普通小麥春化作用研究進展

馮岳+褚蔚+樊慶琦+黃承彥+隋新霞+崔德周+楚秀生

摘要：春化是小麥品種的重要性狀，直接影響著小麥品種的種植范圍和利用效率。本文從小麥冬春性鑒定方法、鑒定指標、春化相關基因及分子機理等方面入手，綜述了小麥冬春性的研究進展。分析比較了目前常用小麥冬春性鑒定方法并總結了依靠自然低溫春化鑒定的利弊。對目前小麥春化相關基因的研究進行了總結，分析了小麥冬春性分子機理研究中存在的關鍵問題，提出了小麥冬春性下一步研究的重點。

關鍵詞：普通小麥；春化鑒定；春化基因

中圖分類號：S512.101 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2017）08-0160-08

Abstract Vernalization is one of the important characteristics of common wheat which affects the planting area and utilization efficiency. The research progress of vernalization in common wheat was reviewed from aspects of identification methods and identification indexes of wheat springness and winterness， vernalization genes， molecular mechanism， etc. The common identification methods of wheat springness and winterness were compared， and the pros and cons of natural temperature dependent identification methods were discussed. The researches of vernalization related genes in wheat were summarized. The problems existed in the current molecular mechanism studies of wheat springness and winterness was analyzed， and the future research aspects was preliminarily discussed.

Keywords Common wheat ；Vernalization identification ；Vernalization gene

小麥春化現象是指小麥必須經歷一段時間的持續低溫才能由營養生長階段轉入生殖階段生長的現象。冬春性不同的小麥品種，其抗寒性、生育期、豐產性等往往存在較大差異，因此春化作用一直是小麥育種與生理研究領域的重要課題，對其研究不但能夠揭示春化發育的生理機制和分子機理，補充完善春化作用的理論，更重要的是可為培育抗寒、廣適、高產的小麥品種提供理論依據。本文就小麥冬春性的鑒定方法、生理指標、生理生化及分子機制方面的研究成果進行綜述，旨在為今后小麥冬春性研究提供參考。

1 冬春性的定義及分類

“春化”一詞最早是由前蘇聯學者李森科（Lysenko）提出[1]，是指小麥在人為冷處理狀態下獲得的加速抽穗開花的現象。冬小麥品種在其營養生長期需要經歷一定時間的低溫階段（如冬季），獲得足夠的累積低溫，才能正常抽穗開花結實，目前一般將這種低溫積累過程對小麥正常抽穗開花的作用稱之為春化作用。根據春化特點，習慣上將小麥品種劃分為三種類型：冬性、半冬性和春性。不同冬春性品種對低溫持續時間和溫度需求不同：冬性品種在0～7℃下30 d以上即可通過春化，冬性特別強的品種則要40 d以上；半冬性品種通過春化需要在3～15℃持續20～30 d；春性品種原則上不需要春化即可正常抽穗開花[2]。未通過春化的品種，植株維持在營養生長階段，或營養生長轉為生殖生長的時間大大延遲，表現為無效分蘗增多、抽穗期延遲或抽穗不完全、熟期推遲等。盡管如此，只要給予足夠長的時間，即使未進行春化處理，也能最終抽穗。

2 小麥冬春性的鑒定方法

2.1 國外小麥冬春性鑒定方法

關于小麥冬春性劃分的標準，國內外略有差異。國外研究者通常利用溫室的方法判定冬春性。即在溫室條件下播種，溫度保持在15℃以上，光照長度一般在16～20 h或更長（滿足光周期需求），以達到一定時間臨界點時材料是否抽穗或旗葉出現時間或最終葉片數等指標作為判定的標準[3-7]。例如，Beales等[7]在20℃和每天光照16 h條件下，以60 d和107 d作為時間臨界點，60 d以前抽穗的品種劃分為春性品種，107 d以后抽穗的品種劃分為冬性品種，但他的研究在60 d和107 d之間未發現抽穗品種。

2.2 國內小麥冬春性鑒定方法

2.2.1 常規田間鑒定法 常規田間鑒定首先是對小麥幼苗習性的觀察，一般認為，冬性小麥幼苗習性為半匍匐，春性小麥多為直立。其次，從起身、拔節、抽穗和開花時間來看，春性小麥往往較冬性小麥早[8]。另外，通過觀測小麥在北方春播、秋播和在南方冬播的抽穗情況，對照標準品種，也可以把小麥冬春性進行分類，即：在北方春播和南方冬播不能抽穗為冬性；在北方春播和南方冬播部分植株抽穗，且不整齊為半冬性；在北方春播和南方冬播能正常抽穗成熟為春性[9]。但常規田間鑒定法缺乏詳細的鑒定標準，準確性差且工作量大。

