γ射線聯(lián)合肉桂精油對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑制機(jī)制

呂 飛，徐 靜，魏倩倩，高 飛，周緒霞，丁玉庭，劉 璘*

（浙江工業(yè)大學(xué)食品工程與質(zhì)量控制研究所，浙江 杭州 310014）

γ射線聯(lián)合肉桂精油對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑制機(jī)制

呂 飛，徐 靜，魏倩倩，高 飛，周緒霞，丁玉庭，劉 璘*

（浙江工業(yè)大學(xué)食品工程與質(zhì)量控制研究所，浙江 杭州 310014）

研究γ射線輻照和肉桂精油聯(lián)合對(duì)腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）的抑制效果，分析聯(lián)合作用對(duì)S. putrefaciens的抑制機(jī)制。結(jié)果表明：輻照D10（菌落總數(shù)降低到原始數(shù)量的10%所需要的輻照劑量）隨著肉桂精油質(zhì)量濃度的增加而減少，S. putrefaciens對(duì)輻照的相對(duì)敏感度隨肉桂精油質(zhì)量濃度的增加而增加。輻照和肉桂精油聯(lián)合對(duì)S. putrefaciens具有較好的抑制作用，其對(duì)S. putrefaciens細(xì)胞形態(tài)、胞內(nèi)外ATP、胞內(nèi)pH值、膜蛋白以及膜脂肪酸等均具有顯著破壞作用。聯(lián)合作用處理S. putrefaciens的膜蛋白40 kD亞基減少，18 kD亞基增加，且使S. putrefaciens主要膜脂肪酸C14∶0、C16∶0、C16∶1、C17∶1、C18∶1顯著減少（P＜0.05），其機(jī)理可能在于γ射線輻照增加了肉桂精油對(duì)S. putrefaciens細(xì)胞膜的破壞，從而導(dǎo)致其死亡。

輻照；肉桂精油；腐敗希瓦氏菌；聯(lián)合作用；抑菌機(jī)理

水產(chǎn)品富含蛋白質(zhì)，組織質(zhì)地脆弱，極易受到微生物作用而腐敗變質(zhì)。腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）是一種典型的水產(chǎn)品特定腐敗菌[1-3]，腐敗活性較強(qiáng)，能產(chǎn)生H2S，還原氧化三甲胺（trimethylamine oxide，TMAO）成三甲胺（trimethylamine，TMA），參與蛋白水解和脂肪分解的過程，產(chǎn)生令人不愉快的氣味，從而造成食品的腐敗[4-5]。肉桂精油具有較強(qiáng)的抗菌活性[6]，能夠抑制食品腐敗微生物的生長，但是由于其具有刺激性辛辣味，高濃度對(duì)食品風(fēng)味造成一定的影響。γ射線輻照作為一種高新滅菌技術(shù)，可消除食品中的致病菌和腐敗菌，達(dá)到食品保藏或保鮮的目的。但高劑量輻照所造成的“輻照味”將嚴(yán)重影響肉類及其制品的品質(zhì)，這是輻照廣泛應(yīng)用于肉類制品中的主要技術(shù)障礙。

當(dāng)前，針對(duì)精油和輻照對(duì)細(xì)菌作用機(jī)理的研究已有報(bào)道。Ultee等[7]在研究香芹酚對(duì)蠟狀芽孢桿菌的抑菌機(jī)理的過程中，發(fā)現(xiàn)香芹酚能夠改變蠟狀芽孢桿菌細(xì)胞膜的通透性，使得細(xì)胞內(nèi)K＋外流，細(xì)胞膜電位和細(xì)胞內(nèi)pH值下降，同時(shí)造成細(xì)胞內(nèi)ATP的合成受到抑制。林雅慧[8]發(fā)現(xiàn)芳樟油能夠改變一部分大腸桿菌菌體蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。γ射線輻照主要作用部位為細(xì)胞間質(zhì)，當(dāng)受到高能電子射線照射，微生物細(xì)胞間質(zhì)會(huì)發(fā)生電離和化學(xué)作用，導(dǎo)致胞內(nèi)的物質(zhì)形成離子、激發(fā)態(tài)或分子碎片，另外也會(huì)使得細(xì)胞內(nèi)水分經(jīng)輻照和電離作用產(chǎn)生各種游離基和過氧化氫而與其他物質(zhì)作用，生成新的化合物，導(dǎo)致細(xì)胞的生理活動(dòng)發(fā)生紊亂而死亡[9-10]。

