水蛭通過p38MAPK信號通路對早期動脈粥樣硬化大鼠VSMCs的影響

吳晶魁+楊喬 李洋洋

[摘要]為了探究中藥水蛭干預作用下p38MAPK信號轉(zhuǎn)導通路對早期動脈粥樣硬化（AS）大鼠血管平滑肌細胞（VSMCs）增殖與凋亡的影響及其可能機制。實驗通過生化分析儀檢測中藥水蛭對大鼠血脂（TG，TC，LDLC，HDLC）水平的調(diào)控；ELISA檢測血清中TGFβ1的水平；免疫組織化學法（IHC）檢測VSMCs的PCNA，Caspase3表達水平；Western blot檢測中藥水蛭對VSMCs中MKK3，p38及Cmyc蛋白表達的影響；HE染色觀察大鼠胸主動脈形態(tài)變化。結(jié)果顯示，中藥水蛭可使TC，LDLC明顯降低，HDLC升高，TGFβ1，PCNA的表達水平明顯下降，Caspase3表達上調(diào)，MKK3，p38及Cmyc蛋白表達水平下降，以及抑制內(nèi)膜增厚、減少斑塊形成。以上結(jié)果表明中藥水蛭可能通過調(diào)降血脂，降低TGFβ1水平，影響p38MAPK信號通路蛋白表達，從而抑制VSMCs的增殖、促進其凋亡，抑制內(nèi)膜增厚、減少斑塊形成等環(huán)節(jié)，進而干預早期AS進程。

[關(guān)鍵詞]水蛭；動脈粥樣硬化；p38MAPK信號通路；血管平滑肌細胞；增殖與凋亡

Effect of leech on VSMCs in early atherosclerosis rats via

p38MAPK signaling pathway

WU Jingkui1， YANG Qiao1*， LI Yangyang2， XIE Dongjie1

（1Tianjin Medical University General Hospital， Tianjin 300052， China；

2The First Affiliated Hospital of Henan University of Science and Technology， Luoyang 471003， China）

[Abstract]To explore the effect of leech on proliferation and apoptosis of vascular smooth muscle cells（VSMCs） in early atherosclerosis rats via p38MAPK signaling pathway and investigate its possible mechanism Biochemical analyzer was used to examine the regulation of leech on levels of triglycerides（TG）， total cholesterol（TC）， lowdensity lipoprotein（LDLC）， and highdensity lipoprotein（HDLC） in blood lipid of rats The expression of transforming growth factorbeta 1（TGFβ1） in serum was detected by ELISA Immunological histological chemistry （IHC） was taken to measure the expression levels of proliferating cell nucleus antigen（PCNA） and cell apoptosis proteinase3（Caspase3）， while the protein expression levels of MKK3， p38 and Cmyc were detected by Western blot In addition， hematoxylin and eosin（HE） staining was used to observe the morphological change of thoracic aortas The results showed that leech decreased the levels of TC， LDLC obviously and increased HDLC， suppressed the expression levels of TGFβ1 and PCNA， upregulated Caspase3， downregulated the expression levels of MKK3， p38， and Cmyc protein HE staining indicated that it could inhibit intimal thickening and reduce plaque formation The above results indicated that leech may affect the protein expression of the p38MAPK signaling pathway to inhibit proliferation and promote the apoptosis of VSMCs via reducing blood lipid levels and suppressing TGFβ1， aiming at inhibiting intimal thickening and reducing plaque formation， tand then slowing down the process of early atherosclerosis

[Key words]leech； atherosclerosis； p38MAPK signaling pathway； vascular smooth muscle cells； proliferation and apoptosisendprint

