抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達策略

楊勇+金德俊+余維維

摘要：抗菌肽抗菌譜廣、活性穩定，具有與抗生素不同的抗菌機制，在抑殺病原微生物的同時不易產生耐藥性，在免疫調節和抗感染方面具有巨大的發展潛力，能夠發展為取代抗生素的新型藥劑，在食品、飼料、畜禽養殖等領域也具有重要的應用價值。基因工程技術是降低抗菌肽生產成本的主要方式，其中融合表達在提高抗菌肽產量方面起到了重要作用。綜述了抗菌肽在大腸桿菌中融合表達的國內外研究進展，探討了抗菌肽在大腸桿菌中融合表達的策略，并對高通量融合表達抗菌肽提出了建議。

關鍵詞：抗菌肽；大腸桿菌；基因工程；融合表達；高通量

中圖分類號：Q78 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）15-2801-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.001

Abstract： Antimicrobial peptides have a wide antimicrobial spectrum and stable activity， with different antibacterial mechanisms from antibiotics， they result in a higher efficacy against pathogens. At the same time， they're difficult to form drug resistance. Antimicrobial peptides have great development potential in immune regulation and anti-infection， so they're able to develop new agents， to replace antibiotics. Besides， they have immense applied value in food， forage， poultry breeding and so on. Genetic engineering is the main way to reduce the production costs in antimicrobial peptides， furthermore， the fusion expression plays a important role in improving production. In this paper， we summarized the research progress of antimicrobial peptides' fusion expression in E. coli， at home and abroad. Also， the fusion strategy in E. coli are discussed， and we proposed our own view on the high flux fusion expression of antimicrobial peptides.

Key words： antimicrobial peptides； Escherichia coli； genetic engineering； fusion expression； high-throughput

真菌、細菌對抗生素的耐藥性引起了全世界范圍的普遍擔憂，導致巨大的財力、物力花費在尋找新型抗生素上，但效果甚微[1]。一些抗生素對普通的感染作用效果差，引起大眾對不可治愈的恐慌[2]。現在大量的研究者從事于抗生素的耐藥性機理的研究，但是由于缺乏協調行動，進展非常緩慢[3]。目前的形勢需要開發出抗生素的替代品。

抗菌肽是動物、植物等生物體免疫系統防御外來真菌、細菌等病原微生物入侵而合成的一類小分子多肽類物質[4，5]。抗菌肽一般由10～60個氨基酸組成，其中接近一半是親水性氨基酸，帶有一定量的正電荷，能夠直接攻擊或破壞細菌、真菌的細胞膜或病毒的包膜。不同于抗生素作用于酶或DNA，抗菌肽能夠阻礙產生耐藥性，并且對熱穩定，一些抗菌肽100 ℃加熱10 min仍有活性，有較寬的pH耐受范圍[6]。加熱抗菌肽抗菌譜廣，活性穩定，并且不會對人及其所生存的環境產生危害，綠色環保。基于這些優點，激發了廣大科研人員的興趣，科研人員已經對抗菌肽的作用機制、安全性進行了深入研究，并且提供了抗菌肽在線更新數據庫（APD，http：//aps.unmc.edu/AP/）服務[6，7]。已經有2 000多種抗菌肽被分離出來[8]，其中，部分已經用于醫藥、食品及畜禽水產養殖等領域[9]。

盡管在抗菌肽的研究領域已經取得豐碩的成果，但由于生產成本居高不下，難以投入工業化生產和商業化運營。大量高純度的抗菌肽是開展基礎研究及臨床實驗的關鍵。天然來源的抗菌肽資源有限、純化困難，化學合成抗菌肽成本高、活性不穩定，因此通過基因重組來表達得到大量抗菌肽是低成本、高效益的方法[10]。

1 抗菌肽表達系統

1.1 昆蟲表達系統

廣泛使用的真核表達系統，趙昆等[11]實現牛抗菌肽Bac7-Bac5-β defense串聯基因在昆蟲桿狀病毒系統中的表達。昆蟲具有一般真核生物翻譯后修飾的功能，且表達水平高，成本低，但是翻譯后加工修飾操作繁瑣。

1.2 畢赤酵母表達系統

另一個常用的真核表達系統為畢赤酵母。同昆蟲一樣具有完備的翻譯后修飾的功能，目前已經實現了多種抗菌肽在其中的表達，如孫立人等[12]試驗斑點叉尾鮰LEAP-2抗菌肽在畢赤酵母中的表達，隨著發酵時間的延長，表達產量在上升，當發酵培養120 h后產量達到2.7 mg/L（最高值）。Farzana等[13]利用pPIC9K表達載體實現了人類抗菌肽hpcidin在畢赤酵母中的分泌表達及純化和功能驗證，并且表達量穩定在3 mg/L。畢赤酵母中存在表達水平低，發酵周期長，易污染等問題[14]。endprint