為充分抑制水產(chǎn)品腐敗菌的生長，減少精油和輻照用量，本實(shí)驗(yàn)將肉桂精油和γ射線輻照聯(lián)合應(yīng)用，觀察兩者對(duì)S. putrefaciens的抑制效果，并在此基礎(chǔ)上研究兩者對(duì)S. putrefaciens細(xì)胞形態(tài)、胞內(nèi)外ATP濃度、胞內(nèi)pH值、細(xì)胞膜蛋白、細(xì)胞膜脂肪酸等的影響，探究兩者聯(lián)合對(duì)S. putrefaciens的抑制機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂精油由艾園有限公司（澳大利亞）提供，通過水蒸氣蒸餾法從錫蘭肉桂的葉中提取得到。腐敗希瓦氏菌菌株（S. putrefaciens CICC 22940）由中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。γ射線輻照在浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物與核技術(shù)利用研究所進(jìn)行。

P0010BCA試劑盒 碧云天生物科技公司；細(xì)菌膜蛋白提取試劑盒 貝博生物科技有限公司；脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Finngan Trace氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀 美國Thermo公司；HYJD超純水器 杭州永潔達(dá)凈化科技有限公司；BS-223S型精密電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；UV759型紫外分光光度計(jì) 上海奧譜勒儀器有限公司；SpectraMax M2型酶標(biāo)儀 美國分子儀器公司；冷凍干燥機(jī) 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DYCZ-24EN型雙垂直電泳儀 北京六一儀器廠；2000凝膠成像分析系統(tǒng) 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 肉桂精油的乳化

取所需不同體積的肉桂精油加入到含有1%吐溫-80的去離子水中，加塞后漩渦振蕩5 min，再超聲分散10 min，制備穩(wěn)定的精油乳化體系。

1.3.2 S. putrefaciens菌懸液的制備

取微量活化的S. putrefaciens菌懸液接種至100 mL營養(yǎng)肉湯，培養(yǎng)5 h，收集菌液，配制成108CFU/mL的S. putrefaciens菌懸液。

1.3.3 γ射線輻照S. putrefaciens的D10和相對(duì)敏感度的測定

取108CFU/mL的S. putrefaciens菌懸液，分別進(jìn)行如下處理：Ⅰ：未處理（CK）；Ⅱ：0.0875 μL/mL肉桂精油處理；Ⅲ：0.175 0 μL/mL肉桂精油處理；Ⅳ：0.350 0 μL/mL肉桂精油處理，然后進(jìn)行γ射線輻照處理。γ射線輻照的輻照劑量依次為0.030、0.050、0.080、0.010、0.150、0.200 kGy，輻照源為137Cs，以0.10 kGy/min的輻照劑量率進(jìn)行輻照，采用英國國家物理實(shí)驗(yàn)室放射量測定儀進(jìn)行輻照計(jì)量測定校準(zhǔn)。輻照后的各處理組用0.85%生理鹽水進(jìn)行適當(dāng)梯度稀釋后，涂布于營養(yǎng)瓊脂平板，30 ℃培養(yǎng)（48±2） h后計(jì)數(shù)，每個(gè)輻照劑量設(shè)置3 個(gè)平行。

γ射線輻照D10[11]和相對(duì)輻照敏感度（relative irradiation sensitivity，RIS）[12]按公式（1）～（3）計(jì)算。

式中：N為輻照后的存活菌落總數(shù)/（CFU/mL）；N0為輻照前的初始菌落總數(shù)/（CFU/mL）；D為菌落總數(shù)從N0降到N所需的輻照劑量/kGy；b為輻照劑量與細(xì)菌存活率的線性擬合方程的斜率；D10為輻照處理殺滅90%的微生物所需的輻照劑量/kGy，即菌落總數(shù)降低到原始數(shù)量的10%所需要的輻照劑量/kGy；D10，對(duì)照為空白對(duì)照組D10；D10，精油為精油處理組的D10。菌落總數(shù)的計(jì)算方法按照GB 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》的方法進(jìn)行。

1.3.4 γ射線輻照和肉桂精油聯(lián)合處理S. putrefaciens

取108CFU/mL S. putrefaciens菌懸液各100 mL，做如下處理：CK：未添加肉桂精油；G：0.080 kGy γ射線輻照；C1：0.175 μL/mL肉桂精油；C1＋G：0.175 μL/mL肉桂精油和0.080 kGy γ射線輻照聯(lián)合使用；C2：0.350μL/mL肉桂精油，每組處理設(shè)置3 個(gè)平行。

1.3.5 S. putrefaciens活性的測定

不同處理下S. putrefaciens每隔0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0 h取樣1 mL于9 mL 0.85%生理鹽水中進(jìn)行適當(dāng)?shù)?0 倍梯度稀釋后涂布平板，30 ℃培養(yǎng)（48±2） h后計(jì)數(shù)，以平板計(jì)數(shù)的對(duì)數(shù)值（lg （CFU/mL））來表征S. putrefaciens的細(xì)菌活性。

