遠志多糖的分離純化、結構特征及生物活性

景永帥，張丹參，吳蘭芳*，鄭玉光

（1.河北科技大學化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北中醫學院藥學院，河北 石家莊 050200）

遠志多糖的分離純化、結構特征及生物活性

景永帥1，張丹參1，吳蘭芳2,*，鄭玉光2

（1.河北科技大學化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050018；2.河北中醫學院藥學院，河北 石家莊 050200）

目的：分離純化遠志多糖（polysaccharide of Polygala tenuifolia，PTP），并對其理化性質、抗氧化和降血糖活性進行研究。方法：采用超聲波輔助提取、分級醇沉、DEAE-cellulose 52和Sephadex G-100柱色譜分離純化遠志多糖；紫外-可見光譜掃描法、比旋光度法、凝膠滲透色譜法3 種方法驗證純度；高效凝膠滲透色譜法測定相對分子質量，高效陰離子交換色譜測定單糖組成；清除1,1-二苯基-2-苦味基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基評價體外抗氧化活性；測定對α-葡萄糖苷酶抑制能力以研究其降血糖活性。結果：遠志多糖經分離純化后獲得組分PTP-1，經3 種方法驗證PTP-1為均一性良好的多糖，相對分子質量為4.62×104，由半乳糖、葡萄糖、甘露糖組成，物質的量比為3.92∶1.00∶2.08。抗氧化活性研究結果表明，PTP-1對清除DPPH自由基和羥自由基呈良好的量效關系，半數清除率濃度IC50分別為0.35 mg/mL和0.51 mg/mL。降血糖活性結果表明，PTP-1對α-葡萄糖苷酶具有較好的抑制能力，IC50值為0.52 mg/mL。結論：遠志多糖PTP-1為具有抗氧化和降血糖活性的均一多糖。

遠志；多糖；理化性質；抗氧化活性；降血糖活性

景永帥, 張丹參, 吳蘭芳, 等. 遠志多糖的分離純化、結構特征及生物活性[J]. 食品科學, 2017, 38(17): 126-131.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717021. http://www.spkx.net.cn

JING Yongshuai, ZHANG Danshen, WU Lanfang, et al. Purifi cation and structural characterization of polysaccharide from Polygala tenuifolia and its biological activity[J]. Food Science, 2017, 38(17): 126-131. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717021. http://www.spkx.net.cn

遠志為遠志科植物遠志（Polygala tenuifolia Willd.）的干燥根，具有安神益智、交通心腎、祛痰、消腫等功效[1]，已報道的化學成分主要包含三萜皂苷類、糖類、?酮類，也含有少量的生物堿、香豆素、木質素類等[2-3]。遠志始記載于《神農本草經》，被視為上品，為常用的藥食兩用資源，現代醫學研究表明遠志具有抗老年癡呆、抗抑郁、抗腫瘤、抗氧化以及改善記憶能力等作用[4-6]。

近年來，隨著多糖研究的深入，植物多糖的多種生物活性逐漸被發現，包括免疫調節、抗腫瘤、抗氧化、降血糖以及抗病毒等，而且中藥多糖含量豐富，來源廣泛，細胞毒性低，是一種理想的保健食品開發來源[7]。據文獻調研，目前對于遠志的研究主要集中在皂苷、揮發油、寡糖酯和生物堿等成分及其藥理活性的研究，而對于其多糖的研究報道較少，如Xin Tao等[8]從遠志中分離得到2 個酸性多糖，可增強荷瘤小鼠的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活力，且具有較好的抑制肺腺癌細A549的作用；另外，包括遠志多糖的含量測定[9-10]和提取工藝[6]等方面的研究。但對于遠志純化多糖的結構表征、抗氧化以及降血糖活性等方面研究鮮見報道。

因此，本實驗在前期提取工藝及抗氧化活性追蹤的基礎上[6]，對遠志多糖進行分離純化，并對其理化性質及其抗氧化和降血糖活性進行研究，旨在為更好地開發和利用遠志中的多糖組分，同時可為明確遠志的活性物質基礎提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

