青藏高原部分地區自由放牧與舍飼育肥牦牛食源性致病微生物污染的差異

柏 雪，文勇立，劉少文，陳 宇，鐘金城，王 永，郭春華,*

（1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2.西南民族大學，青藏高原研究院，四川 成都 610041）

青藏高原部分地區自由放牧與舍飼育肥牦牛食源性致病微生物污染的差異

柏 雪1，文勇立2，劉少文1，陳 宇1，鐘金城2，王 永2，郭春華1,*

（1.西南民族大學生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2.西南民族大學，青藏高原研究院，四川 成都 610041）

肉中的致病微生物污染是危害人類健康的重要因素。本研究采集了青藏高原部分地區無腹瀉癥狀的放牧型牦牛樣品155 份，舍飼育肥型牦牛樣品122 份，對其糞便及各組織中沙門氏菌、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌進行分離，并對沙門氏菌進行血清學鑒定和抗生素藥敏實驗。結果發現，2 種飼養方式下，牦牛組織病原微生物攜帶率統計學上無顯著差異（P＞0.05），但放牧型牦牛的檢出率絕對值都略高于舍飼育肥型牦牛；2 種不同飼養方式的牦牛樣品中分離出的沙門氏菌血清型差異較大，舍飼育肥型和放牧型牦牛肌肉中檢出的血清型分別為紐波特沙門氏桿菌和腸炎沙門氏桿菌，放牧型牦牛糞便中的沙門氏菌為鼠傷寒沙門氏桿菌、腸炎沙門氏桿菌和圣保羅沙門氏菌，而舍飼育肥型牦牛僅有都柏林沙門氏菌；舍飼育肥型和放牧型牦牛源沙門氏菌對抗生素耐藥性規律基本一致，對林可霉素（83.33%、81.82%）、四環素（66.67%、63.64%）和麥迪霉素（66.67%、72.73%）具有較高的耐藥性。從實驗結果可以得出，放牧型牦牛的微生物安全性和舍飼育肥型牦牛一致，沙門氏菌對抗生素的耐藥性都較為嚴重。

牦牛；飼養方式；沙門氏菌；大腸菌群；金黃色葡萄球菌；單增李斯特菌

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牦牛是青藏高原山脈附近的特有牲畜，中國現有牦牛1400多萬頭，約占世界牦?？倲档?5%以上[1]。牦牛是牧民賴以生存的資源[2]，也是我國畜牧業中不可缺少的畜種之一。由于牦牛肉“天然、綠色”的特點，牦牛肉制品如牦牛肉干、牦牛肉醬等受到了消費者的追捧。隨著現代冷鏈物流的發展，近幾年新鮮牦牛肉的需求量也日趨上升，但牦牛肉及其制品中的食源性致病微生物污染卻不可小覷。胡萍等[3]報道天祝白牦牛乳中金黃色葡萄球菌的檢出率為26.67%，牦牛肉干中金黃色葡萄球菌檢出率為14.70%；孔雪英等[4]在新鮮牦牛肉中檢出了致病性沙門氏菌。青藏高原海拔高、沸點低，特別是牧民又有生吃牦牛肉的飲食傳統，肉品中的食源性致病微生物給牧民與消費者健康帶來極大的風險[5]。羊云飛[6]研究發現四川甘孜色達藏區牦牛源與牧民源的大腸桿菌進化樹接近，并存在耐藥性的傳遞。

目前牦牛的養殖仍以傳統飼養方式為主，即全天然散養[7]。在這種完全自由的放牧狀態下，牦牛沒有經過規范的防疫與飼養管理，自身的健康風險較大[7-8]。王慧玲等[9]對甘南州放牧犢牦牛進行病原菌調查，發現沙門氏菌感染率達13.5%。關伏龍等[10]研究表明，健康放牧牦牛腸系膜淋巴結沙門氏菌檢出率為6.7%。其次，我國青藏高原地區牦牛屠宰尚處在較原始的階段，部分牧民選擇在草地就地屠宰，食源性病原微生物通過食物鏈進入人體的機率大大增加。近幾年在克服了牦牛半野生的馴化和飼料的適應等困難之后，也逐漸興起了舍飼飼養方式。本研究團隊和其他研究者發現，經過舍飼育肥之后，牦牛肉的產量和品質得到了較大的提高[11]。然而對于牦牛來講，這種新興的舍飼集中飼養是否存在潛在的食品安全威脅，目前尚無定論。