1.3.6 細(xì)胞形態(tài)變化的分析

利用掃描電子顯微鏡分析法分析不同處理下S. putrefaciens細(xì)胞形態(tài)的變化[13]。

1.3.7 胞內(nèi)外ATP的測定

ATP的測定參考Lee[14]、Carson[15]和Siragusa[16]的方法，并做略微修改。取不同處理的S. putrefaciens菌懸液，8000×g離心15 min后，分別得到上清液（上清液代表胞外ATP濃度，ATP外）和沉淀（沉淀代表胞內(nèi)ATP濃度，ATP內(nèi)），使用ATP檢測試劑盒來測定S. putrefaciens胞內(nèi)外的ATP濃度。

1.3.8 胞內(nèi)pH值的測定

取不同處理的108CFU/mL的S. putrefaciens菌懸液，8000×g離心15 min，用5 mmol/L含50 mmol/L乙二胺四乙酸的羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液8 000×g離心洗滌15 min，3 次后重新溶解，根據(jù)490 nm與440 nm波長處熒光強(qiáng)度比值，查pH值校準(zhǔn)曲線[17-19]，求得各個(gè)處理對(duì)應(yīng)的胞內(nèi)pH值（pH內(nèi)）。

1.3.9 膜蛋白電泳分析

蛋白質(zhì)的定量曲線測定使用BCA試劑盒進(jìn)行測定[20]。膜蛋白的提取方法參考細(xì)菌膜蛋白提取試劑盒說明書，并作略微調(diào)整[21]。膜蛋白的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）所需的各類試劑按照汪家政[22]、郭堯君[23]等的方法進(jìn)行配制。電泳時(shí)的電壓分別為：濃縮膠的電泳電壓為80 V，分離膠的電泳電壓為120 V。電泳結(jié)束后染色脫色，直到蛋白質(zhì)條帶清晰后用凝膠成像系統(tǒng)拍照，分析結(jié)果。

1.3.10 膜脂肪酸含量測定

取不同處理S. putrefaciens菌懸液，0 ℃、8000×g離心10 min，棄去上清液，沉淀用磷酸緩沖液（pH 7.0，0.1 mol/L）離心洗滌3 次后，重懸于磷酸緩沖液（pH 7.0，0.1 mol/L），凍干。將冷干S. putrefaciens粉末用于細(xì)胞膜脂肪酸的提取，在脂肪酸色譜分析前，將脂肪酸衍生為易揮發(fā)的脂肪酸甲酯[24]。S. putrefaciens膜脂肪酸的甲酯化參考王瑞白等[25]的方法，并做適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜分析測定脂肪酸含量[26]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0軟件繪圖，SPSS 19.0軟件進(jìn)行相關(guān)性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表述為±s（n=3），差異性分析采用單因素方差分析方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 γ射線輻照S. putrefaciens的D10和相對(duì)輻照敏感度

D10值用來表征不同處理下微生物的輻射抗性，是選擇合適輻照殺菌劑量的重要參數(shù)[27]。不同劑量肉桂精油處理的S. putrefaciens的D10和RIS的結(jié)果見表1。隨著精油劑量的增加，γ射線輻照S. putrefaciens的D10值顯著下降（P＜0.05），D10由未加精油的空白對(duì)照組的0.133 kGy下降到0.350 0 μL/mL精油處理的0.056 kGy，同時(shí)，相對(duì)輻照敏感度隨精油劑量的提高而增加。結(jié)果說明隨精油劑量的提高，S. putrefaciens對(duì)輻照的耐受能力下降。在添加精油的條件下，較低的γ射線輻照劑量即可殺死細(xì)菌[12]。

表 1 γ射線輻照S. putrefaciens的D10和相對(duì)輻照敏感度Table 1 D10and relative irradiation sensitivity of S. putrefaciens

2.2 γ射線輻照和肉桂精油聯(lián)合作用對(duì)S. putrefaciens生長的影響

圖 1 γ射線輻照和肉桂精油對(duì)S. putrefaciens活性的影響Fig. 1 Effect of γ irradiation combined with CEO on cell viability of S. putrefaciens

γ射線輻照和肉桂精油處理對(duì)S. putrefaciens生長的影響如圖1所示。處理組C2對(duì)細(xì)菌的抑制作用最強(qiáng)，C1＋G、C1、G組次之，未處理組CK細(xì)菌的生長能力最強(qiáng)。C1＋G組對(duì)S. putrefaciens的活性的抑制效果優(yōu)于C1和G組，說明γ射線和肉桂精油聯(lián)合使用可以顯著降低S. putrefaciens的活性（P＜0.05），這與2.1節(jié)研究結(jié)果一致。Cox等[28]的研究發(fā)現(xiàn)茶樹精油可快速抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌的活性，且隨著茶樹精油質(zhì)量濃度的提高，對(duì)細(xì)菌活性的抑制作用增強(qiáng)。γ射線輻照對(duì)細(xì)菌活性抑制研究文獻(xiàn)亦有報(bào)道[29]，但肉桂精油和γ射線輻照聯(lián)合作用對(duì)S. putrefaciens抑制研究則鮮見報(bào)道。