血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）的激活、遷移與增殖是動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）發(fā)生的重要病理過程[1]。一般情況下，VSMCs保持靜止，即處于不增殖的狀態(tài)[2]，但是在血管損傷后VSMCs將會異常增殖，同時引起早期AS病理改變[3]。有研究指出，VSMCs增殖與凋亡的失衡是AS發(fā)生過程中斑塊形成的的重要環(huán)節(jié)[4]。轉(zhuǎn)化生長因子β1（transforming growth factorbeta1，TGFβ1）具有激活細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路以及促進細胞增殖、分化的作用[5]。p38絲裂原活化蛋白激酶（p38 mitogenactivated protein kinase，p38MAPK）是調(diào)控細胞增殖與死亡的重要通路，可參與細胞增殖、分化和凋亡等多種生理過程[6]，TGFβ1作為外在刺激因子，對p38MAPK信號通路的激活具有重要作用[7]。血管壁的組成細胞主要包括VSMCs和內(nèi)皮細胞，成熟的內(nèi)皮細胞不具有增殖活性，因此在早期AS的發(fā)生主要為VSMCs增殖所致；增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）[8]是細胞基因復制、修復及細胞周期控制的基本蛋白，為細胞增殖的一種可靠標志物，所以在早期AS過程中PCNA含量的變化與VSMCs異常增殖保持一致。AS發(fā)生過程中也存在VSMCs的凋亡，而細胞凋亡蛋白3（Caspase3）是細胞凋亡通路中一種關(guān)鍵的執(zhí)行蛋白，在細胞凋亡過程中具有重要的作用，胞漿中活化后的Caspase3能夠裂解相應的胞漿及胞核底物，最終導致細胞凋亡[9]。

中藥水蛭（leech）最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》：“主逐惡血、瘀血、月閉、破血瘕積聚……利水道”，水蛭味咸、苦、平，有破血逐瘀，通經(jīng)消癥的功效。對不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死、高脂血癥、冠狀動脈支架術(shù)后再狹窄等多種心血管疾病具有較好的臨床療效[10]。

本課題組對脈血康膠囊（內(nèi)容物為單藥水蛭粉）的前期實驗結(jié)果表明，中藥水蛭具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、減輕氧化損傷、保護血管內(nèi)皮、抑制炎癥反應等作用[1112]，同時可抑制VSMCs表型轉(zhuǎn)化、增殖和遷移[13]。本實驗通過觀察中藥水蛭干預早期AS大鼠，檢測VSMCs增殖與凋亡及p38MAPK信號通路蛋白等指標，探究中藥水蛭干預下p38MAPK信號通路對VSMCs增殖與凋亡的影響及抗AS的作用機制。

1材料

11動物健康雄性Wistar大鼠40只，SPF級，體質(zhì)量（175±20） g，購于中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所動物實驗中心，許可證號SCXK（軍）20160001。

12藥物及試劑本實驗所用中藥水蛭為脈血康膠囊內(nèi)容物（貴州信邦制藥股份有限公司提供，批號20160406）；高脂飼料[配方：729%普通飼料，2%膽固醇，01%膽鹽，5%蔗糖，10%豬油，10%蛋黃粉，合格證號SCXK（京）20140008，批號20160410]及普通飼料（合格證號SCXK（京）20060006，批號20160310）訂購于北京華阜康生物科技股份有限公司；維生素D3注射液（上海通用藥業(yè)股份有限公司，批號130107）；醫(yī)用水合氯醛（批號20160426）由天津醫(yī)科大學總醫(yī)院提供；TGFβ1酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）測定試劑盒（貨號EK0514）、大鼠抗PCNA（貨號BM0104）、Caspase3單克隆抗體（貨號BA2142）及鏈霉親和素生物素過氧化物酶復合物（SABCPOD）免疫組化試劑盒（貨號SAl020）與DAB顯色試劑盒棕黃（貨號AR1022）購于武漢博士德生物公司；血脂試劑盒（德國羅氏診斷有限公司）；兔抗MKK3、抗p38（D13E1）、抗Cmyc（D3N8F）單克隆抗體（美國Cell Signaling Technology公司，貨號分別為5674s，8690s，13987s）；βactin抗體（美國Santa Cruz公司，貨號SC47778）。

13儀器TL18M臺式高速冷凍離心機（上海離心機械研究所）；Modular P全自動生化分析儀（德國羅氏診斷有限公司）；Tecan Safire酶標儀（瑞士）；TU1810紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；Olympus BX51正置熒光顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（日本）；Research plus移液槍（德國Eppendorf）；EPS300電泳/電轉(zhuǎn)裝置（上海天能科技有限公司）；Chemi Scope 6300化學發(fā)光成像儀（上海勤翔科學儀器有限公司）；TS100搖床（其林貝爾儀器制造有限公司）。

