枸杞多糖對順鉑誘導小鼠睪丸支持細胞TM4氧化損傷的影響

王 海，周 游，黃姍婉，高麗萍*

（北京聯合大學應用文理學院，生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191）

枸杞多糖對順鉑誘導小鼠睪丸支持細胞TM4氧化損傷的影響

王 海，周 游，黃姍婉，高麗萍*

（北京聯合大學應用文理學院，生物活性物質與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191）

目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）對順鉑（cis-dichlorodiamineplatinum (Ⅱ)，CDDP）誘導的小鼠睪丸支持細胞TM4氧化損傷的影響，并探討其可能的作用機制。方法：噻唑藍法測定CDDP、LBP分別對TM4細胞生長的影響以及LBP對CDDP誘導的細胞毒性的拮抗作用。硫代巴比妥酸法測定細胞中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，二硫代二硝基苯甲酸法測定谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力。結果：5～100 mg/L LBP可極顯著提高TM4細胞存活率（P＜0.01），20～100 mg/L LBP能夠極顯著抑制CDDP造成的細胞毒性（P＜0.01），50 mg/L的LBP保護效果最佳。50 mg/L LBP能夠極顯著抑制CDDP（12 mg/L）引起的MDA含量升高以及GSH含量和SOD活力降低（P＜0.01）。結論：LBP能有效拮抗順鉑誘導的TM4細胞氧化損傷，其機制與LBP較強的抗氧化作用有關。

枸杞多糖；順鉑；小鼠睪丸支持細胞TM4；氧化損傷

王海, 周游, 黃姍婉, 等. 枸杞多糖對順鉑誘導小鼠睪丸支持細胞TM4氧化損傷的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(17): 198-202. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717032. http://www.spkx.net.cn

WANG Hai, ZHOU You, HUANG Shanwan, et al. Protective effect of Lycium barbarum polysaccharides on cis-dichlorodiamineplatinum (Ⅱ) -induced oxidative damage in mouse testis sertoli cells TM4[J]. Food Science, 2017, 38(17): 198-202. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717032. http://www.spkx.net.cn

順鉑（cis-dichlorodiamineplatinum (Ⅱ)，CDDP）是臨床化療應用較廣泛的藥物，對腫瘤的治療效果明顯，但對人體產生的毒副作用成為臨床應用上的瓶頸。以CDDP為基礎的化療對不同的組織均有損害，如腎、肝、睪丸等，其中腎毒性是CDDP最主要的毒副作用，而生殖毒性也不能被忽視[1]。CDDP在不同動物體中具有遺傳毒性，表現在染色體畸變、姐妹染色體交換和骨髓與精原細胞的微核實驗中。由于CDDP的精子毒性，幾乎所有使用CDDP臨床化療的癌癥患者都表現出了精子缺乏癥[2-4]。

枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）是從枸杞中提取而得的一種水溶性多糖。枸杞具有藥理活性，主要是因為含有生物活性物質LBP。LBP對機體沒有毒性，展示出廣泛的藥理活性。在生殖毒性的防護方面，有研究表明LBP可以減少熱損傷小鼠生精上皮細胞的凋亡[5]。黃曉蘭等[6]認為LBP可通過抗氧化及調節下丘腦-垂體-性腺軸實現對大鼠生殖系統的保護。Luo Qiong等[7]發現LBP對高溫和H2O2引起的小鼠生精細胞及染色體損傷具有修復和保護作用。現代科學研究表明，LBP除具有很高的抗氧化作用外，同時也具有調節免疫、抑制腫瘤、清除自由基、延緩衰老、降血脂和抗疲勞等作用，具有良好的開發前景[8-10]。

目前，LBP對CDDP所致睪丸支持細胞（sertoli cell，SC）氧化損傷的影響鮮見報道，本課題探討LBP對CDDP誘導的生殖毒性的防護作用及其作用機制，為其應用于臨床、提高CDDP的化療效果及為癌癥化療提供有效的輔助品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠睪丸SC（TM4）由中國協和醫科大學提供。

CDDP（注射用凍干粉劑） 齊魯制藥有限公司；LBP（純度≥90%） 南京澤朗醫藥科技有限公司；DMEM/F12培養基、胎牛血清 美國Hyclone公司；噻唑藍（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TE2000-M倒置顯微鏡 日本Nikon公司；3K15臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；MQX-200微孔板分光光度計 美國Bio-Tek公司；WFZ UV-4802H紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養