2.3 γ射線輻照聯(lián)合肉桂精油對(duì)S. putrefaciens細(xì)胞形態(tài)的影響

不同處理對(duì)S. putrefaciens細(xì)胞外部形態(tài)的影響如圖2所示。與CK組相比，G組的S. putrefaciens的整體形態(tài)并未發(fā)生明顯改變，但其表面略顯不平整。C1、C1＋G、C2組對(duì)S. putrefaciens的細(xì)胞外部形態(tài)的影響較為明顯，使得S. putrefaciens表面變得不光滑，部分細(xì)胞被破壞。其中，C1＋G和C2對(duì)細(xì)胞形態(tài)的作用效果更為明顯，大部分細(xì)胞遭到破壞，且C1＋G和C2組的作用效果相近，這說明γ射線輻照和肉桂精油聯(lián)合作用對(duì)S. putrefaciens的細(xì)胞形態(tài)的影響更大。另外，C1＋G組對(duì)細(xì)胞形態(tài)的破壞效果比C1組強(qiáng)，說明γ射線輻照可以協(xié)助肉桂精油促進(jìn)其對(duì)細(xì)胞形態(tài)的破壞作用。李婭男等[30]發(fā)現(xiàn)牛至精油和羅勒精油復(fù)配處理大腸桿菌3 h后，部分菌體出現(xiàn)溢裂，表面形成溝痕，并且伴有一定的萎縮跡象，牛至精油和佛手柑精油復(fù)配處理枯草芽飽桿菌3 h后，細(xì)胞表面變得粗糙，菌體發(fā)生嚴(yán)重的斷裂和溶解，并且伴有菌體碎片的產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)γ射線對(duì)S. putrefaciens細(xì)胞形態(tài)影響較小。γ射線輻照主要通過高能射線能夠穿過細(xì)胞而作用于細(xì)胞內(nèi)的大分子物質(zhì)，DNA和酶遭到破壞，使其形成離子、激發(fā)態(tài)或分子碎片，從而引發(fā)微生物死亡[10]。

圖 2 S. putrefaciens掃電子顯微鏡圖Fig. 2 Scanning electron microphotographs of S. putrefaciens

2.4 γ射線輻照聯(lián)合肉桂精油對(duì)S. putrefaciens胞內(nèi)外ATP的影響

圖 3 S. putrefaciens的ATP內(nèi)和ATP外濃度變化Fig. 3 Effect of γ irradiation combined with CEO on ATP concentration inside and outside S. putrefaciens cells

細(xì)菌細(xì)胞膜的破壞和與膜相關(guān)的能量轉(zhuǎn)換系統(tǒng)有著密切的關(guān)系[31]，不同γ射線輻照和肉桂精油處理對(duì)S. putrefaciens胞內(nèi)外ATP濃度的作用效果如圖3所示。對(duì)照組CK的S. putrefaciens胞內(nèi)外ATP濃度分別為0.553 μmol/L和0.049 μmol/L。與CK組相比，G組的胞內(nèi)外ATP濃度無顯著性差異，但添加精油的處理組（C1、C1＋G、C2）使得S. putrefaciens ATP內(nèi)濃度顯著降低，ATP外濃度增加顯著（P＜0.05），且C1＋G和C2組對(duì)胞內(nèi)外ATP濃度影響更顯著。結(jié)合電子顯微鏡的結(jié)果，說明γ射線輻照和肉桂精油聯(lián)合作用于S. putrefaciens細(xì)胞時(shí)，更大程度地改變了細(xì)胞的通透性，從而使得ATP內(nèi)濃度下降而ATP外濃度升高。同時(shí)ATP的合成可能受到抑制也會(huì)導(dǎo)致ATP內(nèi)的下降。Turgis等[32]在研究芥子精油對(duì)大腸桿菌O157:H7和沙門氏菌的作用機(jī)理的過程中發(fā)現(xiàn)，芥子精油均能對(duì)這兩種菌的細(xì)胞膜的完整性造成破壞，使得胞內(nèi)ATP大量流失，并且伴有明顯的細(xì)胞內(nèi)容物流出，最終導(dǎo)致了細(xì)胞死亡。Ultee等[7]在研究香芹酚對(duì)枯草芽孢桿菌的作用機(jī)制時(shí)，得到了與Turgis等相同的結(jié)論。

2.5 γ射線輻照聯(lián)合肉桂精油對(duì)S.putrefaciens胞內(nèi)pH值的影響

圖 4 S. putrefaciens胞內(nèi)pH值的變化Fig. 4 Effect of γ irradiation combined with CEO on pH inside S. putrefaciens cells

