成都市區(qū)污染空氣中PM2.5對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響*

張霄龍 任杰 王正榮△ 應(yīng)正祺 王霞 黃禹瑤 后望 成姝婷

(1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院；2.四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院； 3.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

成都市區(qū)污染空氣中PM2.5對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響*

張霄龍1任杰1王正榮1△應(yīng)正祺1王霞2黃禹瑤3后望1成姝婷1

(1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院；2.四川大學(xué)華西臨床醫(yī)學(xué)院； 3.四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041)

目的：研究成都地區(qū)污染空氣中PM2.5微粒對大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響。方法：Morris水迷宮篩選后的雄性SD大鼠32只，隨機(jī)分為：對照組、PM2.5低劑量組、PM2.5中劑量組、PM2.5高劑量組(n=8)。用EM-2062A顆粒物采樣器采集2016年7月14日至7月30日成都市區(qū)污染嚴(yán)重區(qū)域空氣中的PM2.5微粒，制成混懸液后對大鼠進(jìn)行氣管滴注染毒處理，低、中、高劑量組PM2.5混懸液分別為0.96 mg·kg-1、3.84 mg·kg-1、和15.36 mg·kg-1，3周后以水迷宮實驗對比其學(xué)習(xí)記憶能力，ELISA檢測其肺組織IL-1β的水平。結(jié)果：與對照組相比，染毒大鼠的逃避潛伏期均有所增加，且高劑量組增加最多(P<0.05)，而有效區(qū)域運動時間長度則與染毒劑量呈反比。結(jié)論：成都地區(qū)污染空氣中PM2.5微粒能夠損害大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，這種損害與PM2.5微粒的濃度有關(guān)。

成都；PM2.5；大鼠；學(xué)習(xí)記憶能力

空氣污染一直是危害人類健康的重要因素之一，空氣污染物中的PM2.5因其粒徑小、表面積大、活性強(qiáng)、易吸附有毒有害物質(zhì)等而危害更甚。霧霾天氣的加劇引起了人們的研究興趣，從1999年起，國內(nèi)便開始有研究霧霾的主要污染物PM2.5的相關(guān)文獻(xiàn)[1]，并于2011年起爆發(fā)研究熱潮。成都的空氣質(zhì)量問題在近年來越來越嚴(yán)峻，其污染物與呼吸系統(tǒng)疾病的關(guān)聯(lián)也受到了廣泛的關(guān)注。從文獻(xiàn)中，我們可以了解到，PM2.5可以對大鼠的呼吸循環(huán)系統(tǒng)造成氧化損傷[2]。能夠刺激免疫系統(tǒng)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[3]。可以促使大鼠凝血，造成小血管栓塞[4]。還可以攻擊大鼠體細(xì)胞DNA，造成核酸損傷[5]。空氣污染的加劇是否在其他方面對人類的健康造成影響，這是值得我們特別關(guān)注的方面，特別是近年來中小學(xué)頻繁出現(xiàn)在PM2.5空氣質(zhì)量指數(shù)較高時宣布停課的情況，那么空氣污染是否會對生物體的學(xué)習(xí)記憶能力造成影響成為了我們的關(guān)注重點。

有研究者通過流行病學(xué)調(diào)研統(tǒng)計居住在不同污染程度地區(qū)成年人的健康狀況而得出了PM2.5會影響人類的學(xué)習(xí)記憶的結(jié)論[6]。但直接的實驗研究則尚未見有報道。然而，從流行病學(xué)角度的研究存在諸多偏倚，可能出現(xiàn)個體差異大、污染物侵襲程度不一、人口遷移等諸多問題。其數(shù)據(jù)雖然直接來源于人，但可能存在較大誤差。因此，有必要在嚴(yán)格的實驗條件下進(jìn)行動物實驗，驗證PM2.5對實驗動物學(xué)習(xí)記憶的影響以及產(chǎn)生這種影響的原因。目前已有關(guān)于PM2.5影響大鼠海馬中鉛鋁錳含量及神經(jīng)遞質(zhì)的研究[7]，但尚沒有關(guān)于PM2.5對大鼠學(xué)習(xí)記憶影響的報道，也沒有關(guān)于PM2.5染毒大鼠的迷宮行為學(xué)實驗。

本研究采集成都污染區(qū)域空氣中的PM2.5微粒來對大鼠進(jìn)行染毒處理，通過Morris水迷宮實驗對不同染毒劑量大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力進(jìn)行評估，并檢測其肺組織中白介素-1β的水平，以研究染毒劑量的PM2.5是否會對大鼠肺部造成炎癥影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級雄性SD大鼠(200～220g)40只，由四川省人民醫(yī)院實驗動物研究所提供。所有大鼠均自由進(jìn)食和飲水，待飼養(yǎng)1 周后開始實驗。

1.2 實驗儀器與實驗試劑

EM-2062A顆粒物采樣器(國技儀器，中國)，純水機(jī)(優(yōu)普，中國)，電子天平(Sartorius，德國)，WMT-100S Morris水迷宮(成都泰盟，中國)，酶標(biāo)儀(Biotek，美國)，恒溫培養(yǎng)箱、注射器及眼科剪、眼科鑷、玻璃勻漿器等均為國產(chǎn)。白介素-1β(IL-1β)測試盒(南京建成，中國)。