2方法

21動物分組及處理40只Wistar大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，采用數(shù)字隨機表法將大鼠分為4組：正常對照組、模型對照組、水蛭粉低、高（06，12 g·kg-1）劑量組，每組各10只。隨即對模型組、水蛭高、低劑量組大鼠一次性腹腔注射維生素D3注射液60萬IU·kg-1，同時給予高脂飼料喂養(yǎng)；對照組大鼠腹腔注射等量生理鹽水，給予普通飼料喂養(yǎng)。第2天將配好的中藥水蛭藥液按照規(guī)定劑量（10 mL·kg-1）分別對水蛭干預組進行灌胃，同時對照組和模型組給予等量蒸餾水灌胃，每天1次，連續(xù)灌胃8周。每周末稱大鼠體質(zhì)量1次以調(diào)整灌胃量。

22血清指標檢測實驗末，各組大鼠禁食不禁水12 h，次日清晨腹腔注射10%水合氯醛（3 mL·kg-1）進行麻醉，麻醉滿意固定好后剖開腹腔，腹主動脈取血6 mL，迅速4 ℃下以3 000 r·min-1離心10 min，用移液槍將上層血清分裝于凍存管中放入-20 ℃冰箱中保存待檢測。①取部分血清復溫，于全自動生化分析儀上檢測血清總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDLC）和低密度脂蛋白膽固醇（LDLC）；②另取各組大鼠部分血清復溫，按ELISA試劑盒說明書要求測定血清TGFβ1含量。endprint

23主動脈病理學觀察取血后，分離出主動脈弓并剪取05 cm，生理鹽水洗凈血跡后放入10%中性福爾馬林溶液固定，以備制作石蠟切片（4～5 μm）。每組隨機選取7個大鼠主動脈弓標本，每一標本取一張石蠟切片進行蘇木精和伊紅（HE）染色，200倍光鏡下觀察主動脈的形態(tài)。

24免疫組織化學法檢測PCNA，Caspase3的表達選取已制作好的石蠟切片（每組各7個標本），每一標本PCNA，Caspase3指標各染2張片；按SABC免疫組化試劑盒說明書進行操作，大鼠PCNA，Caspase3對應抗體分別按1∶100及1∶150稀釋作為一抗，顯二管DAB顯色，封片。免疫組化完成后，將各指標染色切片于400倍光鏡下觀察5個不重疊視野并拍照。使用ImagePro Plus 60軟件測量分析VSMCs分布區(qū)域面積（area）和其所在范圍內(nèi)PCNA，Caspase3陽性染色積分光吸收度（A），最后用每個標本的平均光密度值（A/area）進行半定量分析。

25Western blot檢測MKK3，p38，Cmyc蛋白的表達剪取剩余胸主動脈，分段放入凍存管于液氮中迅速冷凍，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存待檢測。各組隨機取7個冷凍標本，復溫后用預生理鹽水漂洗去除血跡，超聲破碎，取裂解液，加入上樣緩沖液，混勻，取離心后的樣本上樣，按照電泳程序進行電泳。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取下膜，浸沒在5%牛奶中封閉1 h，之后按照說明書使用要求加一抗，于4 ℃孵育過夜。洗滌，孵育二抗，室溫孵育1 h。洗滌3次顯色，曝光。使用Image J軟件對MKK3，p38，Cmyc蛋白條帶進行灰度值計算，與內(nèi)參比較，分析相對蛋白表達量。

26統(tǒng)計學方法采用SPSS 220統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，先對各數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，計量資料以±s表示；多組資料組間比較采用單因素方差分析（ANOVA）：方差齊時，組間比較采用LSD檢驗，方差不齊時采用Tamhane′s T2檢驗；P<005或P<001為差異具有統(tǒng)計學意義。

3結(jié)果

31中藥水蛭對早期AS大鼠血脂水平的影響各組TG差異不明顯，無統(tǒng)計學意義；與對照組比較，模型組TC和LDLC顯著升高，HDLC降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<001）；與模型組比較，水蛭各干預組的TC和LDLC明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<001），水蛭低劑量組較高劑量組有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義；水蛭2個干預組較模型組HDLC有升高趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<001），2組間HDLC無明顯差異，見表1。

32中藥水蛭對早期AS大鼠血清TGFβ1表達水平的影響模型組TGFβ1較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<001）；水蛭各干預組TGFβ1明顯較模型組降低，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<001）；2個水蛭干預組組間差異不明顯，無統(tǒng)計學意義，見表2。