細(xì)菌內(nèi)環(huán)境pH值的穩(wěn)定對(duì)細(xì)菌的正常生理活動(dòng)的進(jìn)行起著至關(guān)重要的作用，如DNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)合成和與生理活動(dòng)相關(guān)酶的活性等[21]，S. putrefaciens pH內(nèi)值的變化如圖4所示。G、C1、C1＋G、C2組的pH內(nèi)值均低于CK。G和C1的pH內(nèi)值顯著高于C1＋G和C2（P＜0.05），說明聯(lián)合處理對(duì)細(xì)胞pH內(nèi)值的影響高于肉桂精油和γ射線輻照單獨(dú)處理，可能更大程度地破壞了S. putrefaciens細(xì)胞的完整性，使得正常生理活動(dòng)紊亂而導(dǎo)致S. putrefaciens的死亡。C1＋G組和高質(zhì)量濃度肉桂精油處理C2的pH內(nèi)值無顯著差異（P＞0.05）。Turgis等[32]研究發(fā)現(xiàn)芥子精油能夠破壞大腸桿菌O157:H7和沙門氏菌細(xì)胞膜的完整性，造成胞內(nèi)ATP流失和pH值下降，引發(fā)細(xì)胞的死亡。

2.6 γ射線輻照聯(lián)合肉桂精油對(duì)S. putrefaciens膜蛋白的影響

S. putrefaciens膜蛋白的SDS-PAGE結(jié)果如圖5所示，S. putrefaciens有30多條蛋白亞基條帶，分子質(zhì)量大多集中在30～172 kD之間。與CK組相比，G組蛋白亞基條帶變化不大，說明低劑量γ射線輻照并未對(duì)S. putrefaciens的膜蛋白造成顯著影響。與G組相比，處理組C1、C1＋G、C2對(duì)膜蛋白的影響較顯著，其中C1和C1＋G處理S. putrefaciens膜蛋白的18 kD亞基增加而40 kD亞基減少，C2處理組膜的49、43kD亞基增加，對(duì)膜的影響比C1和C1＋G組更顯著。γ射線輻照和肉桂精油聯(lián)合處理作用下，其蛋白條帶較C1和G組明顯，且隨著精油質(zhì)量濃度增加，蛋白質(zhì)條帶顯示亦明顯增強(qiáng)，這可能是較高精油質(zhì)量濃度處理C2及聯(lián)合處理C1＋G組均對(duì)膜蛋白質(zhì)造成了較強(qiáng)的破壞作用，導(dǎo)致更多的氨基和巰基暴露出來，從而通過染料磺酸基和活性蛋白氨基的離子間交互作用和范德華引力，使得考馬斯亮藍(lán)R-250與更多的蛋白亞基結(jié)合，從而使得C1＋G和C2組的蛋白質(zhì)電泳條帶較其他處理組更為明顯。

圖 5 S. putrefaciens膜蛋白的SDS-PAGE圖譜Fig. 5 SDS-PAGE images of S. putrefaciens membrane proteins

2.7 γ射線輻照聯(lián)合肉桂精油對(duì)S. putrefaciens膜脂肪酸的影響

生物膜對(duì)細(xì)胞的完整性至關(guān)重要，它為細(xì)胞在膜內(nèi)和膜外環(huán)境之間形成了一道屏障。細(xì)菌能夠適應(yīng)不同環(huán)境的改變，膜脂肪酸的作用顯得尤為重要[29]。細(xì)菌所含脂肪酸的種類和相對(duì)含量變化可以間接反映細(xì)菌的不同生長狀態(tài)[33]。S. putrefaciens膜脂肪酸甲酯圖譜的出峰時(shí)間與37種脂肪酸甲酯的混和標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比照，并結(jié)合在脂肪酸樣品中添加內(nèi)標(biāo)C19:0進(jìn)行定性和定量[34]。S. putrefaciens 細(xì)胞膜含多種脂肪酸，如飽和脂肪酸C12∶0、C14∶0、C16∶0、C18∶0，不飽和脂肪酸C16∶1,9c、C17∶1,10c、C18∶1,9c，且不飽和脂肪酸含量達(dá)50%[35]。

圖 6 S. putrefaciens膜脂肪酸的變化Fig. 6 Effect of γ irradiation combined with CEO on membrane fatty acids in S. putrefaciens