遠志購自河北安國藥材市場，經河北中醫學院鄭玉光教授鑒定為遠志科植物遠志（Polygala tenuifolia Willd.）的干燥根。

DEAE-cellulose 52、Sephadex G-100、Sephacryl S-300 HR 美國GE Healthcare公司；標準品葡聚糖Dextran系列（T4、T7、T10、T70、T200）、藍葡聚糖、各標準單糖、1,1-二苯基-2-苦味基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、VC、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG） 美國Sigma公司；阿卡波糖德國拜耳公司；其他化學試劑為進口或國產分析純。

1.2 儀器與設備

DBS-100自動部分收集器、恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司；EYELA N-1000旋轉蒸發儀日本東京理化器械公司；QP2010氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯用儀、TU-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司；WZZ-2B自動旋光儀 上海精密科學儀器廠；Dionex ICS-2500高效離子色譜 美國戴安公司；3110型酶標儀 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 遠志粗多糖的提取

準確稱取遠志粉末500 g，使用10 倍體積的95%食用乙醇回流提取2 次，每次2 h，以除去其中的脂溶性成分，過濾后取濾渣風干，備用。稱量醇提后的遠志殘渣430 g，加入10 倍體積的蒸餾水提取，在超聲波輔助的條件下，67 ℃恒溫提取2 次，每次0.5 h，合并水提液，用旋轉蒸發儀減壓濃縮至一定體積，使用4 倍體積的無水乙醇沉淀（乙醇終體積分數為80%），4 ℃靜置24 h，離心，沉淀為粗多糖PTP80[6]。PTP80使用木瓜蛋白酶結合Sevag法除蛋白，用XAD-7型大孔樹脂進行脫色處理，分別用自來水、蒸餾水各透析48 h[11]，減壓濃縮，真空冷凍干燥后得到遠志粗多糖PTP。

1.3.2 遠志粗多糖的分離純化

將粗多糖溶于少量蒸餾水中，配制成50 mg/mL多糖溶液，在多糖分離純化系統上，采用DEAE-cellulose 52柱（4.0 cm×80.0 cm）以0.0～1.0 mol/L NaCl線性洗脫，根據線性洗脫結果確定梯度洗脫的條件，自動部分收集（每管收集5.0 mL），以苯酚-硫酸法檢測各梯度中多糖組分的位置，分別收集相應梯度的多糖組分，透析脫鹽后濃縮凍干得純化后多糖樣品，下一步采用Sephadex G-100柱（2.6 cm×100.0 cm）以蒸餾水為洗脫液，自動部分收集（每管收集3.0 mL），以苯酚-硫酸法檢測多糖洗脫情況，分別收集相應的多糖組分，透析后濃縮凍干，得純化后多糖樣品。

1.3.3 遠志多糖的純度驗證

1.3.3.1 紫外-可見光譜分析

將樣品配制成質量濃度為1.0 mg/mL的溶液，在200～700 nm波長范圍內進行掃描。

1.3.3.2 比旋光度法分析

在20 ℃鈉光下，分別使用體積分數30%、60%、80%的乙醇沉淀多糖溶液，測定沉淀物的旋光度值。

1.3.3.3 凝膠滲透色譜法分析

樣品上樣于Sephacryl S-300 HR凝膠柱，以蒸餾水為洗脫液，苯酚-硫酸法檢測多糖洗脫情況，以流出液的管數為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制洗脫曲線[12]。

1.3.4 遠志多糖分子質量測定

采用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）測定遠志多糖PTP-1的相對分子質量（Mr）[12]。以T系列葡聚糖T4、T7、T10、T70、T200制作標準曲線，用Mr為200萬的藍葡聚糖確定凝膠柱的空體積V0，以葡萄糖確定凝膠柱的總柱體積Vt，以有效分配系數Kav為縱坐標，lgMr為橫坐標作標準曲線，分配系數Kav根據公式（1）計算。

