動物水平的綠原酸通過Notch1信號通路調控非小細胞肺癌凋亡及機制研究

李維 劉旭 張國倩 張琳琳

肺癌是嚴重危害人類健康的惡性腫瘤之一,無論其發病率還是死亡率均居惡性腫瘤之首,已經成為嚴重危害人類生命健康的常見疾病.非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)是肺癌的一種,其患者數量為肺癌患者總數的80%以上[1].目前NSCLC的治療措施主要有手術、放療、化療及生物治療等,早期手術可以治愈NSCLC,但大部分NSCLC患者確診時已屬晚期,目前尚無治愈的根本療法.研究[2]表明,血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)及Notch信號通路,對腫瘤的形成和發展具有重要作用.Notch信號通路高度保守,由Notch受體、Notch配體、CSL DNA結合蛋白(CBF-1, suppressor of hairless, Lag)、其他的效應物和Notch的調節分子等組成.當相鄰細胞的Notch受體、配體相互接觸時,γ-分泌酶催化裂解形成Notch胞內段,之后Notch胞內段進入細胞核內結合并激活轉錄因子RBP-Jk,調控轉錄因子超級組成員Hes和Hey分子的轉錄,從而調節細胞的分化、發育、增殖、凋亡等過程.Notch通路還與其他信號通路存在交叉調控,從而擴大其生物調節作用[3].目前已有不少研究Notch通路與肺癌的關系[4,5],可是尚未形成一個明確的結論,而Notch通路生物學作用下的具體的機制更是十分缺乏,仍然有待進一步研究.

近幾年來,中藥活性成分的抑癌作用得到了廣泛關注,在誘導細胞凋亡方面的作用具有重要意義.綠原酸(chlorogenic acid, CGA)由奎尼酸(quinic acid, QA)與反式肉桂酸(trans cinnamic acidst-CA)縮合而成的酯類化合物家族,是多種中草藥中的一種活性成分,具有抗炎作用、抗病毒作用、降血脂和血糖作用、抗氧化作用、增強機體免疫力等諸多生物學活性.已有研究[6]證明,綠原酸具有抑制肺癌細胞增值和轉移,誘導肺癌細胞凋亡的作用.本研究建立了NSCLC細胞裸鼠模型,通過檢測Notch信號通路及相互作用信號通路的關鍵蛋白的表達,進一步闡明綠原酸通過Notch1信號通路調控NSCLC凋亡的作用機制.

1 材料和方法

1.1 藥品和試劑 綠原酸(250 mg, >98%)購自Sigma-Aldrich公司(溶解于1640培養基,0.22 μm濾膜過濾),胎牛血清購自上海滬峰化工有限公司,RPMI-1640培養液購自上海博麥德生物技術有限公司,胰蛋白酶購自GIBCO公司,Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所,TRizol購自北京百奧森泰生物科技有限公司,總蛋白提取試劑盒購自Sigma-Aldrich公司,BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海美吉生物醫藥科技有限公司,反轉錄試劑盒、SYBR Green Mix、DNA Marker購自北京全式金生物科技有限公司,PTEN抗體(兔抗)、p-PTEN抗體(p-Ser370,兔抗)、p-Akt(p-Ser473,兔抗)抗體購自Santa Cruz公司,Notch1抗體(兔抗)、GAPDH抗體(兔抗)、HRP-二抗(羊抗兔)等相關抗體購自Exapha Biologicals公司,其他試劑購自北京鼎國昌盛生物試劑公司.引物由上海英駿生物技術公司合成.

1.2 主要設備 多功能酶標儀(Wallac公司);TS-100倒置相差顯微鏡購自日本 Nikon公司;Real-time PCR儀購自BIO-RAD公司,二氧化碳培養箱(RCO3000TVBA)購自美國 REVCO公司.

1.3 實驗動物 實驗用裸鼠BALB/c-nu由北京華阜康生物科技有限公司提供許可證號:[SCXK(京)2014-0004],均為4周齡的健康SPF級雄性小鼠,體重為(18.77±1.02)g,裸鼠在無特定病原體條件下的層流架內飼養,無菌操作下定期更換籠具、墊料、飲用水和標準飼料.