不同處理下S. putrefaciens膜脂肪酸種類及含量的變化如圖6所示。與CK組相比，處理組G、C1、C1＋G和C2的S. putrefaciens 細(xì)胞膜飽和不飽和脂肪酸含量均呈現(xiàn)減少趨勢，特別是C14∶0、C16∶0、C16∶1、C17∶1、C18∶1（P＜0.05）。C1＋G組對(duì)S. putrefaciens膜脂肪酸的影響比C1和G組要大，并且C1組的影響大于G組。在所有處理中，C2組使得膜脂肪酸減少幅度最大（P＜0.05），說明高質(zhì)量濃度的肉桂精油對(duì)膜脂肪酸的影響較大。di Pasqua等[36]研究了百里香酚、香芹酚、丁香酚、檸檬烯及肉桂醛對(duì)大腸桿菌菌體細(xì)胞脂肪酸含量變化的影響，發(fā)現(xiàn)處理后的各菌體細(xì)胞中的不飽和脂肪酸的含量顯著下降。特別地，肉桂醛處理的大腸桿菌的C18∶2,trans和C18∶3,cis含量明顯降低。另外，di Pasqua等[36]的研究發(fā)現(xiàn)與抗菌活性物質(zhì)如百里香精油相比，γ射線輻照對(duì)膜脂肪酸的影響要小得多，這主要是因?yàn)棣蒙渚€輻照對(duì)膜脂肪酸的影響與其輻照劑量密切相關(guān)。此外，γ射線輻照對(duì)脂肪酸的作用還與細(xì)菌的種類相關(guān)，Dussault等[29]的研究發(fā)現(xiàn)在相同γ射線處理下，枯草芽孢桿菌的總不飽和脂肪酸減少，而大鼠肺成纖維細(xì)胞的總不飽和脂肪酸顯著增加（P＜0.05）。

表 2 與S. putrefaciens膜脂肪酸相關(guān)參數(shù)的變化Table 2 Effect of γ irradiation combined with CEO on fatty acid profi le of membrane lipids in S. putrefaciens

S. putrefaciens膜脂肪酸相關(guān)的參數(shù)的變化如表2所示。總脂肪酸含量反映了肉桂精油對(duì)S. putrefaciens的影響大于γ射線輻照。FA比值的降低表明不飽和脂肪酸比例的降低或飽和脂肪酸比例的增加。C1、C1＋G和C2組的FA比值范圍為1.035～1.084，比CK和G組的FA比值低。這主要是由于添加精油的處理組可對(duì)細(xì)菌的膜脂肪酸產(chǎn)生直接顯著影響。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)主要研究γ射線輻照聯(lián)合肉桂精油對(duì)S. putrefaciens生長的抑制作用，并研究肉桂精油單獨(dú)和聯(lián)合作用對(duì)S. putrefaciens細(xì)胞形態(tài)、胞內(nèi)外ATP、胞內(nèi)pH值、膜蛋白、膜脂肪酸的影響，探究肉桂精油和γ射線輻照聯(lián)合作用機(jī)理。精油和γ射線輻照的聯(lián)合使用對(duì)S. putrefaciens的活性的抑制效果優(yōu)于單獨(dú)處理。在減少精油用量和輻照劑量的前提下，γ射線輻照和肉桂精油聯(lián)合使用可以顯著降低S. putrefaciens的活性（P＜0.05），從而達(dá)到抑菌目的。γ射線輻照和肉桂精油聯(lián)合抑制S. putrefaciens的機(jī)制可能在于γ射線輻照改變了細(xì)胞膜脂肪酸組分的變化，從而促進(jìn)了肉桂精油對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的作用效果，因此兩者聯(lián)合作用時(shí)胞內(nèi)外ATP和胞內(nèi)pH值變化較單獨(dú)作用時(shí)的效果顯著。

[1] GRAM L, HUSS H H. Microbiological spoilage of fish and fish products[J]. International Journal of Food Microbiology, 1996, 33(1): 121-137. DOI:10.1016/0168-1605(96)01134-8.

[2] GRAM L, WEDELL-NEERGAARD C, HUSS H H. The bacteriology of fresh and spoiling Lake Victorian Nile perch (Lates niloticus)[J]. International Journal of Food Microbiology, 1990, 10(3): 303-316. DOI:10.1016/0168-1605(90)90077-I.

[3] BORCH E, KANT-MUERMANS M L, BLIXT Y. Bacterial spoilage of meat and cured meat products[J]. International Journal of Food Microbiology, 1996, 33(1): 103-120. DOI:10.1016/0168-1605(96)01135-X.

[4] STENS TR?M I M, MOLIN G. Classification of the spoilage flora offish, with special reference to Shewanella putrefaciens[J]. Journal of Applied Bacteriology, 1990, 68(6): 601-618. DOI:10.1111/j.1365-2672.1990.tb05226.x.

[5] LOPEZ-CA BALLERO M, SáNCHEZ-FERNáNDEZ J A, MORAL A. Growth and metabolic activity of Shewanella putrefaciens maintained under different CO2and O2concentrations[J]. International Journal of Food Microbio logy, 2001, 64(3): 277-287. DOI:10.1016/S0168-1605(00)00473-6.

[6] WU J, LIU H, GE S, et al. The preparation, characterization, antimicrobial stability and in vitro release evaluation of fish gelatin fi lms incorporated with cinnamon essential oil nanoliposomes[J]. Food Hydrocolloids, 2015, 43: 427-435. DOI:10.1016/j.foodhyd.2014.06.017.

[7] ULTEE A, KETS E, SMID E. Mechanisms of action of carvacrol on the food-borne pathogen Bacillus cereus[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999, 65(10): 4606-4610.

