斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ型分離株同源重復區hr5的結構功能分析

劉惠芬+衣葵花+劉文光+李智峰+李云芝

摘要：對斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ（SpltNPVⅡ）基因組DNA中的同源重復區hr5的結構功能進行研究。結果表明，SpltNPVⅡ hr5大小為389 bp，含有3個64 bp不完全回文序列，回文序列的中心均含有1個PvuⅠ限制性酶切位點，并且存在1個與病毒基因組DNA復制相關的motif（CGATT）基序。瞬時表達分析表明，hr5在野生型病毒感染和未感染的細胞中均具有增強早期基因ie1啟動子活性的功能；實時熒光定量PCR結果顯示，hr5在野生型病毒作為輔助病毒時，具有基因組DNA復制起始原點的功能。研究證明SpltNPVⅡhr5具有復制起始原點和增強子的雙功能作用。

關鍵詞：斜紋夜蛾；核型多角體病毒；同源重復區；增強子

中圖分類號：S433.4：Q78 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）08-0099-05

Abstract The structure-function of homlogous region 5 （hr5） from Spodoptera litura Nucleopolyhedrovirus Ⅱ（SpltNPVⅡ）was studied in this paper. The results showed that the length of hr5 is 389 bp consisting of three 64-bp imperfect palindromes，and each palindrome contains a PvuⅠ site in the center and one motif （CGATT）which related to the replication of genomic DNA of virus. A transent expression assay demonstrated that the expression of SpltNPVⅡ-ie1 promoter-driven luciferase gene was enhanced by hr5 in both infected and uninfected Spli221 cells. Real-time PCR confirmed that the hr5 could function as ori of viral DNA replication in infected cells with wild type virus as the helper virus.The study results indicated that SpltNPVⅡhr5 is bifunctional， having both ori and enhancer activities.

Keywords Spodoptera litura； Nucleopolyhedrovirus； Homologous region （hr）； Enhancer

斜紋夜蛾（Spodotera litura）是一種雜食性的重要農業害蟲，全國各地均有分布。該蟲廣泛危害水稻、玉米、棉花、花生、煙草等數十種糧食和經濟作物，近年來對蔬菜、花卉、草坪等的危害特別嚴重[1]。目前，在各種化學合成殺蟲劑嚴重污染環境、農作物的高毒農藥殘留問題日顯嚴重及害蟲對化學殺蟲劑的抗性日益增強的情況下，對斜紋夜蛾進行生物防治就顯得尤為重要和迫切[2]。斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ型（Spodotera litura nucleopolyhedrovirus，SpltNPVⅡ）分離株是一種繁殖率和毒力極強的病毒變異株，作為生物殺蟲劑具有很高的研究價值和良好的應用前景。

1984年，Blinov等[3]最早報道了大蠟螟核型多角體病毒（Galleria mellonella multiple nucleopolyhedrovirus，GmMNPV）的BamHⅠ-H片段帶有一個同源重復區（homologous repeat regions，hrs），即復制起始原點。之后，hrs作為基因組DNA復制起始原點（origin of replication，ori）在眾多桿狀病毒中得到證實。大量研究結果表明，hrs除作為DNA復制起始原點外，還具有較強的增強子功能[4-6]。家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）基因組中hr5不僅在宿主細胞中具有復制起始原點功能，在苜蓿尺蠖核型多角體病毒（Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）感染的非宿主Sf細胞中亦可得到復制，而且hr5在Sf細胞/AcMNPV系統中的復制功能要比在BmN細胞/BmNPV系統中高一些；另外，BmNPV hr3在Sf細胞/AcMNPV系統中的增強子功能也要高于BmN細胞/BmNPV系統[7]。Felipe等[8]的研究結果表明美國白蛾核型多角體病毒（Hyphantria cunea nucleopolyhedrovirus，HycuNPV）基因組中的hr6在5種鱗翅目昆蟲細胞（BmN-4、Ld652Y、Sf9、SpIm、TN368）和雙翅目昆蟲細胞（S2）中，均能夠分別增強HycuNPV ie1（hycu-ie1）、黃杉毒蛾核型多角體病毒（Orgyia pseudotsugata multicapsid nucleopolyhedrovirus，OpMNPV） ie2（op-ie2）和果蠅熱休克蛋白70基因（Drosophila heat shock protein，hsp70）啟動子的活性。上述研究結果表明，桿狀病毒hrs在宿主和非宿主細胞中均具有復制起始原點和增強基因啟動子轉錄活性的功能。然而，關于斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱhr5的結構目前尚無報道，其功能尚不明確。endprint