本研究通過舍飼的方式對適宜體質量牦牛進行育肥，采集其新鮮糞便與肉樣，并同時采集自由放牧的同品種牦牛樣品，采用常規沙門氏菌、大腸菌群、金色葡萄球菌和單增李斯特菌國標分離技術對樣品進行菌株分離，并對沙門氏菌進行血清學鑒定和耐藥性實驗，研究舍飼育肥與放牧飼養方式對牦牛自身沙門氏菌攜帶率及牦牛肉、肝臟等產品安全的影響，為保障牦牛肉的食品安全和公共安全提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麥洼公牦牛 四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣和汶川縣。

濃縮料 四川新通達飼料有限公司；伊維菌素四川顯華動物藥業有限公司；緩沖蛋白胨水、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、亞硫酸鉍瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂、沙門氏菌-志賀氏菌瓊脂培養基、大腸桿菌分離培養基、金色葡萄球菌分離培養基、單增李斯特菌分離培養基、頭孢噻肟（10 μg/片）、氨芐西林（10 μg/片）、頭孢拉定（30 μg/片）、頭孢曲松（10 μg/片）、鏈霉素（10 μg/片）、慶大霉素（10 μg/片）、萬古霉素（30 μg/片）、卡那霉素（30 μg/片）、四環素（30 μg/片）、氯霉素（30 μg/片）、林可霉素（2 μg/片）、左氧氟沙星（5 μg/片）、環丙沙星（5 μg/片）、吡哌酸（30 μg/片）、麥迪霉素（30 μg/片）、乙酰螺旋霉素（30 μg/片）和羅紅霉素（15 μg/片）藥敏試紙片 杭州微生物試劑有限公司；沙門氏菌屬診斷血清 寧波天潤生物藥業有限公司。其他化學試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋上海申安醫療器械廠；THZ-98C恒溫振蕩培養箱 上海科學儀器有限公司；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物飼養

2015年8月—2015年12月，分別在四川省阿壩藏族羌族自治州小金縣和汶川縣（海拔2 000～3 000 m）進行牦牛舍飼育肥實驗。選取體質量在160～180 kg的麥洼公牦牛（小金縣35 頭、汶川縣40 頭），采用分欄栓系飼養，每頭牦牛占圈舍面積約為2.5 m2。牦牛進場前對圈舍進行徹底消毒，進場后立即注射伊維菌素驅蟲。自由飲水，每日定時飼喂2 次（8：00和16：00），粗料自由采食（玉米秸稈和青干草），精料占牦牛體質量的1.3%。精料日糧組成為60%玉米，40%濃縮料，參照NY/T 815—2004《肉牛飼養標準》[12]添加維生素、礦物質元素、磷酸氫鈣和碳酸氫鈉等添加劑。舍飼飼喂期間禁止使用任何抗生素。舍飼育肥100 d后出欄，出欄體質量為240～260 kg。

放牧牦牛在天然草原（海拔3 000～4 000 m）自由采食新鮮青草并飲水，不補飼，每日晚間歸牧。

1.3.2 樣品選擇

在舍飼育肥實驗結束時，隨機屠宰牦牛33 頭（小金縣15 頭、汶川縣18 頭）。于屠宰前采集牦牛新鮮無污染的糞便樣品33 份，屠宰后立即采集肌肉33 份、肝臟28 份、腸系膜淋巴結30 份和心肌31 份樣品，放入無菌封樣袋內，－4 ℃保存，立即送回實驗室檢測樣品病原微生物污染情況。同時在當地牦牛屠宰點按上述方法采集放牧牦牛的糞便和各組織樣品，其中糞便32 份、肌肉28 份、肝臟22 份、腸系膜淋巴結20 份和心肌20 份樣品。