1.3 大腸桿菌表達系統

大腸桿菌遺傳圖譜清楚，易培養，周期短，對許多蛋白質都有一定的耐受能力，在較短的時間內可以高水平地表達多種蛋白，發酵條件易掌控，但是缺乏像酵母等真核系統翻譯后修飾加工功能，所表達的產物生物活性較低[15]。然而抗菌肽都是一些小肽類分子，不需要翻譯后修飾等過程，因此大腸桿菌是抗菌肽首選的表達系統。

2 抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達

抗菌肽分子小，直接表達不僅對宿主具有毒殺作用，而且極易被一些蛋白酶水解，因此難以獲得具有天然活性的抗菌肽。為了解決這個問題，目前普遍采用的是在抗菌肽的N端接入一個可以在大腸桿菌中表達的蛋白質，進行融合表達，然后通過化學試劑處理或添加酶處理除去載體蛋白，進一步分離提純，就可以獲得高產的抗菌肽[16]。

2.1 融合蛋白標簽

載體蛋白的功能是避免抗菌肽被蛋白酶降解和對宿主產生毒殺作用，現在抗菌肽在大腸桿菌的融合表達的主要載體蛋白可以分為四大類：增強可溶性的融合標簽，促進包涵體形成的融合標簽，可自我剪切的融合標簽，信號肽類的融合標簽[17]。本文綜述了一些常用的融合標簽及其表達策略。

2.1.1 增強可溶性的融合標簽

1）谷胱甘肽轉移酶（GST）融合標簽。GST可以在大腸桿菌融合表達中穩定存在，可以迅速通過固定了谷胱甘肽的色譜柱從溶菌后的混合液中分離，非變性的條件下10 mmol/L的還原型谷胱甘肽洗脫獲得GST—抗菌肽融合蛋白[18]。融合蛋白通過位點專一的蛋白酶如凝血酶或Xa-因子切除GST部分，獲得目的蛋白。歐陽萍等[19]將人溶菌酶和抗菌肽tachyplesins融合基因克隆至帶有GST標簽的原核表達載體pGEX-4T-1上，轉化大腸桿菌BL21（DE3），IPTG 誘導表達，并對表達條件進行優化，純化融合蛋白純度達90%。由于GST標簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解，提高其穩定性、可溶性，并且通過親和層析簡化后續的純化工作，所以抗菌肽同GST標簽融合表達將顯著提高其表達量、降低生產成本。但是由于GST融合標簽過大（27KD），而抗菌肽分子小，二者相比質量差距大，GST會影響抗菌肽的表達產量[20]。

2）硫氧還蛋白（thioredoxin）融合標簽。硫氧還蛋白是比GST更常用的融合表達標簽，分子量為17 KD，不僅可以避免重組蛋白被蛋白酶降解，還可以促進重組蛋白內二硫鍵的形成，加工成更高穩定的結構[21]。硫氧還蛋白沒有專門的親和介質可以用于分離提純，因此在抗菌肽融合表達時，需要與一些親和標簽進行聯合。Alem等[22]利用硫氧還蛋白融合標簽和His親和標簽在大腸桿菌系統中成功融合表達并分離得到了來自青莧中的Aq抗菌肽，表達產量為38 mg/L。Krahulec等[23]成功融合表達了Trx—LL—37融合蛋白，1 g融合蛋白/每升培養液，最終高效液相色譜檢測純化的人源抗菌肽LL37的含量為37 mg/L，功能檢測顯示對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有很好的抑菌活性。Gagliardo等[24]在融合表達鐵調素（一種肝抗菌肽）時驗證，采用硫氧還蛋白作為融合蛋白標簽時應該采用低溫誘導的方式發酵，這樣能夠協助抗菌肽的可溶性表達。

3）小分子泛素樣修飾蛋白（SUMO）融合標簽。SUMO大約由100個氨基酸組成，類似于泛素但功能完全不同，是新發展起來的一類融合表達標簽。SUMO可以用于難以表達的蛋白質的融合表達，可抗蛋白酶水解，引導目標蛋白的正確折疊，增強融合蛋白的可溶性[25]。LI等[26]成功融合表達了SUMO—CM4，NI柱親和層析獲得每升112 mg的融合蛋白，經SUMO蛋白酶處理后，可以獲得24 mg/L的CM4，功能檢測同天然CM4抗菌肽一樣具有良好的抑菌活性。由于SUMO蛋白酶用于分離提純，使得融合表達的成本升高，限制了SUMO的應用，姜媛媛等[27]設計了高效可溶性表達重組蛋白的載體，即His-SUMO和目的序列之間加入羥胺切割位點在His—SUMO中表達的融合蛋白用Ni-NTA純化，羥胺液切割后可獲得僅留一個甘氨酸殘基的重組蛋白。

