利用高通量轉錄組測序對肺鱗癌基因型的研究

雄英 李明珍 張攀攀 張理意 楊躍

目前肺癌的發病率和死亡率在全球范圍內位于前列，對公眾健康造成極大危害。肺癌的死亡人數在過去的三十年上升了465%，約增長了5倍，已經成為我們國家惡性腫瘤死亡原因中第一位。所以現在人們把肺癌稱為我們國家癌癥領域的“第一殺手”。其中非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）的發病率占到了85%，主要包括腺癌、鱗癌以及大細胞癌，其中肺鱗癌是最常見的病理類型之一，占NSCLC的30%-40%[1,2]。肺鱗癌又稱肺鱗狀上皮細胞癌，以中央型肺癌多見，并有胸管腔內生長的傾向，早期常引發支氣管狹窄或阻塞性肺炎[2]。

目前分子靶向治療的出現徹底改變了癌癥治療格局。在肺腺癌中，分子靶向治療獲得了較為廣泛的應用，但是在肺鱗狀細胞癌患者的治療中還沒有實現。高通量二代測序作為一種新的實驗技術，能夠為我們提供詳細、特異的信息，最重要的是它的正確率和高特異性[3,4]。所以從現實意義的角度出發，本研究的目的在于利用高通量二代測序技術，通過查找正常組織與腫瘤組織在基因表達上的差異，為實現肺鱗癌的分子靶向治療提供基礎。因此，我們針對5對肺癌鱗癌患者的腫瘤組織和正常肺組織進行高通量轉錄組測序，發現差異表達基因，并且對其差異基因SPRR進行肺癌細胞系的驗證，有望為肺鱗癌靶向治療提供新的靶點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集5例經病理診斷為肺鱗癌患者的腫瘤組織及正常肺組織的新鮮標本，年齡45歲-65歲。標本收集后分立即置于液氮中速凍，保存于-80oC冰箱中，用于實驗檢測。肺癌細胞系H520、GLC82、A549、H1299及PC9使用1640培養基、37 °C的CO2溫箱培養。

1.2 總RNA提取 取等量肺癌癌組織及正常肺組織，液氮中磨碎；加入TRIZOL Reagent，室溫孵育5 min；加入200 μL氯仿劇烈振蕩15 s，室溫孵育10 min；4oC，12,000 rpm，離心15 min。吸取上層含有RNA的水相入新管，加500 μL異丙醇沉淀RNA，室溫孵育10 min；4oC，12,000 rpm，離心15 min。棄上清，加1 mL的75%乙醇洗滌RNA沉淀，4oC，7,500 rpm，離心5 min，用20 pL DEPC水溶解RNA。用紫外分光光度計測定RNA的含量，-80oC冰箱保存。

1.3 轉錄組文庫制備及上機測序 利用Oligo dT微珠富集純化mRNA并進行片段化處理，在3末端加堿基A、連接測序接頭，割膠，純化并回收200 bp-500 bp之間的cDNA片段。PCR擴增后完成測序文庫的制備。對測序文庫進行質量控制，構件好的文庫用Illumina Hiseq2500進行測序，以fastq格式輸出。

1.4 生物信息分析 將轉錄組測序樣本，分別用TopHat回貼人基因組，其樣本比對率需達到90%以上。用Cufflinks分別重新構建轉錄本，對轉錄組進行鑒定，合并轉錄本，得到一個統一的轉錄本集合。對轉錄本進行鑒定質量的評估后，最后采用cuffdiff鑒定正常組織樣本組和相對應的肺癌組織樣本組之間的差異編碼基因。

1.5 實時定量PCR 使用TRIzol提取肺癌細胞系總RNA，2 μg總RNA逆轉成cDNA，使用SYBR Green PCR試劑盒，羅氏480儀器檢測差異基因的表達。反應條件，95oC 5 min；95oC 15 s，60oC 30 s，40個循環；72oC 5 min。β-actin作為對照，計算公式：2-ΔCt，ΔCt=Ct目的基因-Ct對照。

2 結果

2.1 肺鱗癌轉錄組概況 利用高通量轉錄組測序技術，檢測5對肺癌組織及正常肺組織的標本，利用生物信息學分析篩選差異基因。用cuffdiff鑒定正常組織樣本組和相對應的肺癌組織樣本組之間的差異基因，發現按照cuffdiff的標準（上下調2倍；p-value≤0.05；q-value≤0.05），鑒定出來40個差異基因。不考慮q-value之后，差異基因數目明顯上升，為534個（q-value是基于p-value的再統計，p-value是樣本的一個基本檢驗幾率）。

2.2 篩選肺鱗癌組織高表達的前10個基因 基于轉錄組測序檢測5對配對肺癌組織及正常肺組織的標本，重點關注于肺癌腫瘤組織高表達的前10個關鍵基因（表1）。正常肺組織測序的FPKM平均值為0.222,4，肺癌腫瘤組織FPKM平均值為233.4，則腫瘤組織前10位差異基因的表達量是正常組織的1,049倍。

在這10個基因中，SPRR1A、SPRR1B、SPRR2D、SPRR2E和SPRR3為同一家族成員，其FPKM值在正常肺組織與腫瘤組織中分別為0.430,2和444.72，二者相差1,033倍。其中又以SPRR3在肺腫瘤組織與正常組織之間的差異最大，為1,546倍（表2）。