1.3 采集PM2.5微粒并制備混懸液

大氣PM2.5 微粒樣品由四川科信時代檢測技術(shù)有限公司于2016年7月14日至7月30日(共17天)在成都市武侯區(qū)科園南路9-1愛思特大廈樓頂(半徑2公里范圍內(nèi)有地鐵3號線和10號線施工工地以及南三環(huán)大量汽車流通過)采集，每天采集24 h。將采集到PM2.5的玻璃纖維濾膜放入超純水中，經(jīng)超聲振蕩洗脫、收集洗脫液、過濾、以及真空冷凍干燥，提取得到PM2.5微粒樣品。用電子天平秤取9.6 mg、38.4 mg、和153.6 mg的PM2.5微粒，分別溶于25 mL的生理鹽水配置成低、中、高劑量PM2.5混懸液，使其濃度分別為0.384 mg·mL-1、1.536 mg·mL-1、6.144 mg·mL-1。將三組PM2.5混懸液置于4℃冰箱保存，使用前超聲振蕩30min并高溫高壓滅菌，使混懸液無菌且PM2.5微粒均勻分散其中。

1.4 大鼠分組與PM2.5染毒造模

以Morris水迷宮實驗對所有大鼠進(jìn)行篩選，將篩選后的32只大鼠隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為對照組及PM2.5低、中、高劑量組。各組大鼠經(jīng)乙醚麻醉后，采用氣管滴注法染毒。低、中、高劑量組每只大鼠分別注入劑量為0.96 mg·kg-1、3.84 mg·kg-1、15.36 mg·kg-1的PM2.5混懸液，對照組按同樣方法注入生理鹽水，每周染毒2次，共3 w。

1.5 Morris水迷宮實驗

最后1次染毒1天后開始進(jìn)行Morris 水迷宮實驗以檢測各組大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。每只大鼠連續(xù)接受5天定位航行實驗(Place navigation)的訓(xùn)練并記錄其潛伏期。訓(xùn)練期間，每只大鼠分別從4 個象限的固定入水點進(jìn)入水迷宮中，并以登上平臺為最終目標(biāo)；若大鼠人水后60 s內(nèi)未能找到平臺，則人工引導(dǎo)其來到平臺位置并停留10 s。第6天撤去平臺進(jìn)行空間探索實驗(Spatial probe test)，將大鼠從與定位航行實驗相同的入水點放入水中，記錄其在原平臺所在象限內(nèi)游泳所花的時間，即有效區(qū)域運動時間。

1.6 采集樣本和肺組織IL-1β檢測

水迷宮實驗結(jié)束后處死大鼠，取肺組織保存于-80℃低溫冰箱待測。每個樣本秤取0.5 g肺組織在玻璃勻漿器中制成勻漿。按照白介素-1β(IL-1β)測試盒(南京建成)說明書，用ELISA 的方法檢測肺組織勻漿中IL-1β的濃度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行處理，結(jié)果數(shù)據(jù)以-X±SD表示。對Morris水迷宮中定位航行實驗的潛伏期采用重復(fù)測量數(shù)據(jù)的多因素方差分析，組間比較采用方差分析的兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5染毒對大鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

定位航行實驗的結(jié)果顯示，染毒大鼠的潛伏期均較對照組有所增加(P<0.05)，高劑量組潛伏期的增加明顯多于低劑量組和中劑量組(P<0.05)，但低劑量組和中劑量組潛伏期的增加差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖1。

圖1 大鼠定位航行實驗的潛伏期

空間探索實驗的結(jié)果顯示，對照組大鼠的有效區(qū)域運動時間明顯高于三組染毒大鼠(P<0.05)，染毒大鼠的有效區(qū)域運動時間長度與染毒計量呈反比，即高劑量組的有效區(qū)域運動時間短于中劑量組，中劑量組的有效區(qū)域運動時間短于低劑量組，見表1。

2.2 PM2.5染毒對大鼠肺組織的影響

ELISA結(jié)果顯示，對照組大鼠肺組織內(nèi)的IL-1β含量比低劑量組稍高(P>0.05)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；而中、高劑量組大鼠肺組織的IL-1β含量比對照組明顯升高(P<0.05)，見表2。

表1 空間探索實驗中大鼠游泳的有效區(qū)域運動時間±S，n=8)