1.3.3 病原微生物檢測

參照食品安全國家標準GB 4789.4—2010《食品微生物學檢驗 沙門氏菌檢驗》[13]、GB 4789.3—2010《食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》[14]、GB 4789.10—2010《食品微生物學檢驗 金黃色葡萄球菌檢驗》[15]和GB 4789.30—2010《食品微生物學檢驗 單核細胞增生李斯特氏菌檢驗》[16]分別對樣品進行沙門氏菌、大腸菌群、金黃色葡萄球菌和單增李斯特菌進行檢測。

1.3.4 藥敏實驗

采用臨床和實驗室標準化研究所推薦的瓊脂紙片擴散法對樣品中的沙門氏菌進行藥敏實驗[17]。通過測定抑菌圈直徑（d）判斷耐藥情況，即d≤1 cm為耐藥；1 cm＜d≤1.5 cm為中度敏感；d＞1.5 cm為高度敏感。

1.4 數據統計

病原微生物檢出率采用兩樣本百分數差異顯著性μ檢驗進行統計，μ＞1.96（即P＜0.05）為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 牦牛糞便和肉樣中沙門氏菌檢測結果

表 1 不同飼養方式下牦牛源沙門氏菌檢出率Table 1 Detection rates of Salmonella in yaks with different feeding regimens

由表1可知，雖然不同飼養方式下牦牛源沙門氏菌檢出率在統計學上無顯著差異（P＞0.05），但檢出率的絕對值，放牧型飼養方式牦牛高于舍飼育肥型牦牛，特別是總檢出率（放牧型9.02%、舍飼育肥型3.87%），其μ值已接近1.96。不同組織部位，肝臟中沙門氏菌檢出率最高，舍飼育肥型和放牧型牦牛分別為10.71%和18.18%；心肌和腸系膜淋巴結中均未檢出沙門氏菌；放牧型牦牛的糞便和肌肉中沙門氏菌檢出率分別為15.63%和7.14%，約為舍飼育肥型牦牛的2.50 倍。

表 2 不同飼養方式下牦牛源大腸菌群檢出率Table 2 Detection rates of coliform bacteria in yak with different feeding regimens

由表2可知，在各組織的樣品中，放牧型牦牛大腸菌群的檢出率和舍飼育肥型無顯著差異（P＞0.05），但放牧型牦牛檢出率絕對值均高于舍飼育肥型。其中，糞便、肝臟及腸系膜淋巴結是大腸菌群檢出率最高的組織部位。糞便是大腸菌群檢出率最高的部位，其次是肝臟，并且，放牧型和舍飼育肥型的耗牛在這兩個組織部位中的檢出率絕對值相差不大，而放牧型耗牛在腸系膜淋巴結的檢出率約為舍飼育肥型耗牛的2.5 倍。

表 3 不同飼養方式下牦牛源金黃色葡萄球菌檢出率Table 3 Detection rates of Staphylococcus aureus in yak with different feeding regimens

由表3可知，在統計學上2 種飼喂方式下，牦牛各部位金黃色葡萄球菌檢出率無顯著差異（P＞0.05）。肌肉是舍飼育肥型牦牛金黃色葡萄球菌檢出率最高的部位（9.09%），比放牧型高出1.95%；腸系膜淋巴結是放牧型牦牛檢出率最高的部位（15.00%），是舍飼育肥型牦牛的2.5倍（6.67%）。

由表4可知，牦牛源單增李斯特菌僅在糞便和肝臟中檢出，其中糞便檢出率最高，2 種飼喂方式下牦牛各部位的單增李斯特菌檢出率無顯著差異（P＞0.05）。

表 4 不同飼養方式下牦牛源單增李斯菌特檢出率Table 4 Detection rates of Listeria monocytogenes in yak with different feeding regimens