33中藥水蛭對早期AS大鼠VSMCs的PCNA，Caspase3表達影響模型組的PCNA較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<001），Caspase3輕度升高，但差異無統(tǒng)計學意義；水蛭各干預組額PCNA較模型組明顯降低，Caspase3明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<001）；與水蛭低劑量組相比，水蛭高劑量組PCNA有所升高，Caspase3有所降低，但差異無統(tǒng)計學意義，見表3，見圖1，2。

34中藥水蛭對早期 AS大鼠VSMCs中MKK3，p38，Cmyc蛋白表達影響的Western blot檢測與對照組相比較，模型組的p38和Cmyc蛋白表達增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<001），MKK3表達水平差異不明顯，無統(tǒng)計學意義；水蛭各干預組的MKK3，p38，Cmyc蛋白表達明顯較模型組降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<001）；與水蛭低劑量組比較，水蛭高劑量組的MKK3及Cmyc蛋白表達輕度增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<005），p38表達水平差異不明顯，不具有統(tǒng)計學意義，見表4，圖3。

35胸主動脈HE染色光鏡下觀察胸主動脈HE染色切片（200倍視野），可見對照組大鼠主動脈內(nèi)膜完整、光滑，VSMCs排列整齊，未見明顯膽固醇結(jié)晶沉積及斑塊形成；模型組主動脈內(nèi)膜不平整，可見明顯向腔內(nèi)凸起的斑塊，內(nèi)、中膜明顯增厚，VSMCs增生、排列紊亂，可見膽固醇結(jié)晶沉積，明顯斑塊形成；水蛭各干預組主動脈病理改變較模型組均有不同程度減輕，可見水蛭低劑量組主動脈內(nèi)中膜增厚較輕，內(nèi)膜下少量斑塊形成，斑塊內(nèi)有少量膽固醇結(jié)晶，VSMCs排列較整齊，水蛭高劑量組可見少量斑塊及膽固醇結(jié)晶沉積，VSMCs排列較為整齊，斑塊較少，見圖4。

4討論

本實驗通過高脂飼料飼養(yǎng)及腹腔注射維生素D3建立早期AS大鼠模型，實驗末，模型組大鼠血脂指標明顯升高，HE染色觀察胸主動脈血管壁形態(tài)，可見主動脈內(nèi)膜增厚，凸向管腔的斑塊，膽固醇結(jié)晶明顯，表明建立早期AS大鼠模型成功。本實驗中，各組TG水平無明顯差異，可能與大鼠禁食12 h有關(guān)；模型組大鼠TC，LDLC較對照組明顯升高，HDLC有降低趨勢，表明中藥水蛭可降低各干預組大鼠與AS發(fā)生相關(guān)的危險因素血清TC，LDLC水平，升高HDLC水平，與前期實驗結(jié)果一致。TC，LDLC增高及HDLC的降低是AS發(fā)生的危險因素，LDLC可進入動脈壁，并刺激VSMCs增生，促使AS的發(fā)生，HDLC具有轉(zhuǎn)運脂質(zhì)的作用，是影響AS發(fā)生的保護因素；因此，以上實驗結(jié)果表明中藥水蛭可能通過調(diào)降早期AS大鼠的血脂水平，升高HDLC來影響AS進程。