TM4細胞采用含雙抗和10%胎牛血清的DMEM/F12培養基，并置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養箱中培養。選擇對數生長期的細胞進行實驗。

1.3.2 CDDP對TM4細胞生長的影響

將細胞（1×105個/mL）接種于96 孔板，每孔200 μL。待細胞生長到融合狀態，棄掉培養液，每孔加入200 μL含不同質量濃度的CDDP（0.0（對照）、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0 mg/L）的無血清培養基。每組設置6 個平行。在培養箱中培養24 h后，棄掉培養液，各孔加入200 μL終質量濃度為0.5 mg/mL MTT，繼續孵育4 h后，棄去廢液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，用酶標儀在570 nm波長處測吸光度。按照下式計算細胞存活率。

1.3.3 LBP對TM4細胞生長的影響

同1.3.2節的方法，將CDDP換成不同質量濃度的LBP（0（對照）、1、2、5、10、16、25、32、50、64、100、200、400、600、800 mg/L和1 000 mg/L）。計算細胞存活率。

1.3.4 LBP對CDDP所致TM4細胞毒性的影響

根據1.3.1的結果，實驗分為3組：對照組未加入CDDP和LBP；CDDP組，TM4細胞CDDP質量濃度為12 mg/L；CDDP＋LBP組，在加入12 mg/L CDDP前24 h分別加入不同質量濃度的LBP（10、20、30、40、50、60、70、80 mg/L和100 mg/L），不加藥組以相應量的無菌水作為對照，繼續培養24 h后，計算細胞存活率。

1.3.5 TM4細胞蛋白濃度及細胞內MDA、GSH含量、SOD活力的測定

根據1.3.4節的結果，將細胞分為4 個組：對照組，未加入CDDP和LBP；CDDP組，加入12 mg/L CDDP；LBP組，加入50 mg/L LBP；CDDP＋LBP組，加入12 mg/L CDDP和50 mg/L LBP。將2 mL（濃度為1×105個/mL）處于生長期的細胞接種到6 孔板，待細胞生長至融合狀態時，按照實驗分組加藥處理。繼續培養24 h后，棄去培養液，每孔加入300 μL 0.01 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，用細胞刮收集細胞后，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，1 mL上述磷酸鹽緩沖液重懸，于細胞破碎儀上30 Hz破碎10 s；取勻漿液10 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照測試盒說明進行操作，測定細胞蛋白質量濃度、MDA、GSH含量以及SOD活力。

1.4 統計分析

采用SPSS 19.0軟件進行統計分析，結果表示為±s，單因素方差分析對數據進行Duncan檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。用Origin 9.1軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 CDDP對TM4細胞生長的影響

圖 1 CDDP對TM4細胞存活率的影響Fig. 1 Effect of CDDP on the survival of TM4 cells

用不同質量濃度的CDDP處理TM4細胞24 h，如圖1所示，隨著CDDP質量濃度的增大，TM4細胞存活率逐漸降低。CDDP從1 mg/L開始，各加藥組抑制率與對照組相比有極顯著性差異（P＜0.01）。通過SPSS軟件計算CDDP對TM4細胞抑制率的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為12.276 mg/L，因此選擇12 mg/L質量濃度的CDDP用于后續實驗。

2.2 LBP對TM4細胞生長的影響

圖 2 LBP對TM4細胞存活率的影響Fig. 2 Effect of LBP on the survival of TM4 cells

圖2 為LBP處理TM4細胞24 h后的實驗結果。當LBP質量濃度小于50 mg/L時，TM4細胞存活率隨LBP質量濃度升高而增大，與對照組比較，LBP（5mg/L）各組存活率極顯著升高（P＜0.01）。當LBP質量濃度大于64 mg/L時，TM4細胞存活率隨LBP質量濃度升高呈明顯下降趨勢，除200 mg/L質量濃度外，LBP各組細胞存活率較對照組極顯著降低（P＜0.01）。在LBP質量濃度大于200 mg/L后細胞存活率小于正常細胞，且存活率大幅度下降，在1 000 mg/L的LBP作用下，細胞存活率幾乎為0%。這表明在一定程度上LBP可以促進細胞生長，但較高質量濃度條件下會抑制細胞存活。

2.3 LBP對CDDP所致TM4細胞毒性的影響

圖 3 LBP對CDDP誘導TM4細胞存活率的影響Fig. 3 Effect of LBP on the survival of TM4 cells exposed to CDDP