2.2 沙門氏菌血清型

表 5 沙門氏菌血清型鑒定結果Table 5 Serotype identifi cation of Salmonella

表5為牦牛糞便與組織分離得到的沙門氏菌血清型鑒定結果。牦牛樣品中總共分離得到17 株沙門氏菌和5 種血清型，分別是都柏林沙門氏菌（S. dublin）、紐波特沙門氏桿菌（S. newport）、腸炎沙門氏桿菌（S. enteritidis）、圣保羅沙門氏菌（S. saintpaul）、鼠傷寒沙門氏桿菌（S. typhimurium）。這5 種血清型中腸炎沙門氏菌檢出數量最高，占總菌株數的47.06%；其次為都柏林沙門氏菌，占總菌株數23.53%；紐波特沙門氏桿菌檢出數最少，僅有1 株（5.88%）。舍飼育肥型和放牧型牦牛樣品中也都是腸炎沙門氏菌檢出數量最高，分別占總菌株數的33.33%和54.55%。

舍飼育肥型和放牧型牦牛不同種類樣品中分離到的沙門氏菌血清型差異較大，其中放牧型糞便中檢出的沙門氏菌為鼠傷寒沙門氏桿菌、腸炎沙門氏桿菌和圣保羅沙門氏菌這3 種血清型，而舍飼育肥型牦牛糞便中僅檢出都柏林沙門氏菌；舍飼育肥型和放牧型牦牛肌肉中分別檢測到的血清型為紐波特沙門氏桿菌和腸炎沙門氏桿菌；舍飼育肥型和放牧型牦牛肝臟共同檢測出腸炎沙門氏桿菌。

2.3 沙門氏菌藥敏實驗結果

從表6可以看出，2 種飼養方式的牦牛源沙門氏菌對抗生素的耐藥規律基本一致。無論是舍飼育肥型牦牛源還是放牧型牦牛源的沙門氏菌，對4 種β-內酰胺類抗生素耐藥率較低；在氨基糖苷類抗生素中，對卡那霉素和鏈霉素耐藥率為0.00%，對慶大霉素和萬古霉素耐藥性較強，且舍飼育肥型比放牧型略高；對喹諾酮類抗生素耐藥性較弱，舍飼育肥略低于自由放牧；在大環內酯類抗生素中，對麥迪霉素耐藥性較高（66.67%和72.73%），對乙酰螺旋霉素耐藥性中等；對四環素和林可霉素均表現出高度耐藥性，舍飼育肥型和放牧型對沙門氏菌的耐藥率分別為：對四環素66.67%和63.64%、對林可霉素83.33%和81.82%；對氯霉素的耐藥性中等。

表 6 沙門氏菌藥敏實驗結果Table 6 Drug sensitivity of Salmonella isolates

3 討論與結論

3.1 飼養方式對牦牛源病原微生物的影響

牦牛肉是青藏高原人民主要的肉類消費品，也是我國牛肉產品中重要的組成，牦牛肉的微生物安全對牧民的身體健康和牦牛肉產業的發展十分重要。本研究中放牧型牦牛糞便的沙門氏菌檢出率與儲倩等[18]的報道接近，比陳朝喜等[19]的報道低，這可能和牦牛自身健康狀況、采樣地點、采樣季節不同有關；大腸桿菌的檢出率與羊云飛[6]的研究結果保持一致；放牧型牦牛肌肉中未檢測出單增李斯特菌，與高媛等[20]研究結果一致；放牧牦牛肌肉中金黃色葡萄球菌檢出率低于胡萍等[3]對甘肅白牦牛的研究，高于高媛等[20]研究，這可能和采樣地區與樣品新鮮度的差異有關。