本研究以SpltNPVⅡ為研究材料，采用實時熒光定量PCR以及瞬時表達分析等方法，對SpltNPVⅡ同源重復區hr5在宿主細胞Spli221中的復制起始原點和/或增強子功能進行研究，以期加深和豐富對桿狀病毒增殖機制的認識，同時，為研制高效、寬宿主域殺蟲病毒提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SpltNPV Ⅱ原始細胞純化毒株（BV）由日本岐阜縣生物產業技術研究所Kamiya K博士饋贈，本實驗室保存。斜紋夜蛾TUAT-Spli221細胞由日本名古屋大學資源昆蟲研究室Kobayashi M教授提供，本實驗室保存。

pUC-19質粒載體、pGL3-Basic質粒載體、受體菌E. coli TOP10由本實驗室保存。各種限制性內切酶、配套buffer，T4 DNA連接酶及buffer，dNTPs和熒光素酶報告基因分析試劑盒均購自Promega公司。Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker購自北京全式金生物技術有限公司。寡核苷酸引物的合成和DNA測序由北京三博遠志生物技術有限責任公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 SpltNPVⅡ純化 在斜紋夜蛾幼蟲4齡初期注射感染細胞純化毒株（BV），讓病毒在蟲體內繁殖擴增。待蟲體發病后收集感染病蟲的尸體進行研磨，用蒸餾水反復清洗，利用差速離心的方法純化多角體病毒。

1.2.2 SpltNPVⅡ基因組DNA的提取 按照文獻[9]提取SpltNPV Ⅱ基因組DNA。

1.2.3 SpltNPVⅡ基因組DNA hr5的序列分析 利用ClustalW、DNAMAN、Lasergene 7.1和MEGA 4等生物軟件對SpltNPVⅡ hr5序列進行分析。

1.2.4 SpltNPVⅡ基因組DNA hr5功能質粒的構建 設計特異性引物（見表1），以SpltNPVⅡ基因組DNA為模板，擴增ie1基因上游510 bp的啟動子區，克隆至載體pUC-19中，測序正確后亞克隆至載體pGL3-Basic中得到質粒pSp-ie1P/luc+。擴增SpltNPVⅡ hr5序列，連接pEASY-T3載體，測序正確后亞克隆至載體pUC-19中，用于hr5復制起始原點功能的檢測。并將其亞克隆到pSp-ie1P/luc+質粒中ie1基因啟動子的下游，得到質粒pSp-ie1P-hr5/luc+（圖1），用于檢測hr5是否有增強ie1基因強啟動子的活性。

1.2.5 瞬時表達分析 將構建的重組功能質粒DNA分別轉染野生型病毒SpltNPVⅡ感染和未感染的Spli221細胞，培養48 h，用細胞刮將貼壁細胞刮下，5 000 r/min離心5 min，收集細胞。加入適量磷酸緩沖液PBS，重懸細胞后，5 000 r/min離心5 min，棄上清，如此反復清洗細胞2～3次。加入細胞裂解液將細胞重懸，裂解5～10 min，使之充分裂解。在每個樣品管中裝入100 μL的熒光素酶反應底物（luciferase assay reagent），加入20 μL細胞裂解混合液，振蕩混勻。將樣品放入熒光儀，按照設定程序開始測量讀數[10]。設置三組重復試驗。以只含ie1基因強啟動子的pSp-ie1P/luc+質粒作對照。

1.2.6 實時熒光定量PCR 將構建的重組功能質粒DNA轉染感染野生型輔助病毒SpltNPVⅡ的Spli221細胞。48 h后收集細胞，提取細胞總DNA，經DpnⅠ酶切后，進行實時熒光定量PCR，并制作標準曲線，計算出每微克DNA扣除對照質粒（pUC-19）拷貝數后所含目的重組質粒的拷貝數。實時熒光定量PCR方法詳見文獻[11]。