2.3 肺癌細胞系中SPRR家族基因的表達情況 采用熒光定量PCR的方法檢測了前10位差異基因在肺癌細胞系中的表達情況，見圖1。H520為肺鱗癌細胞，GLC82、A549、H1299、PC9為肺腺癌細胞。其中H1299為淋巴結轉移的肺癌細胞系，PC9是表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epithelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs）敏感的肺癌細胞系。從圖1中可以看出SPRR1A、SPRR1B、SPRR2D、SPRR2E和SPRR3在肺癌細胞中廣泛表達，此5類亞型于淋巴結轉移的H1299細胞中均有較高表達，均高于在未轉移的肺腺癌細胞系A549的表達水平。

表 1 肺鱗癌組織中高表達的前10個基因Tab 1 The top ten genes highly expressed in the lung squamous carcinoma

表 2 SPRRs家族基因在正常肺組織與肺癌腫瘤組織中的表達Tab 2 Expression of SPRRs family in the normal tissues and lung cancer tissues

3 討論

近十年來，基于NSCLC驅動基因的個體化靶向診治研究拉開了帷幕，并取得了革命性進展而應用于臨床，例如EGFR突變基礎上的TKIs，基于EML4-ALK融合基因的抑制劑等主要應用于肺腺癌[5]。然而，針對肺鱗癌的靶向診治研究十分有限。此外，隨著新一代高通量測序技術的快速發展，轉錄組測序已成為基因表達和轉錄組分析新的重要手段。轉錄組測序能夠快速并全面的獲取組織中幾乎所有轉錄本RNA的序列信息，是目前常用的高通量分析手段，已成為腫瘤研究的重要技術支撐。

本研究正是利用轉錄組測序技術檢測了5對肺癌組織及正常肺組織的基因型的改變，并利用生物信息學分析篩選出與腫瘤密切相關的排在前10位的基因，包括SPRR1A、SPRR1B、SPRR2D、SPRR2E、SPRR3、PRAME、MAGEA3、IL36G、GAGE12J、TMPRSS11D。其中，位于差異基因前5位的SPRR1A、SPRR1B、SPRR2D、SPRR2E和SPRR3基因同屬于SPRRs家族，編碼一類富含脯氨酸的蛋白[6]，而有研究表明這些基因亞型在表達上有一定的偏向性。SPRR1A和SPRR1B基因表達與口腔上皮細胞的屏障作用相關[7]，SPRR2基因亞型在消化道疾病以及皮膚病的炎癥反應中表達水平有所增加[8,9]。

IL36G基因在組織發生損傷與修復過程中表達增高，可見與炎癥和免疫反應密切相關[10,11]。也有報道顯示IL36G基因與皮膚病的炎性反應相關[12]。據報道炎癥反應能夠促進腫瘤的發生，并與腫瘤發生轉移密切相關。而本研究結果顯示SPRRs家族及IL36G在癌組織高表達的情況可能參與了炎癥反應且具有促進肺癌發生的作用。GAGE12J基因在胎兒和腫瘤組織中表達，是腫瘤/睪丸抗原家族成員之一。有報道[13,14]發現其在腦膜瘤和神經鞘瘤中可與其他基因相互作用。TMPRSS11D屬于II型跨膜絲氨酸蛋白酶亞家族成員，在宮頸鱗癌和食管鱗癌的形成過程中缺失[15]。PRAME是腫瘤/睪丸抗原的一種，可作為潛在的免疫治療的靶點，其表達狀態與上皮性卵巢癌的啟動子低甲基化有關[16]。MAGEA3同樣也屬于腫瘤/睪丸抗原的一種，ORIS與其啟動子結合而調控肺癌的轉錄活性[17]。

圖 1 柱狀圖顯示SPRRs家族基因包括SPRR1A、SPRR1B、SPRR2D、SPRR2E和SPRR3在肺癌細胞系中的表達情況（2-ΔCt value）。Fig 1 The histogram shows expression of SPRRs family genes including SPRR1A, SPRR1B, SPRR2D, SPRR2E and SPRR3 in the lung cancer cells lines (2-ΔCt value).

我們進一步在肺癌細胞系中檢測差異基因SPRRs家族的表達狀態發現，在淋巴結轉移的細胞系H1299中，SPRR1A、SPRR1B、SPRR2D、SPRR2E和SPRR3均呈高表達狀態。前期的研究發現SPRRs家族基因在膽管上皮細胞中能夠增加對損傷的抵抗，并與EMT密切相關[18]。另有研究[19]表明長鏈非編碼RNA MALAT-1通過調控SPRRs家族基因而影響了舌鱗狀細胞癌的遠端轉移。而我們的研究亦發現此家族基因在局部轉移的細胞中高表達，提示有可能在肺癌細胞發生轉移過程中發揮著重要作用。

目前隨著臨床研究的深入，證明了個體化的腫瘤治療相比傳統的方法更加安全有效。而本研究利用轉錄組測序技術，通過查找正常肺組織與肺癌腫瘤組織在基因表達上的差異，為實現肺鱗癌的分子靶向治療以及尋找更多的分子治療靶點提供了可行性。