1.4 細胞培養 NSCLC細胞株A549購自中國醫學科學院中國協和醫科大學細胞庫,細胞培養液為含10%胎牛血清RPMI-1640,其中含終濃度為100 μg/mL青霉素和鏈霉素,2 mmol/L的L-谷氨酰胺;將細胞置于37oC、5% CO2孵箱中培養;2 d傳代一次,取對數生長期細胞用于實驗.

1.5 MTT法檢測細胞增殖抑制率 將對數生長期A549細胞接種于96孔板中,每孔接種1X105個細胞;培養24 h之后,在培養基加入梯度濃度的綠原酸(終濃度為:0、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL),每個濃度設6個平行孔,綠原酸終濃度為0 μg/mL的為對照組;分別在藥物處理A549細胞24 h、48 h、72 h后,每孔加入20 μL的5 mg/mL的MTT試劑,置于細胞培養箱中孵育4 h后吸出,加入150 μL的DMSO試劑,充分震蕩后,用多功能酶標儀在490 nm波長下測定吸光度.計算細胞增殖抑制率.抑制率(%)=(1-藥物處理組OD值/對照組OD值)X100%.

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡檢測和細胞周期分析 將對數生長期A549細胞接種于6孔板,調節細胞密度,2 mL/孔,每孔細胞數目大約為4X105個.24 h后加入系列濃度梯度的綠原酸培養基,使綠原酸的終濃度為:0、10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL;常規培養72 h后收集細胞,用195 μL的Bind Buffier重懸細胞,加入5 μL Annexin V-FITC混勻,室溫避光孵育10 min.離心去上清后,用190 μL的Bind Buffier重懸細胞,再加入10 μL碘化丙啶(100 mg/L),并與避光放置,隨即進行流式細胞儀檢測細胞凋亡情況,并用軟件進行數據分析.另一組細胞采用梯度綠原酸處理細胞72 h后收集細胞,PBS清洗后用預冷的95%乙醇處理,離心去上清后,碘化丙啶(100 mg/L)(含RNase 1 g/L)0.5 mL,室溫避光孵育30 min,隨即進行流式細胞儀進行細胞周期分析.

1.7 建立裸鼠成瘤模型 大量培養A549肺癌細胞,將生長狀態良好的細胞消化后計數,將2X106的腫瘤細胞種植于裸鼠皮下,共接種30只裸鼠,飼養觀察裸鼠成瘤情況.在接種2周-3周后,腫瘤大小約1 cm3時,選擇腫瘤大小接近的20只小鼠,根據隨機分層法分組,分為2組.實驗組每天在腫瘤區域注射綠原酸溶液(100 μg/mL);對照組每天注射相同體積的生理鹽水;每次注射體積為100 μL.連續觀察并測量腫瘤的生長情況:每周測腫瘤長徑(L),短徑(W).腫瘤大小按公式V=1/2LW2計算.

給藥4周后處死裸鼠取瘤稱重,檢查肝臟肺部腫瘤的轉移情況.每個腫瘤取兩部分,一部分用于提取瘤組織蛋白,另一部分提取組織RNA.

1.8 實時熒光定量PCR(Real-time PCR)檢測mRNA相對含量 取100 mg左右腫瘤組織,加入1 mL TRIzol,用研缽研磨至無明顯肉眼可見固體.按照說明書操作步驟,提取RNA.然后按照反轉錄試劑盒步驟,將提取的RNA進行反轉錄,得到的cDNA用SYBR Green染料結合法,進行Real-time PCR.目的基因的相對表達量經過內參標化后分析(表1).

1.9 免疫印跡(Western blot)檢測蛋白表達 取少量腫瘤組織,按照總蛋白提取試劑盒步驟,提取組織總蛋白,用BCA法進行蛋白濃度測定(具體步驟見商品說明書).將蛋白液與蛋白上樣緩沖液混合后,100oC變性10 min,然后進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳.電泳后,取下凝膠,標記方向后進行轉膜,封閉,孵育一抗(兔源Notch1、p-PTEN、PTEN、p-Akt抗體按照1:800濃度稀釋比稀釋,GAPDH抗體按照1:2,000濃度比稀釋),孵育二抗(羊抗兔二抗按照1:5,000濃度稀釋比稀釋),最后經過充分洗膜后,進行曝光,分析結果.