注：與對照組相比，*P<0.05。

表2 大鼠肺組織勻漿中IL-1β的水平

注：與對照組相比，*P<0.05。

3 討論

成都市區(qū)現(xiàn)階段的大氣污染源主要來自汽車尾氣和工地施工。本實驗中，PM2.5的采集地點設(shè)在成都市區(qū)內(nèi)同時接近地鐵施工工地和大流量車流道路的地方，可以最大程度的模擬目前成都大氣中PM2.5的成分。從Morris水迷宮實驗的結(jié)果可知，染毒大鼠尋找平臺的空間學(xué)習(xí)記憶能力比對照組差，也就是說，成都空氣中的PM2.5確實會對大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力造成影響，而且這種影響與PM2.5的濃度有關(guān)，濃度越高，影響越大。從圖1我們可以看到，在定位航行實驗的第5天，低劑量組和中劑量組的潛伏期較之前有明顯降低，其中低劑量組的潛伏期時間更接近于對照組，而高劑量組的潛伏期則仍然較長。這說明較低濃度PM2.5對大鼠學(xué)習(xí)記憶的損害也許是可以恢復(fù)的，但高濃度PM2.5造成的損害則不易恢復(fù)。

考慮到PM2.5直接作用于大鼠的氣管和肺，而缺氧能夠?qū)е聦W(xué)習(xí)記憶的損傷[8]，因此本實驗通過檢測大鼠肺部IL-1β的水平，以判斷染毒大鼠肺部是否有炎癥。結(jié)果表明，低劑量的PM2.5混懸液滴注沒有引起大鼠肺部明顯的炎癥，但低劑量組大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶卻也受到了損害，而中劑量和高劑量的PM2.5混懸液滴注的確引起了其肺部一定程度的炎癥，因此，我們認(rèn)為，在PM2.5混懸液滴注引起的大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力損害中，肺部炎癥可能對具有促進(jìn)作用，但它并不是一個關(guān)鍵的因素。至于其中的機(jī)制，則需要進(jìn)一步研究。

1 汪安璞. 大氣氣溶膠研究新動向[J]. 環(huán)境化學(xué), 1999, 18(01): 10-15.

2 曲紅梅,牛靜萍,魁發(fā)瑞,等. 大氣中PM_(2.5)致大鼠呼吸道急性損傷作用[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2006, 22(05): 598-599.

3 肖純凌,王任群,趙肅,等. 大氣混合污染物對大鼠呼吸系統(tǒng)氧化損傷作用[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2006, 22(08): 935-936.

4 李志梅,段爭. PM2.5急性暴露對大鼠凝血功能的影響及其機(jī)制[A]. 中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)年會——2013第十四次全國呼吸病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C]. 中華醫(yī)學(xué)會、中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會, 2013, 1.

5 Meng Z, Zhang Q. Damage effects of dust storm PM2.5 on DNA in alveolar macrophages and lung cells of rats [J]. Food Chem Toxicol, 2007, 45(8): 1368-1374.

6 Gatto NM, Henderson VW, Hodis HN, et al. Components of air pollution and cognitive function in middle-aged and older adults in Los Angeles [J]. Neurotoxicology, 2014, 40: 1-7.

7 陳旭鋒,李太山,徐文哲,等. PM2.5染塵大鼠海馬中鉛鋁錳含量及神經(jīng)遞質(zhì)的變化[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2015, 32(01): 73-75.

8 Arteaga O, Revuelta M, Uriguen L, et al. Docosahexaenoicacid reduces cerebral damage and ameliorates long-term cognitive impairments caused by neonatal hypoxia-ischemia in rats [J]. Mol Neurobiol, 2016, [Epub ahead of print].

Effect of PM2.5 in the polluted air of Chengdu on rats′ learning and memory ability*

Zhang Xiao-long1, Ren Jie1, Wang Zheng-rong1△, Ying Zheng-qi1, Wang Xia2, Huang Yu-yao3, Hou Wang1, Cheng Shu-ting1

(1.College of Basic Medicine and Forensic Medicine, Sichuan University; 2.College of Clinic Medicine, Sichuan University; 3. College ofStomatology, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

Objective：To investigate the effect of PM2.5 in the air of Chengdu on rats′ spatial learning and memory ability by Morris water maze. Methods: Thirty-two male SD rats screened by Morris water maze were randomly divided into control group, PM2.5 lower dosage group, PM2.5 middle dosage group, and PM2.5 higher dosage group (n=8). The rats were exposed to PM2.5, which was collected by EM-2062A Particulates Sampler from July 14thto 30thof 2017 in Chengdu, by intratracheal instillation, and the exposing dosage was depended on rats′ mass, that is 0.96 mg·kg-1in lower dosage group, 3.84 mg·kg-1in middle dosage group, and 15.36 mg·kg-1in higher dosage group. Learning abilities of those rats were estimated with Morris water maze 3 weeks later, and the IL-1β level was tested by ELISA. Results: Compared to the control, the escape latency time of treated rats was longer, and the higher dosage group has the longest escape latency time (P<0.05), while there was a reverse correlation between the effective regional time of rats and PM2.5 dosage. Conclusion: PM2.5 in the polluted air of Chengdu has the ability to impair rats′ ability of learning and memorizing, and this impairment was associated to the concentration of PM2.5.

Chengdu; PM2.5; Rats; Ability of learning and memorizing

四川大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計劃項目(201610610100)

張霄龍，男，2014級本科生，Email：462251694@qq.com

△通訊作者：王正榮，男，教授，主要從事時間生物學(xué)研究，Email：wangzhengrong@126.com。

2017-4-21)