VSMCs的增殖、分化受多種細胞因子和生長因子的調(diào)節(jié)影響[14]，如血小板源性生長因子（plateletderived growth factor，PDGF），TGFβ1，表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF），腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNFα）等。AS的病理過程在于高血脂等危險因素引起血管內(nèi)皮損傷誘發(fā)炎癥，脂質(zhì)沉著，VSMCs增殖參與損傷修復致內(nèi)膜增厚，泡沫細胞聚集形成斑塊[15]；TGFβ1是一種具有調(diào)節(jié)生長作用的多功能通道蛋白，有促進VSMCs增殖與分化的作用，實驗證實，VSMCs在生長因子誘導刺激下，可發(fā)生從靜止、收縮狀態(tài)轉(zhuǎn)變到增殖狀態(tài)的血管病理改變[16]。通過HE染色切片觀察模型組大鼠血管形態(tài)時可見血管內(nèi)膜增厚，斑塊形成明顯，表明VSMCs增殖明顯，同時模型組大鼠的血清TGFβ1較對照及中藥水蛭各干預組明顯升高，說明TGFβ1促進了VSMCs增殖。PCNA為細胞增殖的一種可靠標志物，在增殖活躍的細胞中表達明顯，因此PCNA含量的變化與VSMCs增殖保持一致[8]，實驗結(jié)果顯示，模型組的PCNA表達水平明顯較中藥水蛭干預組高，表明模型組的VSMCs增殖程度較2個干預組高，因此可證實HE染色觀察到的模型組胸主動脈內(nèi)膜增厚及斑塊形成明顯與VSMCs增殖有關(guān)。早期AS發(fā)生發(fā)展過程中存在VSMCs增殖的同時還伴隨著VSMCs的凋亡，研究[4]指出VSMCs增殖與凋亡的失衡是AS斑塊形成的關(guān)鍵。Caspase家族包含眾多成員（如Caspase2，Caspase3，Caspase4，Caspase8，Caspase9等），其中，Caspase3是細胞凋亡通路中的關(guān)鍵激活因子，其以酶原的形式存在于胞漿中，被Caspase9激活后能夠裂解相應的胞漿胞核底物，最終導致細胞凋亡[17]。本實驗中，中藥水蛭各干預組Caspase3表達水平較模型組增高，模型組與對照組差異不大，表明中藥水蛭各干預組VSMCs凋亡程度較模型組高；2個中藥水蛭干預組的PCNA及Caspase3表達水平差異不明顯，考慮為中藥水蛭高低劑量的干預療效差異不大，后期實驗可調(diào)整給藥量觀察。從以上結(jié)果可推測，中藥水蛭可能能夠在一定程度上降低TGFβ1的表達而抑制VSMCs增殖，增加Caspase3的表達而促進VSMCs的凋亡，進而減輕血管內(nèi)膜的增厚、減少膽固醇結(jié)晶沉積及斑塊形成，從而起到減緩早期AS進展的作用。endprint

絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導通路可參與多種細胞的增殖、分化、凋亡等過程中，MAPK包含3種基本通路，即p38，ERK（extracellular regulated kinase），JNK（cJun Nterminal kinase ）[18]；其中，p38MAPK在炎癥、應激、凋亡、細胞周期和生長的多種生理和病理過程中均發(fā)揮著重要作用[19]。MKK3/MKK6為p38MAPK信號通路公認的上游激酶[20]，通過直接磷酸化酪氨酸、絲氨酸/蘇氨酸殘基激活p38，然后作用于下游的靶基因Cmyc等[21]，通過Cmyc調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化及凋亡的過程[22]。本實驗從p38MAPK信號通路上游激酶MKK3、中間蛋白p38以及下游靶基因（原癌基因Cmyc）出發(fā)，研究p38MAPK信號通路在對早期AS大鼠VSMCs的增殖與凋亡的調(diào)控作用，以及中藥水蛭干預后相關(guān)蛋白的表達水平。研究結(jié)果顯示，模型組的p38及Cmyc蛋白表達較對照組高，MKK3表達無明顯差異，而中藥水蛭各干預組的MKK3，p38及Cmyc蛋白表達水平明顯低于模型組，同時，水蛭高劑量組MKK3及Cmyc蛋白表達水平較水蛭低劑量組輕度增高，但差異無顯著性。從以上結(jié)果可知，中藥水蛭可能能夠降低p38MAPK信號通路中上游激酶MKK3、中間蛋白p38及下游原癌基因Cmyc蛋白表達水平。同時，TGFβ1可影響p38信號通路的激活[23]，進而影響VSMCs的增殖與凋亡等。從Wu H等[24]的研究中可知，VSMCs的增殖與遷移受到抑制時，伴隨著p38蛋白表達水平的下降，表明p38蛋白表達與VSMCs增殖有關(guān)。本實驗結(jié)果表明p38信號通路蛋白的表達水平與TGFβ1及VSMCs的增殖與凋亡指標呈一致性，因此推測中藥水蛭可能通過干預p38MAPK信號通路蛋白的表達水平，調(diào)控VSMCs的增殖與凋亡來影響AS進程，從而起到抗AS的作用。

綜上所述，AS的發(fā)生同VSMCs的增殖與凋亡失衡密切相關(guān)，中藥水蛭可能能夠調(diào)降血脂，降低TGFβ1表達、增加Caspase3的表達，通過p38MAPK信號通路調(diào)控抑制VSMCs增殖、促進其凋亡，減少血管內(nèi)膜增厚、脂質(zhì)浸潤及斑塊形成，進而減緩AS的進程。然而對于中藥水蛭干預p38MAPK信號通路具體分子機制尚需進一步研究闡明。

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[責任編輯張寧寧]endprint