1.10 統計學分析 采用SPSS 18.0 統計學軟件進行數據分析,數據均以均數±標準差(Mean±SD)表示,組間比較采用Student's t檢驗,P<0.05表示差異具有統計學意義.

2 結果

2.1 綠原酸對NSCLC A549細胞增殖的影響 綠原酸處理A549細胞48 h后,對照組細胞生長狀態較好;而給藥組細胞隨著綠原酸劑量的升高,細胞脫落懸浮,破碎增多,部分細胞呈凋亡狀態.

在綠原酸處理A549細胞24 h、48 h、72 h后,分別采用MTT法檢測細胞增殖的影響.結果顯示,與對照組比較,綠原酸對A549細胞的抑制率明顯升高(P<0.05),并且呈現劑量依賴趨勢.在100 μg/mL綠原酸作用在72 h時,抑制率達最高(61.63%)(表2).

2.2 綠原酸對NSCLC A549細胞凋亡和細胞周期的影響 流式細胞儀檢測綠原酸作用于A549細胞72 h后,隨著綠原酸濃度增加,G2期/M期細胞百分比逐漸增加,且均高于對照組,差異顯著(P<0.05或P<0.01);隨著給藥濃度增加,細胞的凋亡率逐漸增加,均高于對照組,差異顯著(P<0.05或P<0.01)(圖1,表3).

2.3 綠原酸對A549細胞裸鼠荷瘤模型腫瘤增殖的影響 通過A549細胞裸鼠荷瘤模型發現,綠原酸能夠抑制裸鼠腫瘤的生長增殖,實驗組裸鼠腫瘤大小明顯小于對照組,具有統計學差異(P<0.05),見表4、圖2、圖3.將裸鼠處死后,發現試驗組裸鼠無轉移瘤出現,而在對照組肺中發現有6例微小轉移瘤.實驗組腫瘤重量為(0.48±0.12)g,對照組為(0.83±0.22)g,兩組比較差異具有統計學意義(P<0.01).

2.4 綠原酸對Notch信號通路相關分子mRNA表達量的影響 實驗組Notch1的配體Delta4、VEGF的mRNA相對表達量明顯小于與對照組(P<0.05).實驗組Notch1信號通路下游效應分子HES1、HEY1的mRNA相對表達量明顯降低(P<0.05).見圖4.

2.5 綠原酸對PTEN-PI3K/AKT通路相關因子蛋白表達的影響 檢測Notch1及PTEN-PI3K/AKT通路相關因子的蛋白表達水平,結果顯示,與對照組比較,試驗組Notch1蛋白表達明顯降低,且p-PTEN、PTEN蛋白表達量升高,總的PTEN蛋白表達量增多;試驗組p-Akt的表達量減少.見圖5.

表 1 相關基因PCR引物Tab 1 Related gene PCR primers

表 2 綠原酸對A549細胞增殖的抑制作用(Mean±SD)Tab 2 Inhibitory effect of chlorogenic acid on proliferation of A549 cells (Mean±SD)

表 3 綠原酸對A549細胞周期分布時相的影響(Mean±SD)Tab 3 Effect of chlorogenic acid on the cell cycle profile of A549 cells (Mean±SD)

表 4 不同時間點裸鼠腫瘤大小的比較(Mean±SD, cm3)Tab 4 Comparison of tumor size in nude mice at different time points (Mean±SD, cm3)

3 討論

綠原酸類物質是植物體中重要的次生代謝產物,廣泛存在于高等雙子葉植物和蕨類植物中,杜仲、金銀花、咖啡等植物中綠原酸類物質含量較高.綠原酸類物質可通過調節細胞周期、誘導凋亡、抑制細胞生長等途徑產生抗癌作用,對肺癌、乳腺癌、肝癌具有顯著的抑制作用,被認為是癌癥的有效化學防護劑[6-8].但綠原酸對肺癌的抑制作用機制的研究并不多見.