用質量濃度為12 mg/L的CDDP建立TM4細胞損傷模型，用不同質量濃度LBP提前24 h處理TM4細胞。結果如圖3所示，當LBP質量濃度大于等于20 mg/L時，與CDDP模型組對比，CDDP＋LBP組細胞存活率極顯著提高（P＜0.01），但隨著LBP濃度的升高細胞存活率先升高后降低，在LBP濃度為50 mg/L時，細胞存活率達到最高62.30%。這表明在一定質量濃度范圍內，LBP對CDDP所致細胞損傷具有明顯的保護作用，50 mg/L質量濃度的LBP保護效果最佳。

2.4 LBP對CDDP誘導TM4細胞內抗氧化指標的影響

表 1 LBP對CDDP誘導TM4細胞內抗氧化指標的影響Table 1 Effect of LBP on antioxidant indexes in TM4 cells exposed to CDDP

LBP對CDDP誘導TM4細胞內抗氧化指標的影響的實驗結果見表1。和對照組相比，CDDP組MDA含量極顯著增加（P＜0.01），GSH含量和SOD活力極顯著降低（P＜0.01）；LBP組MDA含量極顯著減少（P＜0.01），GSH含量和SOD活力無顯著差異（P＞0.05），說明CDDP引起TM4細胞抗氧化水平降低。提前加入LBP預處理后，和CDDP組比較，CDDP＋LBP組細胞內MDA含量極顯著減少（P＜0.01），GSH含量和SOD活力均極顯著提高（P＜0.01）。結果表明，LBP可有效拮抗CDDP誘導的TM4細胞氧化損傷。

3 結論與討論

最近，化療引起的睪丸功能性障礙已引起人們廣泛的關注。Ishikawa等[11]報道CDDP化學療法是一種治療生精細胞腫瘤最有效的化學療法，然而對精子有嚴重的毒性。另外，有研究表明以CDDP為基礎的化學療法引起了精子中線粒體異常，暫時或永久性的精子活力缺乏或精子減少[12]。Turk等[13]報告說CDDP處理組中睪丸和附睪質量的減少歸因于生發層細胞厚度在薄壁組織的萎縮和其他病理結果的惡化。許多研究證明大鼠精子游動性的顯著性降低與注射CDDP有關[13-14]。

SC是存在于睪丸生精小管內皮，從曲細精管基底膜直達管腔的長錐形上皮樣貼壁生長的細胞，其主要作用是支持生精細胞生長，為生精細胞的分化發育提供合適的微環境。在哺乳動物的睪丸組織中，SC在形成和保護精子的過程中起關鍵作用[15]，是生精小管的重要組成部分。SC數量決定生精細胞數量、睪丸大小以及精子產量等[16]。任何可能影響男性幼年SC數量處于正常值范圍內的生殖毒性物質將間接影響其在成年后的生育情況。因此，減輕CDDP造成的生殖毒性顯得至關重要。LBP作為一種天然活性物質，具有較強的細胞保護作用和免疫活性[17]。在本實驗中，LBP在0～50 mg/L質量濃度范圍內可劑量依賴性地提高TM4細胞存活率，在20～100 mg/L質量濃度范圍內可極顯著提高CDDP損傷的細胞存活率（P＜0.01），以終質量濃度50 mg/L效果最佳，表明一定質量濃度的LBP對CDDP誘導的TM4細胞毒性有明顯的保護作用。

但是，關于CDDP所致生殖毒性的機制尚未完全闡述清楚，一種觀點認為，脂質過氧化和氧化應激是CDDP細胞毒性機制之一[18]。氧自由基廣泛存在于體內各種組織中，可以破壞氧化與抗氧化的平衡。機體內氧自由基能引發生物膜中脂質過氧化作用，形成脂質過氧化物如MDA、酮基等，導致細胞代謝、功能和結構的改變[19]。體內產生過多的自由基或清除自由基的能力降低將引發機體和組織功能障礙[20]。由于藥物毒性的分子生物學機制，活性氧和氧化性損傷可能通過減弱精子的功能引起雄性不育。已經確定在低生育或不育男性的精漿和精子中有過多的氧自由基產生[21]。本實驗指出，CDDP可極顯著提高TM4細胞中MDA含量（P＜0.01），Atessahin等[14]在一項研究中報道，CDDP能夠引起血漿、精子和睪丸組織中MDA水平的增加，與本研究結果一致。另外，在用50 mg/L的LBP進行干預后發現，LBP保護組TM4細胞中MDA含量極顯著減少（P＜0.01），LBP和CDDP聯合處理組的MDA含量同樣極顯著降低，趨于正常對照組水平（P＞0.05）。王建華等[22-23]經過提取，研究了LBP不同組分的抗羥基氧化和抗脂質過氧化的作用。結果表明，LBP可以清除羥基所導致的MDA的產生，抑制羥基所致細胞膜流動性下降和線粒體膨脹程度，減少紅細胞出現溶血現象，從而起到抗羥基氧化的作用。本研究結果說明一定質量濃度的LBP能夠清除TM4細胞內過多的脂質過氧化物，從而保護細胞免受因自由基引起的氧化損傷。