目前，國內有關飼養方式與青藏高原牦牛攜帶各種病原微生物間的關系罕見報道。本研究中放牧型牦牛糞便中所有食源性病原微生物的攜帶率都高于舍飼育肥型牦牛，說明放牧型牦牛自身更易感染病原微生物，這可能與牦牛自身的健康狀態有關。由于青藏高原冷暖季極為分明，冷季氣候寒冷、牧草缺乏，在不補飼的情況下，放牧型的牦牛在冷季只能依靠分解自身脂肪和蛋白勉強過冬，長期以來處于“夏壯、秋肥、冬瘦、春死”的惡性循環之中[7-8]，王亞明[21]報道在冷季牦牛體質量平均下降可達44 kg，平均體質量減少24.4%；而舍飼飼養的牦牛經過科學飼養管理和日糧搭配，體質增強，研究報道經舍飼育肥的牦牛其血液中免疫球蛋白含量、總蛋白含量等顯著上升，機體對病原菌的抵抗能力加強[22-23]。另一方面，放牧型牦牛暴露在草場上，糞便和變質腐爛的牧草都可能構成牦牛暴露病原菌下的潛在因素，這也是牦牛乳房炎和腹瀉發病重要原因之一[24]；而舍飼飼養方式之下，糞便進行了無害化處理，牦牛攜帶病原微生物的機率大大降低。本實驗在采樣過程中發現放牧型牦牛半數以上瘤胃內壁發現有大量的吸蟲附著，這和蔡進忠等[25]對牦牛寄生蟲病的流行病學調查結果吻合；而舍飼育肥型牦牛在進場初期進行了驅蟲處理，屠宰后眼觀未發現寄生蟲。

自身攜帶病原微生物越高的牦牛，其畜產品安全性可能越差。本研究發現，除金色葡萄球菌以外，放牧型牦牛的肝臟、肌肉中病原微生物檢出率均比舍飼育肥型牦牛高，這和其糞便中的檢出率結果相一致。飼養方式影響畜產品安全的另一個重要原因是屠宰模式。雖然國家也在逐步規范動物的屠宰，但由于青藏高原條件有限和各種原因，大部分的牦牛并未進行宰前宰后檢疫，胴體清洗粗糙。周玉春等[26]研究報道牦牛屠宰前環境污染最嚴重，胴體隨著剝皮、劈半和分割的進行，菌落總數和大腸桿菌顯著增加。本研究采集的舍飼育肥型牦牛樣品都是在固定屠宰點自行屠宰采樣，嚴格遵從了宰前清洗等必要消毒流程。雖然這樣，但屠宰條件仍然簡陋，這也是其病原微生物檢出率高于內地肉牛的重要原因。

3.2 青藏高原牦牛的放牧方式與其攜帶沙門氏菌血清型間的關系

沙門氏菌在自然界分布極廣，且種類繁多。目前全世界已分離得到的沙門氏菌血清型多達2 500多種[27]。其中，在我國青藏高原放牧家畜中就已經分離到數百種沙門氏菌，對牦牛肉的食品安全已構成不可小覷的威脅[28]。本研究發現腸炎沙門氏菌和都柏林沙門氏菌是牦牛主要攜帶的沙門氏菌血清型，這和詹發茂[29]在甘肅省天?？h對副傷寒牦牛和董映輝等[30]在甘孜藏族自治州對腹瀉牦牛的結果一致，也和張斌等[31]在青藏高原部分地區對健康牦牛糞便沙門氏菌血清型的調查結果一致。從飼養方式來看，本研究發現放牧型糞便中分離到的沙門氏菌血清型種類多于舍飼育肥型，可能是牦牛在自由放牧時接觸環境復雜，攜帶微生物多樣性的可能變大，而舍飼育肥飼養時環境相對固定，外源微生物豐度降低。