Notch信號通路與人類許多腫瘤都存在密切的關系.Notch信號的產生是通過相鄰細胞的Notch配體與受體相互作用,Notch蛋白經過三次剪切,由胞內段釋放入胞質,激活HES、HEY、HERP等堿性-螺旋-環-螺旋(bHLH)轉錄抑制因子家族的靶基因,發揮生物學作用.Notch信號通路不僅在組織器官的正常發育中起作用,還與一些腫瘤的發生、發展密切相關[9-13].有研究表明Notch信號通路在肺癌的發生發展起著重要作用[14],但是具體的作用機制一直沒有達成共識.本文通過研究Notch受體、配體以及相關因子在非小細胞肺癌細胞裸鼠荷瘤模型中的表達,探討Notch1信號通路與肺癌發生發展的關系,闡明綠原酸抑制非小細胞肺癌細胞凋亡的原理,同時為以Notch1信號通路為靶點的治療提供分子機制方面的理論支持.

本研究發現,在細胞及動物水平上,綠原酸能有效抑制非小細胞肺癌細胞的生長增殖,促進細胞的凋亡.同時本研究發現實驗組肺癌組織的Notch1 mRNA的平均表達水平顯著下降,同時下調下游的HES1和HEY1 mRNA的表達,提示綠原酸可以通過Notch1信號通路轉錄水平調控非小細胞肺癌凋亡的.有研究[15]發現,抑制VEGF表達可以達到抑制人非小細胞肺癌A549細胞裸鼠移植瘤的血管生成的作用.VEGF可誘導Notch1配體Delta4表達增高,從而可啟動Notch信號傳導通路.研究發現Notch信號通路配體Delta4以及VEGF的表達水平,發現實驗組減少Delta4以及VEGF的mRNA水平的表達.因此,推測綠原酸可能是通過減少VEGF的表達,下調Delta4水平,從而抑制Notch1信號通路的活化.

圖 1 綠原酸對A549細胞凋亡率的影響.實驗組與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01.Fig 1 Effect of chlorogenic acid on apoptosis rate of A549 cells. The experimental group compared with the control group, *P<0.05, **P<0.01.

圖 2 綠原酸對腫瘤生長增殖的影響Fig 2 Effect of chlorogenic acid on tumor growth and proliferation

圖 3 兩組裸鼠腫瘤比較Fig 3 Comparison of nude mice tumers of two groups

圖 4 Real-time PCR檢測Delta4、VEGF、Notch1、HES1、HEY1的mRNA表達水平.實驗組與對照組比較,**P<0.01,*P<0.05.Fig 4 mRNA expression of Delta4, VEGF, Notch1, HES1,HEY1 detected by Real-time PCR. The experimental group compared with the control group, *P<0.05,**P<0.01.

圖 5 Western blot檢測Notch1、PTEN、p-PTEN、p-Akt蛋白表達水平Fig 5 Expression of Notch1, PTEN, p-PTEN, p-Akt protein detected by Western blot

Notch信號通路不僅能夠直接調控大量的基因表達,而且還可以與其他信號通路(包括TGF-β、NF-κB、Hif-1α等)相互作用而擴大其調控范圍[16-18].近年來,Notch通路與PI3K-AKT等通路之間的互相作用受到廣泛的關注抑癌基因PTEN在PI3K-AKT信號通路中發揮著至關重要的作用,PTEN的失活會導致PI3K-AKT通路活化,PTEN能夠使磷脂酰肌醇(3,4,5)-三磷酸(PIP3)脫磷酸,使PIP3磷酸化呈低水平,抑制AKT的活化,從而下調PI3K/AKT通路相關因子表達.在PI3K-AKT通路中,PTEN有時候以磷酸化形式(p-PTEN)出現,繼而啟動下游級聯反應,導致一系列生物學行為的發生.AKT磷酸化激活下游信號因子活化.本研究檢測Notch1信號通路與PTEN-PI3K/AKT通路的相互作用是否存在交叉調控,結果發現,試驗組的 p-PTEN、PTEN蛋白表達量都出現了一定程度的升高,總的PTEN蛋白表達量增多;與對照組比較,試驗組p-Akt的表達量減少.提示Notch1通路可能通過對抑癌基因PTEN的調控來影響肺癌細胞的生物學功能,通過PTEN與PI3K/AKT通路存在交叉調控作用.

Notch信號通路非常復雜,且調控機制目前仍未清楚闡明.Notch信號通路在腫瘤的發生發展中非常重要,但是目前該通路的研究以及Notch信號通路與其他信號通路的交叉調控方面的研究相對較少,希望能后續進一步詳細闡明Notch信號通路的生物學作用機制,填補這一塊研究的空白,為肺癌的靶向治療提供更有力的理論基礎.