2.2.2 綜合順序分類法 針對常規田間鑒定法中存在的不足，張燦軍[10]通過多年試驗總結，提出綜合順序分類法進行小麥冬春性鑒定，即在平均氣溫達到3℃、7℃和10℃時進行錯期播種，通過調查播種期、出苗期、幼苗習性、基本苗數、最高總莖數、始穗期、抽穗期、抽穗數、成熟期等數據，確定小麥冬春性。分級標準為：春季平均氣溫7℃時播種，抽穗率>30%且能正常成熟為春性，抽穗率≤30%且不能正常成熟為冬性；春季平均氣溫3℃條件下播種，以抽穗率0、5%和20%劃分強冬性、冬性、弱冬性和半冬性；春季平均氣溫10℃條件下播種，以抽穗率30%和60%劃分弱春性、春性和強春性。綜合順序分類法是目前國內應用較為廣泛的小麥冬春性鑒定方法，已作為國家標準發布。但綜合順序分類法的不足之處在于：低溫春化過程依賴自然氣候條件，但不同地區、不同年份之間溫度變化、氣溫回升速度和溫度波動存在較大差異，分期播種的適宜播種時間很難掌握；依靠往年氣候經驗來確定播種時間，難以對不同春化習性品種所需的溫度臨界點和春化積溫進行準確劃分；且鑒定過程易受到極端氣候等自然因素的干擾。因此綜合順序分類法需要進行多年多地的試驗才能得到更加準確的鑒定結果。endprint

3 春化基因

截至目前的研究，已知4個基因與小麥春化反應有關，分別被命名為Vrn-1、Vrn-2、Vrn-3和Vrn-4。Vrn-1位于小麥的A、B和D染色體組的第5染色體長臂上，分別命名為Vrn-A1、Vrn-B1和Vrn-D1[11-26]；Vrn-2位于5A染色體上[26]；Vrn-3位于7BS染色體長臂上，其候選基因命名為TaFT1[19]；Vrn-4被定位于六倍體小麥5D染色體靠近著絲粒的位置[27]。

3.1 Vrn-1基因

Vrn-1基因編碼API基因家族的MADS-box轉錄因子，該轉錄因子與擬南芥中的分生組織特性基因APETALA1、CAULI-FLOWER和FRUITFULL有高度相似性，調控分生組織由營養生長向生殖生長的轉變[6，20，22，29]。Vrn-1基因分為顯性和隱性兩種類型，顯性基因對應春性，隱性基因對應冬性。與隱性等位基因相比，Vrn-1顯性等位基因的啟動子區出現了插入或缺失序列。顯性基因是可被抑制的，一些轉錄因子可結合于該基因啟動子的CArG-box區域[30]，或者結合在第1內含子長436 bp堿基的“春化決定區域”[31]。隱性基因是不能被抑制的，因為該基因的CArG區域和“春化決定區域”均被刪除，轉錄因子無法與其結合。Loukoianov等[30]利用近等基因系TDD、TDB、TDE和TDC對六倍體小麥不同基因組間Vrn-1的基因效應做了研究，結果顯示Vrn-A1的春化作用最強，且對Vrn-B1和Vrn-D1有上位性效應，而Vrn-B1和Vrn-D1對春化效應的敏感性較弱，且Vrn-B1對小麥開花的促進作用強于Vrn-D1[32]。

在普通小麥中，Vrn-A1位點目前已發現多種顯性基因等位變異類型。顯性等位基因Vrn-A1啟動子區插入131與43或222 bp堿基等位變異類型，定名為Vrn-A1a顯性類型；Maquis等品種的啟動子區缺失20 bp堿基，該等位變異類型定名為Vrn-A1b；六倍體阿富汗地方品種IL369 在啟動子區不存在插入或缺失突變，與隱性等位基因vrn-A1序列相同，該顯性等位變異類型定名為顯性Vrn-A1c。在3個T. turgidum ssp. dicoccoides材料中，啟動子序列區缺失32 bp堿基，確定為顯性Vrn-A1d類型；在Triticum turgidum ssp. dicoccum材料ST27存在54 bp堿基，確定為顯性Vrn-A1e等位變異類型。在Vrn-A1基因啟動子區，含顯性等位基因的四倍體品種Langdon和六倍體地方品種IL369與隱性等位基因序列相同，沒有差異[33]。