2.1.2 促進包涵體形成的融合標簽 蛋白質除了使用增強可溶性的蛋白標簽實現高效表達，后通過親和純化，切除融合蛋白標簽而獲得蛋白質，也可以使目標蛋白質積聚在包涵體內進行表達。這種表達策略也應用到了抗菌肽領域，包涵體表達抗菌肽能夠保護抗菌肽被蛋白酶降解。在這一類抗菌肽融合標簽中主要有類固醇異構酶、Purf片段、PaPer3.30、TAF12組蛋白[28]。Kim等[29]利用PurF片段實現了抗菌肽histonin包涵體形式的高表達，在其表達系統內，可以獲得167 mg/L大腸桿菌發酵液。

為了獲得抗菌肽單品，需要收集包涵體，可能會破碎細胞壁，細胞內容物流出影響分離純化，需要經歷變性、復性等過程，操作繁瑣，并且收率較低，因此目前多使用可溶性表達，較少考慮包涵體形式表達。

2.1.3 可自行切割的融合標簽 內含肽是前體未成熟的蛋白質中一條多肽鏈，又稱作內含子蛋白質，可以通過內含肽的自我剪接作用使得蛋白質結構發生重排，也利用內含肽的這一作用開發出眾多的親和純化系統，較其他的親和純化標簽簡單，通過改變溫度、pH或加入如巰基乙醇類化學試劑即可體外自我剪接，獲得除去融合蛋白標簽的抗菌肽[30-32]。Coolbaugh等[33]利用幾丁質結合結構域（CBD）親和標簽和基于彈性蛋白樣多肽親和標簽（ELP）實現了β半乳糖苷酶和超折疊綠色熒光蛋白的高通量表達純化。Xie等[34]利用內含肽融合表達系統，實現了OG—2的高產量表達，是目前最好的高產量內含肽融合表達系統。

2.1.4 信號肽類的融合標簽 信號肽能夠引導蛋白質正常折疊，在分泌表達時常引入信號肽增強分泌表達，表達后，信號肽會被切除，原保留在蛋白質N端的甲硫氨酸也會切除，這樣的蛋白質不用因為具備免疫原性而需要再切除。大腸桿菌中常用的信號肽有OmpA、PelB、PhoA、HlyA、cherry等[35]。Lee等[36]用OmpA實現了扁口魚鐵調素Ⅰ的可溶性表達。這一類融合標簽目前用的很少。endprint

2.2 親和純化標簽

上述提到的GST、內含肽等融合蛋白標簽自身可以作為親和介質作用的親和標簽。另一個重要的標簽是聚組氨酸標簽。組氨酸標簽是大腸桿菌表達重組蛋白純化中最常使用的親和純化標簽，可以與裝載有Ni的親和柱子結合[37]。組氨酸標簽很小，不移除不影響蛋白質的結構，但是在一些情況有可能會影響蛋白質的溶解性及其功能[38]。張亞妮等[39]實現人工合成抗菌肽D2A21基因的克隆和表達，其中直接應用His6表達和純化抗菌肽D2A21。Yi等[40]構建His6—SUMO—A20L融合表達體系，成功表達了抗菌肽A20L，最高純化后產量為5.3 mg/L，表達的抗菌肽A20L抗多種革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌。組氨酸標簽用于抗菌肽的分離純化，簡單易行，是設計并構建抗菌肽表達系統的首要選擇。

2.3 融合蛋白標簽的切除

融合蛋白標簽的存在可能會影響目標蛋白的結構和功能，為了獲得具有正確結構和良好生物活性的目標蛋白質產物，需要采取一定的方法除去標簽，排除標簽對蛋白質的影響[41]。

目前在抗菌肽融合表達領域蛋白融合標簽的切除有3種方法，即化學法、酶法和內含肽的自我剪接等。

2.3.1 化學法 化學法是利用一些氨基酸之間的肽鍵對某些化學試劑敏感而發生斷裂從而去除融合蛋白標簽的一種方法。Pane等[42]構建來自人凝血酶C端的一段小的GKY20抗菌肽和豹蛙酶系列大腸桿菌融合表達，探索了化學法切除融合蛋白的反應條件和效率，成功構建了能夠利用稀醋酸等稀酸斷裂Asp—Cys之間的肽鍵和溴化氰斷裂與甲硫氨酸相連的肽鍵從而除去融合標簽，并且表現出高達95%的切割效率。

化學法具有成本低、效率高等優點，化學試劑作用效果好，時間短，可以縮短分離純化的周期，應用于工業化生產，但是化學試劑可能會影響抗菌肽的結構和功能，另外需要摸索適合的反應條件，如作用溫度、pH等。值得注意的是，化學法切割融合蛋白標簽會使抗菌肽上增加一個或數個氨基酸，例如切割X—Met之間的肽鍵，會使抗菌肽的N端多一個甲硫氨酸，雖然不影響抗菌肽的結構和功能，但是應用到人和動物體上會引起免疫排斥反應。