GSH是細胞防御有毒化合物或氧化應激化學反應的最重要的分子之一。細胞中GSH的含量減少和GSH合成能力的降低使細胞對特定的藥物變得敏感，GSH含量升高是保持細胞內巰基氧化還原狀態的主要機制[24]。細胞內GSH合成量增加，GSH用于解毒提示機體內存在著抵抗化學損傷的重要保護機制[25]。SOD是一種金屬蛋白，和GSH有相似的功能，都能夠清除氧自由基，從而保護細胞免受超氧化物自由基的損傷[26]。邵鴻娥等[27]在LBP對小鼠體內抗氧化酶活性及耐力的影響的實驗中發現，LBP可使小鼠血中SOD活力明顯升高、MDA含量明顯降低，認為LBP具有良好的體內抗氧化作用，可以延緩衰老。本研究結果表明，CDDP模型組GSH含量和SOD活力明顯低于對照組，提示CDDP誘發產生的自由基超出細胞抗氧化系統的代償能力，最終引起細胞的氧化損傷。本實驗中，50 mg/L LBP＋CDDP組較CDDP組GSH含量和SOD活力極顯著提高（P＜0.01）。實驗同時測定LBP對正常TM4細胞抗氧化指標的影響，結果表明LBP可極顯著降低MDA水平，提高GSH含量和SOD活力（P＜0.01）。提示LBP對CDDP誘導的TM4細胞氧化損傷具有明顯的拮抗作用。

綜上所述，LBP能夠在一定質量濃度范圍提高TM4細胞存活率，可拮抗CDDP所致TM4細胞的氧化損傷，然而LBP對CDDP誘導的細胞凋亡及是否通過阻滯細胞周期來拮抗CDDP生殖毒性，仍需進一步研究。

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Protective Effect of Lycium barbarum Polysaccharides on cis-Dichlorodiamineplatinum (Ⅱ)-Induced Oxidative Damage in Mouse Testis Sertoli Cells TM4

WANG Hai, ZHOU You, HUANG Shanwan, GAO Liping*
(Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, College of Arts and Sciences, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Objective: To explore the effect of Lycium barbarum polysaccharides (LBP) on cis-dichlorodiamineplatinum (II) (CDDP)-induced oxidative damage in mouse testis sertoli cells TM4 and its possible mechanism. Methods: The survival rate of the cells was evaluated by MTT assay. Superoxide dismutase (SOD) activity was examined by xanthine oxidase method. Malondialdehyde (MDA) content was measured by thiobarbituric acid assay. Glutathione (GSH) content was determined by nitrobenzoic acid method. Results: LBP at 5–100 mg/L could signifi cantly enhance the survival rate of TM4 cells (P ＜ 0.01), and at 20–100 mg/L could signifi cantly inhibit the toxic effect of CDDP on TM4 cells (P ＜ 0.01), and the best protective effect was observed as 50 mg/L. LBP at 50 mg/L could significantly reduce intracellular MDA content, increase SOD activity and GSH levels drop compared with CDDP control group (P ＜ 0.01). Conclusion: CDDP-induced damage in TM4 cells could be remarkably reversed by LBP, which may be related with the strong antioxidant potential of LBP.

Lycium barbarum polysaccharides (LBP); cis-dichlorodiamineplatinum (Ⅱ); mouse testis sertoli cells TM4; oxidative damage

10.7506/spkx1002-6630-201717032

R285.6

A

1002-6630（2017）17-0198-05引文格式：

2016-12-10

北京市自然科學基金項目（7163211）

王海（1992—），男，碩士，研究方向為生物活性物質對機體的生化作用。E-mail：916319176@qq.com

*通信作者：高麗萍（1962—），女，教授，博士，研究方向為生物活性物質對機體的生化作用。E-mail：gaolip62@163.com