Vrn-B1基因也發現有3種顯性等位變異類型：Vrn-B1a、Vrn-B1b和Vrn-B1c[34]。與隱性等位基因vrn-B相比，顯性等位基因VRN-B1a在第一內含子中缺失一段6 850 bp的片段；VRN-B1b除了在第一內含子中缺失6 850 bp的片段外，還有一段36 bp的小片段缺失和一個單核苷酸的突變[34]；Vrn-B1c在第1內含子區域除7 228 bp堿基的缺失外，還有267 bp堿基的重復[35]。

Vrn-D1位點截至目前共發現了2個顯性等位變異，分別為VRN-D1a和VRN-D1b。VRN-D1a在隱性等位基因vrn-D1的第一內含子中發生了4 235 bp的缺失[26]，而VRN-D1b在VRN-D1a的基礎上，還在翻譯起始位點ATG的上游161 bp處出現了單核苷酸的突變，由胞嘧啶C突變為腺嘌呤A[26，36]。當VRN-A1和VRN-B1位點的等位基因都為隱性時，純合vrn-D1的小麥表現為冬性，純合VRN-D1b的植株表現為半冬性，而純合VRN-D1a表現為春性。Zhang等[36]通過對VRN-D1a和VRN-D1b的F2群體研究發現，純合體VRN-D1a的抽穗期較純合體VRN-D1b早32天，且植株個體葉片數多。這表明VRN-D1b需要較強的春化作用。類似于VRN-D1這種三種等位變異導致三種漸變的春化類型的現象并未在VRN-A1和VRN-B1中發現。Kiss等[37]在研究VRN1基因在世界小麥分布時發現，美洲小麥主要含有 Vrn-A1 和 Vrn-B1；而亞洲小麥以含有顯性 Vrn-D1 為主要特點。Kamran等[38]建議在育種中通過將VRN-D1引入春小麥中來縮短生育期、提高產量。

肖軍等[39]對低溫信號傳遞的研究發現，凝集素蛋白VER2可以通過與Vrn1抑制蛋白TaGRP2結合從而降低TaGRP2蛋白對Vrn1的抑制作用，促進Vrn1基因表達上調進而影響春化作用。另外，冬性品種雖然Vrn1基因均為隱性，但春化時間的長短也存在差異，可能是由于顯性Vrn1基因對于隱性Vrn1基因并非完全顯性[40]，也可能是隱性Vrn1基因存在等位變異[41]。

3.2 VRN2基因

VRN2為開花抑制基因，其表達水平受低溫春化和光照影響。在四倍體小麥中，Vrn-B2具備功能，而Vrn-A2不具備功能。大麥中，該位點有3個緊密連鎖的基因組成，分別命名為ZCCT-Ha、ZCCT-Hb和ZCCT-Hc；一粒小麥中有2個緊密連鎖的基因組成，分別命名為ZCCT-1和ZCCT-2，兩個基因有76%的序列一致性，均包含一個鋅指結構域和CCT功能域。所有這些基因均編碼ZCCT轉錄因子。這些轉錄因子都有2個非常重要的結構域：一是C2H2（2個半胱氨酸和2個組氨酸）結構域，由第1外顯子編碼，既可以與DNA結合，也可以與蛋白質結合；二是CCT結構域，CCT是由43個氨基酸組成的相當保守的結構域，由第2外顯子編碼，既可以控制轉錄因子在細胞核內的位置，也可以與CCAAT-box綁定因子結合[40]。Yan等[25]在冬性小麥P12722561和春性小麥DV92上的研究發現，兩品種ZCCT1啟動子區域沒有差異，但在ZCCT1編碼區有差異，春性品種在CCT區域35位點由精氨酸變為色氨酸，在其它70多個品種上進一步分析發現，所有35位點發生R/W突變的或者ZCCT1/ZCCT2有缺失的均表現為春性；反之則表現為冬性。所有冬性二倍體小麥中至少會含有一個有功能的ZCCT1基因；含有雜合VRN2基因的二倍體小麥只要有一個ZCCT1基因就足以使小麥表現為冬性；只有純合的隱性vrn2基因才能使小麥表現為春性。若缺失VRN2基因，但在長日照條件下即使沒有經歷春化也可以促進花序的形成和發育。Vrn-2位點基因也存在顯隱性之分，顯性基因是具備功能，對應冬性；隱性基因則喪失了功能，對應春性。該隱性基因存在2個等位變異（vrn-2a和vrn-2b）。vrn-2a由點突變導致了功能的喪失，vrn-2b則是該基因完全被刪除[25]。Vrn-2位點是目前已知的春化基因位點中，唯一一個抑制開花的基因。Dubcovsky等[21]研究表明，VRN2基因的表達量受日照長短的影響，短日照條件下，VRN2基因的表達受抑制。endprint