2 結果與分析

2.1 SpltNPVⅡ同源重復區hr5序列分析

用DotPlot軟件分析表明斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ型基因組DNA包含有7個同源重復區（hrs）。其中SpltNPVⅡhr5最小，為389 bp，位于基因組78 945～79 333 bp、ORF79～ORF80之間。hr5含3個64 bp不完全回文序列：TTTTAGTACATGATCTTTGCTTTCATCGAGACCTGTGGATGAAATCCAACATCAAGTATGAAAA（圖2），其序列的核苷酸一致性高達90%以上，回文序列的中心均含有1個PvuⅠ限制性酶切位點，并且存在1個與病毒基因組DNA復制相關的motif（CGATT）基序（圖3）。

2.2 功能質粒的酶切鑒定

為了檢測SpltNPVⅡhr5是否具有復制起始原點以及激活并增強ie1基因強啟動子活性的功能，以SpltNPVⅡDNA為模板，PCR擴增ie1基因啟動子和hr5序列，擴增片段大小分別為550 bp和 450 bp，將其分別克隆至載體pUC-19和pGL3-Basic中，獲得重組質粒pUC19-ie1P和pSp-ie1P-hr5/luc+，經酶切鑒定，電泳條帶與預期大小一致（圖4）。

2.3 SpltNPVⅡ同源重復區hr5增強子功能分析

采用構建的功能質粒（pSp-ie1P-hr5/luc+）轉染Spli221細胞，進行病毒感染和未感染兩組瞬時表達分析試驗，質粒轉染細胞48 h后測定細胞裂解液的熒光素酶活性。檢測結果表明，含有hr5的功能質粒在野生型病毒感染和未感染的細胞裂解液的光量子數分別為：1.2×105±3.7×104 CPM和7.6×104±8.1×103 CPM，均是對照質粒pSp-ie1P/luc+轉染細胞的3倍多（表2）。結果顯示hr5在野生病毒感染和未感染的細胞中均具有增強早期基因ie1強啟動子活性的功能。

2.4 SpltNPVⅡ同源重復區hr5復制功能分析

一般大腸桿菌菌株均是dam+，從這些菌株中制備的質粒DNA序列G*ATC中的A是完全甲基化的，而在真核細胞中復制的DNA序列G*ATC中的A則是不完全甲基化的。而DpnⅠ酶切位點G*ATC中的A必須是完全甲基化的。因此，可利用DpnⅠ酶的這種特性來區別是轉染細胞質粒中的DNA，還是真核細胞中復制出來的DNA片段。利用DpnⅠ內切酶的這個特性來檢測SpltNPVⅡ的同源重復區hr5在Spli221細胞中復制的功能，經實時熒光定量PCR檢測，結果表明SpltNPVⅡhr5的復制效率（拷貝數）為1.52×105 copies/μg DNA，對照質粒pUC-19的復制效率（拷貝數）僅為1 730±70 copies/μg DNA，初步證明hr5在野生型病毒SpltNPVⅡ作為輔助病毒時，具有基因組DNA復制起始原點功能。endprint

3 討論與結論

本研究對斜紋夜蛾核型多角體病毒Ⅱ型分離株基因組DNA中的同源重復區hr5序列分析表明，hr5含有3個64 bp不完全回文基序，在回文序列的中心均含有一個PvuⅠ限制性酶切位點。這一特性與AcMNPV的hrs類似，AcMNPV基因組含有9個hrs，每個hr含有5個至8個以EcoRⅠ位點為核心的30 bp不完全回文序列[12]。Pearson等[13]率先證實AcMNPV的hr5是DNA復制起始原點，之后Leisy等[14]發現AcMNPV hr1a回文序列中心的四個核苷酸序列是hr作為復制起始原點必需的結構。同時，桿狀病毒的hr序列被證實具有增強子效應，無論方向和位置對極早期和晚早期基因的啟動子轉錄均有很強的促進作用[15，16]。本研究利用瞬時表達分析和實時熒光定量PCR等方法，證實了SpltNPVⅡhr5具有復制起始原點和增強子的雙功能作用。

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