3.3 青藏高 原牦牛的放牧方式與其攜帶沙門氏菌耐藥性間的關系

本研究中的牦牛源沙門氏菌對抗生素的耐藥性與其他學者的報道有一定差異。陳朝喜等[19]報道腹瀉牦牛糞便中分離出的沙門氏菌對抗生素耐藥性大體上高于本研究結果，這可能與采樣牦牛的健康狀態有關。而儲倩等[18]2011年報道川西北高原健康牦牛糞便中的沙門氏菌對氯霉素、四環素、氨芐青霉素和阿莫西林等14 種抗生素均無耐藥性。而本研究發現沙門氏菌對四環素、林可霉素和麥迪霉素等抗生素的耐藥性較前者高。這可能因為隨著近幾年青藏高原畜牧業的快速擴張和發展，抗生素的濫用情況也變得廣泛和頻繁，沙門氏菌株的耐藥性可能變得更為嚴重。

本研究發現飼養方式對沙門氏菌的耐藥性并無顯著的影響，主要原因可能是本研究中的舍飼牦牛是只在育肥期集中飼喂，雖然期間未使用任何抗生素，但舍飼時間相對放牧時間仍然較短，對病原的耐藥性影響無法顯現。

通過對青藏高原放牧型牦牛和舍飼育肥型牦牛的糞便及各組織部位樣品進行食源性病原微生物的研究，發現由于屠宰、檢疫等各方面條件有限，2 種飼養方式的牦牛畜產品都存在一定的微生物安全風險，但牦牛在放牧狀態下自身的病原攜帶情況比舍飼牦牛稍嚴重，其肉類畜產品的質量安全也更具風險。因此，為保障牦牛肉的質量安全，在引進舍飼技術的同時，還需加強屠宰等方面的規范建設。

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Differentiation of Foodborne Pathogenic Contamination of Muscle and Visceral Tissues between Free Grazing and Stall-Fed Fattening Yaks from Some Areas of Qinghai-Tibetan Plateau

BAI Xue1, WEN Yongli2, LIU Shaowen1, CHEN Yu1, ZHONG Jincheng2, WANG Yong2, GUO Chunhua1,*
(1. College of Life Science and Technology, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China; 2. Institute of Qinghai-Tibetan Plateau, Southwest Minzu University, Chengdu 610041, China)

Pathogenic microorganisms in meat are one of the most important factors in human food-borne diseases. In the present study, the prevalence of Salmonella, coliform bacteria, Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes in various yak tissues, and the serological identification and antibiotic resistance of Salmonella were investigated. Totally, 277 samples of muscle and visceral tissues from yaks in Northwest Sichuan plateau were collected including 155 samples from free grazing yaks and 122 samples from stall-fed fattening yaks both without diarrhea symptoms. The results showed that no significant difference in the carrier rate of pathogenic microorganisms in various yak tissues was between two feeding regimens (P ＞ 0.05), but the absolute value of detection rate in free grazing yak was higher than that in stall-fed fattening yak. Different Salmonella serotypes were isolated from yak tissue samples from two different feeding systems. The Salmonella serotypes isolated from stall-fed fattening and grazing yak muscle were S. newport and S. enteritidis, respectively. The Salmonella serotypes isolated from fecal samples of grazing yak were S. typhimurium, S. enteritidis and S. saintpaul, while only S. dublin was isolated from fecal samples of stall-fed fattening yaks. The feeding regimens had no effect on the antibiotic resistance of Salmonella isolated from yaks, and the Salmonella isolated from stall-fed and free grazing yaks showed high resistance to lincomycin (83.33% and 81.82%), tetracycline (66.67% and 63.64%), and midecamycin (66.67% and 72.73%). Overall, the microbiological safety of yaks was identical between two feeding regimens, and the antibiotic resistance of Salmonella isolated from the yaks was high.

yak; feeding regimens; Salmonella; coliform bacteria; Staphylococcus aureus; Listeria monocytogenes

10.7506/spkx1002-6630-201717012

TS201.6

A

1002-6630（2017）17-0066-06引文格式：

2016-08-31

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD13B03）；四川省阿壩州應用技術研究與開發項目

柏雪（1985—），女，實驗師，碩士，研究方向為飼料及畜產品安全。E-mail：yukivy@163.com

*通信作者：郭春華（1957—），女，教授，博士，研究方向為反芻動物營養。E-mail：531893818@qq.com