3.3 VRN3基因

Yan等[19]研究發現小麥Vrn-3基因與擬南芥FT基因（FLOWER LOCUS T基因，為調控開花的下游基因，編碼20 kD的球狀蛋白即開花素蛋白[41，42]）序列高度相似，因此小麥的Vrn-3基因也被叫做WFT[43]。VRN3基因受春化和長日照的調節進而對促進小麥開花起重要調控作用[44]。在VRN-B3位點有一個顯性等位變異，該變異與小麥的春性生長習性相關。Chen等[45]在顯性VRN-B3位點發現了2個新的等位變異，VRN-B3b和VRN-B3c。其中VRN-B3b在5′UTR處插入了890 bp片段，VRN-B3c除在5′UTR處插入5 300 bp片段外，還發生了2個小片段缺失。Bonnin等[46]在六倍體小麥A、D基因組上定位到與FT同源的基因VRN-A3和VRN-D3，但其作用機制未見報道。Yan等[19]發現，在VRN3起始密碼子上游591 bp處插入5 295 bp的重復序列，會使得改造型中國春（CSHope 7B）比普通中國春（CS）提前開花，但在其它小麥品種中未發現該插入片段。Bonnin等[46]對不同地理起源的239種小麥品系A、D組上的VRN3基因進行了核苷酸多態性研究，表明VRN3的核苷酸多態性與植物開花的起始時間差異有關。另有研究表明，在小麥中Vrn-3蛋白與轉錄因子FDL2互作，FDL2可以通過與Vrn-1基因的啟動子結合從而促進Vrn-1基因的表達進而促進植株開花[47]，而且，該顯性基因可以在短日照條件加速開花進程[19]。

3.4 VRN4基因

Yoshida等[51]在小麥中發現了Vrn4基因，該基因位于小麥5D染色體的著絲粒位置，定位的區間長度為0.09 cM，顯性的VRN4對小麥開花有促進作用[27]。比較研究發現，VRN-D4與VRN-B1和VRN-D1作用相似[49，50]；但當春化時間較短時，攜帶VRN-B1和VRN-D1開花時間會提前5～10 d，而純合VRN-D4的植株則不會提前開花[51]。Kippes等[48]研究認為，VRN-D4可能位于VRN1、VRN2和VRN3組成的反饋調節環的上游，也可能是反饋調節環的組成部分。

4 春化基因間的互作

基于目前對3個位點基因（Vrn1、Vrn2和Vrn3）的研究，Pidal等[52]認為它們之間的相互作用形成了一個反饋調節環。春化之前，Vrn1和Vrn3基因的表達受Vrn2基因的抑制[27]。在春化過程中，Vrn1基因的表達活性上調，同時伴隨Vrn2基因的表達活性下調，這時，Vrn1基因又可以抑制Vrn2基因的表達。隨著春化過程中低溫的持續積累，Vrn2基因對其它2個基因的抑制徹底消除，Vrn3基因的表達加速Vrn1基因的表達至誘導開花需求的臨界點[40，54]。隱性的vrn2基因可以消除VRN1和VRN3等位基因差異對小麥開花時間的影響[53，55]，同樣，當VRN1和VRN3基因為顯性時，VRN2等位基因差異對開花時間的影響也會降低或消除[45]。Distelfeld等[55]認為，VRN3基因整合光周期和春化途徑及其它環境因子對開花的調控，在秋天長日照條件下種子發芽后VRN3基因受到高水平表達VRN2基因的抑制而不表達，從而阻止了VRN3基因對VRN1基因的誘導，VRN1基因表達量不足，植株不能進入生殖生長；冬天來臨后低溫春化過程使得VRN1基因表達水平逐漸提高進而抑制VRN2基因的表達，VRN2基因表達受抑制后解除了其對VRN3基因的抑制作用，次年春天被解除抑制作用的VRN3基因在長日照條件的誘導下表達量提高從而進一步促進VRN1基因的表達，超過植株開花所需要的臨界值后誘導開花。3個春化基因位點都存在許多的等位變異類型，這些基因的不同組合，可能導致了冬性與春性品種之間的多種低溫需求差異。另外，張曉科[31]利用已開發的Vrn1和Vrn3春化基因的分子標記對我國小麥種質進行分子標記檢測，發現個別材料分子檢測結果與田間表型并不完全一致。究其原因，一是可能還存在未發現的影響春化的其它基因以及某些基因的作用機制尚不清楚（如：Vrn4）；二是光周期基因的表達也同樣影響小麥的開花過程，并且Vrn2和Vrn3位點基因同時也受光照長度的調節（Vrn2受短日照調節，Vrn3受長日照調節）。