[8] 林雅慧. 芳樟油氣相抗菌機(jī)制的研究[D]. 廣州: 廣東工業(yè)大學(xué), 2012: 31-48. DOI:10.7666/d.y2097717.

[9] 段鑫, 歐杰, 李柏林. 輻照技術(shù)在肉制品殺菌保鮮中的應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(1): 278-282.

[10] 吳海霞, 韓雪孟. 食品冷殺菌研究技術(shù)進(jìn)展[J]. 畜牧獸醫(yī)科技信息, 2005(12): 67-69.

[11] 劉睿哲. 食品菌落總數(shù)測定中TTC做顯色劑的探索[J]. 產(chǎn)業(yè)與科技論壇, 2011, 10(20): 64-65 . DOI:10.3969/j.issn.1673-5641.2011.20.035.

[12] TURGIS M, HAN J, MILLETTE M, et al. Effect of selected antimicrobial compounds on the radiosensitization of Salmonellatyphi in ground beef[J]. Letters in Applied Microbiology, 2009, 48(6): 657-662. DOI:10.1111/j.1472-765 X.2009.02587.x.

[13] 梁靜南, 劉一葦, 謝家儀. 制備細(xì)菌類單細(xì)胞生物掃描電鏡樣品方法的改進(jìn)[J]. 電子顯微學(xué)報(bào), 2013, 32(3): 276-278. DO I:10.3969/ j.1000-6281.2013.03.016.

[14] LEE S H, LEE S Y, SON D J, et al. Inhibitor y effect of 2 -hydroxycinnamaldehyde on nitric oxide production through inhibition of NF-κB activation in RAW 264.7 cells[J]. Bioche mical Pharmacology, 2005, 69(5): 791-799. DOI:10.1016/j.bcp.2004.11.013.

[15] CARSON C F, MEE B J, RILEY T V. Mechanism of action of Melaleuca alternifolia (tea tree) oil on Staphylococcus aureus determined by time-kill, lysis, leakage, and salt tolerance assays and electron microscopy[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2002, 46(6): 1914-1920.

[16] SIRAGUSA G R, CUTTER C N, DORS A W J, et al. Use of a rapid microbial ATP bioluminescence assay to detect contamination on beef and pork carcasses[J]. Journal of Food Protection, 1995, 58(7): 770-775.

[17] LAMBERT R, SKANDAMIS P N, COOTE P J, et al. A study of the minimum inhibitory c oncentration and mode of action of oregano essential oil, thymol and carvacrol[J]. Journal of Applied Microbiology, 2001, 91(3): 453-462. DOI:10.1046/j.1365-2672.2001.01428.x.

[18] SPILIMBERGO S, QUARANTA A, GARCIA-GONZALEZ L, et al. Intracellular pH measurement during high-pressur e CO2pasteurization evaluated by cell fi uorescent staining[J]. The Journal of Supercritical Fluids, 2010, 53(1): 185-191. DOI:10.1016/j.supfi u.2010.03.004.

[19] BREEUWER P, DROCOURT J, ROMBOUTS F M, et al. A novel method for continuous determination of the intracellular pH in bacteria with the internally conjugated fluorescent probe 5 (and 6-)-carboxyfluorescein succinimidyl ester[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1996, 62(1): 178-183.

[20] BRADFORD M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding[J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72: 248-254.

[21] 李豐良, 韓妮萍, 杜廷義, 等. 銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥性的 動(dòng)態(tài)變化特征及分析[J]. 中國藥房, 2006, 17(10): 765-767. DOI:10.3969/j.issn.1001-0408.2006.10.020.

[22] 汪家政, 范明. 蛋白質(zhì)技術(shù)手冊(cè)[M]. 北京: 萬方數(shù)據(jù)資源系統(tǒng), 2000: 77-100.

[23] 郭堯君. 蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京: 科學(xué)技術(shù)出版社,1999: 123-157.

[24] 徐敏, 王靜, 柴子涵, 等. 海洋細(xì)菌脂肪酸的氣相色譜分析[J]. 海洋科學(xué), 2013, 37(2): 76-83.

[25] 王瑞白, 劉海洪, 邱海燕, 等. 我國霍亂弧菌的脂肪酸分型研究[J]. 中國生物工程雜志, 2007, 27(6): 15-21. DO I:10.3969/ j.issn.1671-8135.2007.06.004.

[26] SCHUMMER C, DELHOMME O, APPENZELLER B M, et al. Comparison of MTBSTFA and BSTFA in derivatization reactions of polar compounds prior to GC/MS analysis[J]. Tala nta, 2009, 77(4): 1473-1482. DOI:10.1016/j.talanta.2008.09.043.

[27] 袁忠誼, 岳玲, 吳富蘭, 等. 電子束和γ射線輻照對(duì)左歸丸粉殺菌效果的研究[J]. 輻射研究與輻射工藝學(xué)報(bào), 2012, 30(2): 93-96.