式中：Ve為待測樣品的洗脫體積/mL；V0為色譜柱空體積/mL；Vt為色譜柱總體積/mL。

配制成質量濃度為2.0 mg/mL的多糖PTP-1溶液，上Sephacyl S-300 HR凝膠柱，根據出峰體積，計算Kav，代入上述標準曲線中，可計算PTP-1的Mr。

1.3.5 遠志多糖的理化性質測定

采用硫酸-苯酚法[12]測定總糖含量；采用Folin-酚法[13]測定蛋白含量；采用咔唑-硫酸法[14]測定糖醛酸含量；采用氯化鋇-明膠比濁法[15]測定硫酸根含量；自動旋光儀測定其比旋光度[11]。

1.3.6 遠志多糖的紅外光譜分析

稱取1.0 mg遠志多糖PTP-1，以KBr混合研磨成粉，壓片，在4 000～400 cm－1范圍內進行紅外光譜掃描[11]。

1.3.7 遠志多糖的DSC-TGA分析

稱取10.0 mg的遠志多糖PTP-1，溫度由室溫升至800 ℃，升溫速率為10 ℃/min，進行熱重分析，包括差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法和熱重分析（thermal gravimetric analysis，TGA）。以溫度為X軸，以質量損失率（某一溫度下失質量后樣品的實測質量與樣品總質量的比值）為Y軸，繪制熱重變化曲線。

1.3.8 遠志多糖的單糖組成分析

配成質量濃度為1.0 mg/mL的標準品溶液（L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、L-巖藻糖、D-果糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖），量取20.0 μL進行高效陰離子交換色譜-脈沖電流探測（high performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD）法測定。稱取PTP-1多糖2.0 mg，加入2.0 mL的2 mol/L三氟乙酸（trifi uoroacetic acid，TFA），封管后110 ℃水解6 h，減壓濃縮蒸干TFA，加入適量蒸餾水溶解，取20.0 μL進行HPAEC-PAD測定，根據各峰的保留時間和峰面積比計算出各單糖的組成和物質的量比[13]。

1.3.9 遠志多糖的甲基化反應及GC-MS分析

甲基化反應的方法，參考改良的Hakomori法及文獻[11,13]方法進行，反應產物經紅外光譜檢測，在3 500～3 300 cm－1處無羥基的特征吸收峰，說明樣品甲基化完全。取甲基化完全的多糖樣品，依次使用TFA水解，硼氫化鈉還原，醋酸酐乙酰化后，對乙酰化產物進行GC-MS分析。

1.3.10 遠志多糖的抗氧化活性測定

遠志多糖清除DPPH自由基、羥自由基（?OH）的測定參照文獻[16-18]方法進行測定。

1.3.11 體外降血糖活性測定

[19]方法，以PNPG為底物，測定α-葡萄糖苷酶的活性。具體操作為：以pH 6.8的磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制反應液，PTP-1（0.05～6.4 mg/mL）和阿卡波糖（0.05～6.4 mg/mL）分別與α-葡萄糖苷酶（1 U/mL）20 μL混勻，37 ℃孵育10 min，再加入底物5 mmol /L PNPG 20 μL，混勻，37 ℃反應30 min 后，加入0.2 mol/L Na2CO3終止反應。反應產物于405 nm波長處測定吸光度。以等體積溶劑PBS作為空白對照，阿卡波糖作為陽性對照。樣品對α-葡萄糖苷酶的抑制率根據公式（2）計算。

式中：A0為以等量PBS代替樣品溶液的吸光度；AS為加入PTP-1或阿卡波糖溶液反應后的吸光度。

2 結果與分析

2.1 遠志多糖的提取、分離和純化

遠志經乙醇除脂、超聲波輔助提取、乙醇沉淀、除蛋白質、除色素、透析凍干后，得到遠志粗多糖PTP 27.3 g，提取率為5.46%。粗多糖PTP經DEAE-cellulose 52離子交換柱分離，分別在水洗脫與梯度鹽洗脫部分得到2 個主峰，分別為PTP-A和PTP-B。選取PTP-B為下一步分離對象，經Sephadex G-100凝膠柱純化，得到對稱的單峰組分，透析后濃縮凍干得純化后多糖樣品PTP-1。