近年來的研究結果表明，植物中存在一個復雜基因網絡，對春化作用的時期、強度和效果起著精細調控作用[56，57]。對擬南芥不同生態型和突變體的研究表明，基因FLOWERINGLOCUSC（FLC）可能是春化反應的關鍵基因，FLC基因對植物開花有抑制作用[62，63]。FLC編碼的MADS-box轉錄因子含有7個外顯子和6個內含子，通過抑制FT（FLOWERING LOCUS T）和SOC1（SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO1）的表達實現對植物開花時間的控制[60-63]。表觀遺傳學的研究表明，春化的低溫作用可以引起相關基因的去甲基化[64]，進而消除FLC對開花的抑制，解除赤霉素合成途徑的封鎖而促進植物開花，在冬小麥中亦可很大程度上代替春化而引起植物開花，vrn1突變體使用赤霉素處理后并未對開花產生影響[59]。同樣，非編碼RNA也會參與FLC在春化中的表觀遺傳學抑制，包括FLC的反向轉錄本、內含子上的非編碼RNA以及反向轉錄本啟動子區域的短RNA[65-67]。例如在擬南芥中，非編碼RNA COOLAIR（cold induced long antisense intragenic RNA）作為FLC基因的反向轉錄本，通過與FLC的mRNA片段反向互補干擾FLC基因的作用；由FLC基因第一內含子轉錄的非編碼RNA COLDAIR（cold assisted intronic noncoding RNA）也同樣對FLC基因起抑制作用[65，67]。

5 春化作用、抗寒性之間的關系endprint

小麥的抗寒性與冬春性是兩個有所關聯但無必然聯系的生物學性狀[9]。小麥抗寒性是典型的數量性狀，目前研究表明，小麥中有15條染色體與抗寒性相關，其中位于第5條同源染色體長臂上的FR1被認為是抗寒的關鍵基因[68，69]，而FR1與VRN1在5號染色體上的位置重疊，因此VRN1基因和FR1基因是緊密連鎖[70，71]還是一因多效[70，72]，意見仍不一致。Limin等[73]利用近等基因系的研究結果顯示，含VRN1的春性材料比vrn1的冬性材料抗寒性低11℃。Koemel等[74]研究表明，VRN1基因的表達水平與小麥的抗寒性呈負相關。Dhillon等[72]對突變體材料的研究認為VRN-1的突變可以造成抗寒性的差異。孫果忠等[28]研究認為，攜帶隱性vrn1基因的位點越多，品種抗寒性越強。游光霞等[75]研究認為，地理來源相同時，品種的耐寒性一般隨著VRN-1等位基因控制的春化效應的增強而減弱；當VRN-1等位基因組成相同時，品種的耐寒性一般隨著地理來源的緯度降低而減弱。總之，冬春性與耐寒性之間在分子遺傳調控方面的相互作用機制尚需深入探討。

6 展望

截至目前，雖然對小麥春化機制進行了大量研究，但一些問題仍然懸而未決，例如春化基因明確而詳細的調控機理還有待進一步研究；冬性的強弱受哪些基因調控還未準確界定；VRN-4基因在春化中的作用及其與其它春化基因之間的關系還缺乏深入研究等。在蛋白質組學和RNA方面對春化的研究鮮有報道，隨著測序技術的發展，今后當從蛋白質和RNA方面入手進一步對春化機理進行研究。春化是小麥尤其是冬小麥開花誘導的必要條件，闡明春化作用機制對成花的調控有重要意義，對小麥引種育種有重要而深遠的意義。

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