2.3.2 酶法 酶法除去融合蛋白標簽，是在融合蛋白標簽和目標蛋白之間插入酶識別和作用的位點。常使用的酶有TEV蛋白酶、Xa因子、腸激酶、凝血酶及SUMO蛋白酶等。常用的蛋白酶切割融合蛋白標簽見表1。

酶法去除融合蛋白標簽作用效果好，反應穩定，但是應用成本高，不易工業推廣，并且需要合適的酶切反應環境，易變性失活。另外，腸激酶、凝血酶等有第二識別和切割位點，容易產生非特異性切割，產生副產物，影響抗菌肽的分離純化，這種非特異性的切割是不可能完全消失的，只能通過改變反應條件，減弱非特異性識別和切割的頻率來實現。

蛋白酶法用于抗菌肽融合標簽的切除，可以從兩個方向進行改進，一是尋找特異性更強、酶切效率更高、制造成本更低的酶，二是簡化酶法切除的提純工藝，減少步驟，降低損失，例如上面提到的“His—SUMO—A20L”即是“標簽—蛋白酶識別和切割序列—抗菌肽”的純化體系，操作程序簡單。

2.3.3 內含肽的自我剪接 利用內含肽的自我切割功能和對某種介質親和的特性，可以開發“內含肽—抗菌肽”的抗菌肽融合表達親和純化系統。目前內含肽數據中共發現了450多種內含肽。其中廣泛應用于抗菌肽融合表達親和純化的有CBD（幾丁質結合結構域），還有的是基于ELP（彈性蛋白樣多肽）的內含肽介導的純化系統。

利用CBD和含有chitin（幾丁質）介質的親和柱子結合，可以提純含有CBD的融合蛋白，后加入巰基乙醇（DTT），可以使得抗菌肽和CBD連接鍵斷裂，獲得不含有任何其他片段的抗菌肽。Hong等[48]利用CBD和人源抗菌肽（MDCD—1L）融合簡單純化獲得了人源MDCD—1L。這一方法成本較低，但是介質和配基之間的結合的穩定性和特異性較低，結合的目標蛋白很容易從介質上脫落，使獲得融合蛋白含有雜蛋白。

基于彈性蛋白的內含肽介導的抗菌肽純化系統得到廣泛的應用。類彈性蛋白ELPs是一類人工合成的生物大分子，由五肽重復序列單元VPGXG（其中X是除脯氨酸以外的任意一種氨基酸，來源于哺乳動物的彈性蛋白序YfJVPGVG）組成，具有溫度誘導的反復相變特性[49]。而將與ELP融合的蛋白也有這樣的特性，因此，可構建“ELP—內含肽—抗菌肽”的純化系統，當體系處于某一溫度（反轉變溫度）時，ELP的結構會發生改變，導致聚集沉淀，與ELP相連的抗菌肽也會隨之沉淀，簡單離心就可以獲得ELP—內含肽—抗菌肽融合蛋白，再改變條件就可以使得內含肽自我剪接，抗菌肽從融合蛋白上釋放。巢亦成[50]利用“ELP—內含肽—抗菌肽”融合表達純化了抗菌肽NK—2內含肽介導的ELP純化系統，可以避免使用親和樹脂，降低了純化成本，操作簡單。

和化學法相比，內含肽的自我剪接作用溫和，不會使得抗菌肽失去生物活性，和酶法相比，內含肽的自我剪接不用除去酶或獲得純抗菌肽而反復過柱子，降低了純化的投入，操作也簡單，是大腸桿菌融合表達抗菌肽純化的很好選擇。

3 小結

融合表達是目前抗菌肽表達的最好方式，選擇合適的表達菌株、融合蛋白標簽及純化體系是高效低成本表達抗菌肽的關鍵。本文綜述了抗菌肽在大腸桿菌中融合表達及純化的策略，但是僅限于個別抗菌肽的表達純化，工業化推廣由于產量低、過程復雜、成本高而受阻。為了高通量表達抗菌肽，構建高產低成本的表達平臺仍有很多工作要做。

為了實現抗菌肽高通量表達，可以從以下方面考慮：一是應用現代分子生物學技術，減少使用或不用酶切、酶連等傳統構建表達載體的方法，結合抗菌肽基因小、可全化學合成的特點，應用無酶克隆先進操作技術，高通量構建表達載體[51]。二是應用快速的轉化檢測手段。三是應用適合的融合蛋白標簽和純化標簽，最好是使得融合蛋白表達分泌到胞外，為了工業化推廣，選擇不用酶或者尋找更高效、低成本的酶去除融合標簽的方法。endprint

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