2.2 遠志多糖的純度驗證

紫外-可見分光光度計結果表明，PTP-1在260 nm和280 nm波長處均無明顯特征吸收，說明多糖中不含有蛋白質和核酸，在620 nm波長處無吸收峰則表明不含色素類物質。在3 種乙醇體積分數下，PTP-1的比旋光度基本相同，分別為：＋71.7°、＋71.4°、＋72.0°，表明其為相對均一多糖。

圖 1 PTP-1的Sephacryl S-300 HR凝膠柱層析洗脫曲線Fig. 1 Elution profi le of PTP-1 in Sephacryl S-300 HR column

由圖1可知，分離純化后的PTP-1在Sephacryl S-300 HR凝膠柱層析中獲得單一、對稱的洗脫峰。經紫外-可見光譜掃描法、比旋光度法、HPGPC驗證多糖PTP-1的純度，表明PTP-1為均一性良好的多糖。

2.3 遠志多糖相對分子質量及理化性質

根據葡聚糖Dextran系列制作標準曲線的回歸方程為：Y=－0.439 3X＋14.010 0（R2=0.998 9）。計算出PTP-1的相對分子質量為4.62×104。理化性質分析結果表明：遠志多糖PTP-1為總糖含量為98.6%，比旋光度平均值為＋71.7°，且不含有蛋白、糖醛酸和硫酸根的中性多糖。

2.4 遠志多糖的紅外光譜分析

圖 2 遠志多糖PTP-1的紅外光譜圖Fig. 2 FT-IR spectrum of PTP-1

如圖2所示，3 420 cm－1附近處強吸收峰為—OH的伸縮振動峰；在2 960、1 652、1 403、1 190、1 065 cm－1處的吸收均為多糖的特征吸收，824 cm－1和896 cm－1處的吸收顯示在結構中同時含有α和β兩種糖苷鍵構型存在[16]。

2.5 遠志多糖的DSC-TGA分析

圖 3 PTP-1的熱重分析曲線Fig. 3 DSC-TGA curve of PTP-1

由圖3可知，遠志多糖PTP-1有4 次明顯的質量損失過程。第1次質量損失出現在100 ℃左右，質量損失率為7.495%，推測其可能是多糖受熱失去部分吸附水造成的；第2次質量損失出現在200 ℃左右，質量損失率為9.497%，推測其可能是多糖受熱失去層間結合水或膠體水造成的；第3次質量損失出現在250～600 ℃，質量損失率為48.77%，在此溫度區間內多糖快速質量損失，表明PTP-1在該溫度區間內發生了劇烈的分解，推測為碳鏈和氫鍵斷裂造成的；600 ℃以后，質量損失趨勢減緩，PTP-1進一步分解。

2.6 遠志多糖的單糖組成分析

圖 4 標準單糖的高效離子色譜圖Fig. 4 HPAEC-PAD chromatograms of standard monosaccharides

圖 5 PTP-1完全酸水解的高效離子色譜圖Fig. 5 HPAEC-PAD chromatogram of PTP-1

經與標準單糖的高效離子色譜保留時間和峰面積對照分析（圖4、5），結果表明：PTP-1由半乳糖（galactose，Gal）、葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man）組成，其物質的量比為3.92∶1.00∶2.08。