[28] COX S D, MA NN C M, MARKHAM J L, et al. The mode of antimicrobial action of the essenti al oil of Melaleuca alternifolia (tea tree oil)[J]. Journal of Applied M icrobiology, 2000, 88(1): 170-175.

[29] DUSSAULT D, CAILLET S, LE TIEN C, et al. Effect of γ-irradiation on membrane fatty acids and peptidoglycan’s muropeptides of Pantoea agglomerans, a plant pathogen[J]. Journal of Applied Microbiology, 2009, 106(3): 1033-1040. DOI:10.1111/j.1365-2672.2008.04070.x.

[30] 李婭男, 梁浩, 袁其朋, 等. 4 種植物精油體外抑菌活性及其穩(wěn)定性的研究[J]. 北京化工大學(xué)學(xué)報(bào): 自然科學(xué)版, 2012, 39(3): 81-85. DOI:10.3969/j.issn.1671-4628.2012.03.016.

[31] AYARI S, DUSSAULT D, MILLETTE M, et al. Changes in membrane fatty acids and murein composition of Bacillus cereus and Salmonella typhi induced by gamma irr adiation treatment[J]. International Journal of Food Microbiology, 2009, 135(1): 1-6. DOI:10.1016/j.ijfoodmicro.2009.07.012.

[32] TURGIS M, HAN J, CAILLET S, et al. Antimicrobial activity of mustard essential oil against Escherichia coli O157:H7 and Salmonella typhi[J]. Food Control, 2009, 20(12): 1073-1079. DOI:10.1016/ j.foodcont.2009.02.001.

[33] ?PITSMEISTER M, ADAMBERG K, VILU R. UPLC/MS based method for quantitative determination of fatty acid composition in Gram-negative and Gram-positive bacteria[J]. Journal of Microbiological Methods, 2010, 82(3): 288-295. DOI:10.1016/ j.mimet.2010.07.006.

[34] 孔祥會(huì), 王桂忠, 李少菁. 低溫適應(yīng)下鋸緣青蟹肌肉 及其細(xì)胞膜脂肪酸組成的變化[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2006, 30(5): 603-610. DOI:10.3321/ j.issn:1000-0615.2006.05.005.

[35] MOULE A L, WILKINSON S G. Polar lipids, fatty acids, and isoprenoid quinones of Alteromonas putrefaciens (Shewanella putrefaciens)[J]. Systematic and Applied Microbiology, 1987, 9(3): 192-198. DOI:10.1016/S0723-2020(87)80021-8.

[36] DI PASQUA R, BETTS G, HOSKINS N, et al. Membrane toxicity of antimicrobial compounds from essential oils[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2007, 55(12): 4863-4870. DOI:10.1021/ jf0636465.

Antimicrobial Mechanism of Combination of γ Irradiation and Cinnamon Essential Oil against Shewanella putrefaciens

Lü Fei, XU Jing, WEI Qianqian, GAO Fei, ZHOU Xuxia, DINY Yuting, LIU Lin*
(Food Engineering and Quality Control Institution, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

The combined antibacterial effect of γ irradiation and cinnamon essential oil (CEO) against Shewanella putrefaciens was evaluated and the underlying mechanism was investigated. The irradiation dose required to reduce total colony number to 10% of the initial level (D10) was reduced and the relative irradiation sensitivity was increased with increased concentration of CEO. The combination of γ irradiation and CEO was more effective in inhibiting the growth of S. putrefaciens than each alone. The combination treatment exhibited an obvious negative effect on cell morphology,

intracellular ATP and pH, membrane proteins and fatty acids in S. putrefaciens. The combination resulted in a reduction of 40 kD subunits and an increase of 18 kD subunits in membrane proteins, as well as a signifi cant reduction of C14:0, C16:0, C16:1, C17:1, and C18:1in membrane lipids (P ＜ 0.05). The mechanism for the synergism was due to the potential of γ irradiation to increase the destructive effect of CEO on the cell membrane of S. putrefaciens thus causing its death.

irradiation; cinnamon essential oil; Shewanella putrefaciens; synergistic effect; antimicrobial mechanism

10.7506/spkx1002-6630-201717003

TS254.4

A

1002-6630（2017）17-0014-06

呂飛, 徐靜, 魏倩倩, 等. γ射線聯(lián)合肉桂精油對(duì)腐敗希瓦氏菌的抑制機(jī)制[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(17): 14-19.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717003. http://www.spkx.net.cn

Lü Fei, XU Jing, WEI Qianqian, et al. Antimicrobial mechanism of combination of γ irradiation and cinnamon essential oil against Shewanella putrefaciens[J]. Food Science, 2017, 38(17): 14-19. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201717003. http://www.spkx.net.cn

2016-07-08

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301579）

呂飛（1980—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏加工。E-mail：lvfei_zju@163.com *通信作者：劉璘（1956—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏加工。E-mail：linliu85@126.com