xiàn)腎小球硬化及腎間質(zhì)纖維化等病理改變[9]。前期研究顯示DN患者存在炎癥細(xì)胞浸潤以及細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)水平升高，提示慢性持續(xù)性炎癥反應(yīng)是DN持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵因素[3]。本研究從炎癥反應(yīng)角度探討DN發(fā)展惡化的原因，采用腹腔注射STZ建立糖尿病大鼠模型，模型建立后造模大鼠體重明顯減輕，考慮由于大鼠胰島素分泌不足，機(jī)體不能充分利用葡萄糖，繼而分解脂肪和蛋白質(zhì)補(bǔ)充能量引起體重下降，而經(jīng)過用藥處理后的大鼠體重上升明顯，可能是大鼠糖尿病癥狀有所緩解所致。

TLR4是免疫炎癥反應(yīng)的重要參與因素[10]，其信號(hào)通路是建立在髓樣分化因子(Myeloid differentiation factor88,MyD88)依賴的或非MyD88依賴的信號(hào)通路上，作用于機(jī)體產(chǎn)生生物活性[11]，激活通路之后，開始合成或釋放各種炎癥介質(zhì)，包括IL-8和腫瘤壞死因子-等，產(chǎn)生相關(guān)炎癥反應(yīng)[12]。機(jī)體處于DN狀態(tài)時(shí)，能夠損傷細(xì)胞因子，通過干預(yù)TLR4介導(dǎo)生成大量炎癥因子，產(chǎn)生免疫反應(yīng)造成腎臟損傷[13]。另外研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)機(jī)體處于高糖水平時(shí)，TLR4-MyD88的信號(hào)通路被激活，生成了大量的下游炎性因子，說明高糖水平是引發(fā)TLR4活化的誘因之一，與M yD88依賴的信號(hào)途徑激活相關(guān)[14]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯大劑量組與青蒿琥酯小劑量組的腎組織TLR4蛋白表達(dá)、血清及腎組織IL-8水平均低于模型對照組（<0.05），與上述研究結(jié)果一致，從而證明了糖尿病狀態(tài)下，通過TLR4信號(hào)通路進(jìn)一步產(chǎn)生免疫炎癥，最終損傷腎臟。因此抑制TLR4介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)是改善DN腎臟損傷的關(guān)鍵因素[15]。

研究發(fā)現(xiàn)青蒿琥酯作為一類倍半萜類化合物，有免疫炎癥抑制作用[16]。本次研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯大劑量組與小劑量組的TLR4蛋白表達(dá)及IL-8水平均低于模型對照組，且青蒿琥酯大劑量組的治療效果優(yōu)于小劑量組，說明青蒿琥酯抑制TLR4表達(dá)、減少IL-8，降低腎臟炎癥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)，避免腎臟病理損傷。另外，青蒿琥酯大劑量組與青蒿琥酯小劑量組的24 h尿蛋白、Cr和BUN水平均低于模型對照組（ffffc7<0.05），說明DN的持續(xù)性炎癥反應(yīng)與TLR4的表達(dá)異常有相關(guān)性。同時(shí)腎組織IL-8高表達(dá)與24 h尿蛋白量、血Cr及BUN高表達(dá)密切相關(guān)，由此推斷IL-8可以作為判斷腎臟損傷程度的一個(gè)指標(biāo)。此外本研究發(fā)現(xiàn)模型對照組、青蒿琥酯大劑量組及青蒿琥酯小劑量組的組間FPG無明顯差異，表明青蒿琥酯修復(fù)腎臟病理損傷的機(jī)制與血糖無相關(guān)性。

綜上所述，青蒿琥酯能夠控制腎組織TLR4蛋白表達(dá)，減少IL-8釋放，改善DN的炎癥反應(yīng)。炎癥因子TLR4和IL-8可能協(xié)同參與了DN的發(fā)生發(fā)展。青蒿琥酯可以有效減少炎癥反應(yīng)，緩解DN導(dǎo)致的腎臟肥大，為臨床治療DN提供了新的理論依據(jù)。

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Effectof Artesunateon the Expression of Toll-like Receptorand IL-8 in Diabetic Nephropathy Rats

Yang Zhigang1*,Zhang Nannan2
1.Departmentof Endocrinology,People'sHospitalA ffiliated to Fujian University of TraditionalChineseMedicine,Fuzhou,350004; 2.DepartmentofOncology,Third A ffiliated Hospitalof FujianMedicalUniversity,Fuzhou,350001;Fujian Province,P.R.China

Objective To detect the expression of toll-like receptor4(TLR4)and interleukine-8(IL-8)in DN rats so as to explore the protective effectof artesunate on kidney.Methods 80Wistar ratswere random ly divided into 4 groups: normalcontrolgroup,modelcontrolgroup,high-doseartesunategroup and low-doseartesunategroup,20 in each;themodel ofdiabetic nephropathy(DN)wassetup in rats;1m L saline/(kg·d)wasapplied to rats in normalcontrolgroup andmodel controlgroup by gavage;10mg/(kg·d)artesunatewasapplied to ratsin low-doseartesunategroup by gavageand 30mg/(kg ·d)to rats in high-dose artesunate group by gavage;8 weeks later,totalurine protein in 24 hours,blood creatinine,urea nitrogen,and expression levelsof TLR4 and IL-8 in the ratsof the4 groupsweredetected.Results The ratweightin high-dose and low-doseartesunategroupwashigherwhile the kidney hypertrophy indexwas lower than those inmodelcontrolgroup,and theexpressionsof TLR4 and IL-8werealso lower than those inmodelcontrolgroup(<0.05).Conclusions Artesunate can effectively controltheexpression of renalTLR4 proteinexpression,decrease IL-8expression,and improveinflammatory response of DN.

artesunate;diabetic nephropathy;toll-like receptor4;interleukin-8

2017-06-20）

（本文編輯：朱音）

楊志剛，電子信箱:zhigang236@126.com

*Corresponding author:Yang Zhigang,E-mail:zhigang236@126.com