2.7 遠志多糖的甲基化分析

表 1 遠志多糖PTP-1甲基化分析Table 1 Methylation analysis of PTP-1

根據Hakomori法對遠志多糖PTP-1進行甲基化5 次后，進行紅外光譜分析，在3 600～3 300 cm－1范圍內無—OH的特征吸收峰，說明樣品甲基化完全。對乙酰化產物進行GC-MS分析，結果見表1，結果表明，PTP-1由3 種單糖：Gal、Glc、Man組成，這與HPAEC-PAD單糖組成分析結果一致，其中，Gal主要以1→鍵型存在，Man主要以1→4鍵型存在，Glc主要以1→3,6、1→6鍵型存在。根據以上結果可以推測，構成PTP-1的主鏈為1→4連接的Man和1→6連接的Glc，該糖鏈的分枝點殘基為1,3,6→Glc，分枝點應在O-6上；Gal構成糖鏈的末端。

2.8 遠志多糖的抗氧化活性

圖 6 遠志多糖PTP-1和VC對DPPH自由基的清除活性Fig. 6 DPPH radical scavenging activity of PTP-1 and VC

由圖6可知，在一定質量濃度范圍內，隨著多糖質量濃度的增加，對DPPH自由基清除率逐漸增加，其中，在質量濃度為0.8 mg/mL時，遠志多糖的清除率達到72.8%，但清除率低于VC。遠志多糖PTP-1和VC對DPPH自由基的半數清除率濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為0.35 mg/mL和0.15 mg/mL。

圖 7 遠志多糖PTP-1和VC對 OH的清除活性Fig. 7 Hydroxyl radical scavenging activity of PTP-1 and VC

如圖7所示，在一定質量濃度范圍內，隨著PTP-1質量濃度的增加，對?OH清除率逐漸增加，呈現一定的量效關系。其中，在質量濃度為0.8 mg/mL時，遠志多糖的清除率達到63.3%，但清除效果不如對照品VC明顯。PTP-1和VC對?OH清除率的IC50值分別為0.51 mg/mL和0.16 mg/mL。

體外抗氧化研究結果表明，遠志多糖具有較強的清除自由基的能力，推測可能與多糖分子含有的單糖種類和糖苷鍵連接方式有關，多糖分子中含有大量的羥基，羥基上的氫和化學性質活潑的?OH反應，生成穩定碳自由基和水，達到清除?OH的目的；或者多糖環上的羥基可與產生?OH等所必需的金屬離子（如Fe2＋、Cu2＋等）絡合，使其不能產生啟動脂質過氧化的?OH，從而抑制活性自由基的產生[20]。另外，多糖自身大分子具有空間結構，可對DPPH自由基或?OH產生包合作用，從而抑制自由基反應[21]。如封燕等[22]報道的金蟬花多糖由Glc、Man和Gal組成，當質量濃度為0.8 mg/mL時，對DPPH自由基和?OH的清除率分別為79.16%和94.12%，和本研究的結果相一致。

2.9 遠志多糖的體外降血糖活性

表 2 阿卡波糖及遠志多糖PTP-1對α-葡萄糖苷酶的抑制活性Table 2 Inhibitory effects of PTP-1 and acarbose on α-glucosidase activity

如表2所示，PTP-1對α-葡萄糖苷酶的抑制活性隨質量濃度增加而增大，在6.40 mg/mL時達到81.66%。計算得到阿卡波糖的IC50值為0.45 mg/mL，PTP-1與阿卡波糖的IC50值較為接近，為0.52 mg/mL。由結果可知，PTP-1具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究者發現，荔枝多糖、蛹蟲草多糖以及南瓜多糖等具有較強的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，并且這些活性多糖主要由Gal、Glc、Man等構成，如蛹蟲草多糖由Gal、Glc、Man組成，比例為3.22∶39.90∶2.39[23]；南瓜多糖也由Man、Glc、Gal組成，比例為5.50∶1.00∶7.47[24]；荔枝多糖主要是由Glc、Gal、Man、阿拉伯糖、鼠李糖等組成[25]，本實驗的中遠志多糖由Gal、Glc、Man組成，比例為3.92∶1.00∶2.08，具有較強的對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，與文獻報道的單糖組成相似，只是單糖組成比例有所不同。

3 結 論

采用超聲波輔助提取法、經過分級醇沉、除蛋白、除色素、透析、冷凍干燥后得到遠志粗多糖。遠志粗多糖經DEAE-cellulose 52和Sephadex G-100柱依次分離純化得到組分PTP-1，采用3 種方法驗證了其純度，表明遠志多糖PTP-1為均一性良好的多糖。PTP-1的相對分子質量為4.62×104，是由Gal、Glc、Man組成，物質的量比為：3.92∶1.00∶2.08，總糖含量為98.6%，比旋光度平均值為＋71.7°，且不含有蛋白質、糖醛酸和硫酸根的中性多糖。

抗氧化活性結果表明，在一定的質量濃度范圍內遠志多糖PTP-1對DPPH自由基和?OH均具有明顯的劑量效應，IC50值分別為0.35 mg/mL和0.51 mg/mL，相對于遠志粗多糖清除DPPH自由基和?OH的IC50值分別為0.83、1.29 mg/mL[5]，純化后抗氧化能力得到提高，說明遠志多糖具有較強的抗氧化能力，推測可能與多糖分子中含有的單糖種類、糖苷鍵連接方式、羥基基團以及空間結構等相關。降血糖活性研究表明，遠志多糖PTP-1具有較強的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50值為0.52 mg/mL，說明遠志多糖與α-葡萄糖苷酶形成競爭抑制效應可能是遠志降血糖的途徑之一。遠志多糖PTP-1以其優良的抗氧化和降血糖活性在醫藥、保健品及化妝品工業中擁有一定的潛力，本研究可為遠志的深加工和進一步研究開發提供一定的理論依據。

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Purifi cation and Structural Characterization of Polysaccharide from Polygala tenuifolia and Its Biological Activity

JING Yongshuai1, ZHANG Danshen1, WU Lanfang2,*, ZHENG Yuguang2
(1. College of Chemistry and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. College of Pharmacology, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China)

Objective: To isolate and purify a polysaccharide from dried roots of Polygala tenuifolia and to determine its physicochemical properties and biological activity. Methods: The purified polysaccharide was obtained by ultrasonicassisted extraction, alcohol fractional precipitation, deproteinization, decolorization, dialysis, DEAE-cellulose 52 and Sephadex G-100 gel column chromatography. The purity of the final purified product was determined by UV-visible spectroscopy, spin spectrophotometry and gel filtration chromatography (GPC). The relative molecular mass of the polysaccharide was determined by high performance gel permeation chromatography, the monosaccharide composition was analyzed by high performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD), the antioxidant activity was evaluated by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and hydroxyl free radical scavenging assays, and the hypoglycemic activity was evaluated by α-glucosidase-inhibiting activity. Results: A homogeneous polysaccharide (PTP-1) was obtained. The relative molecular mass of PTP-1 was 4.62 × 104. Its monosaccharide composition was composed of galactose, glucose and mannose with a molar ratio of 3.92:1.00:2.08. The polysaccharide showed DPPH and hydroxyl radical scavenging capacity in a dose-dependent manner in a certain concentration range, with IC50of 0.35 and 0.51 mg/mL, respectively. In addition, it was able to signifi cantly inhibit α-glucosidase activity with IC50 of 0.52 mg/mL. Conclusion: PTP-1 is a pure polysaccharide with antioxidant and hypoglycemic activity.

Polygala tenuifolia; polysaccharide; physicochemical property; antioxidant activity; hypoglycemic activity

10.7506/spkx1002-6630-201717021

TS201.2

A

1002-6630（2017）17-0126-06引文格式：

2016-08-01

河北省自然科學基金項目（H2016208059；H2016208058；H2017423023）；河北省教育廳高等學校科學技術研究項目（QN2016187；QN2016099；ZD2016009）；河北省食藥監局食品藥品安全科技項目（QN2015016；QN2016013）

景永帥（1985—），男，講師，博士，研究方向為天然產物化學。E-mail：cjys1985@126.com

*通信作者：吳蘭芳（1985—），女，講師，博士，研究方向為藥食兩用資源開發與利用。E-mail：wulanfang757@163.com