擬南芥蛋白激酶SnRK1.1對轉錄因子FD的磷酸化分析

袁 敏，葛偉娜，王 莉，張 嵐，張家琦

(華北理工大學 生命科學學院，基因組學與計算生物學研究中心，河北 唐山 063000)

擬南芥蛋白激酶SnRK1.1對轉錄因子FD的磷酸化分析

袁 敏，葛偉娜，王 莉，張 嵐，張家琦

(華北理工大學 生命科學學院，基因組學與計算生物學研究中心，河北 唐山 063000)

為了獲得純化的SnRK1.1與FD蛋白，分析蛋白激酶SnRK1.1是否能夠磷酸化開花調控途徑中的轉錄因子FD，成功克隆了1 608 bp的SnRK1.1基因以及858 bp的FD與FD-T282A基因，分別與PGEX-4T-3載體連接，獲得原核表達載體GST-SnRK1.1、GST-FD和GST-FD-T282A，并分別轉化大腸桿菌BL21菌株；SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色(CBB)表明，0.5 mmol/L IPTG能夠成功誘導出GST-SnRK1.1、GST-FD和GST-FD-T282A蛋白。利用GST純化介質純化獲得了84 kDa的GST-SnRK1.1蛋白以及58 kDa的GST-FD與GST-FD-T282A融合蛋白；利用體外磷酸化體系證實SnRK1.1能夠磷酸化FD，不能磷酸化突變的FD-T282A。研究結果為進一步解析SnRK1.1通過磷酸化轉錄因子FD參與開花途徑調控的機制奠定了良好的基礎。

SnRK1.1；FD；蛋白激酶；轉錄因子；磷酸化

蛋白質所受的修飾調節直接影響其活性及生物學功能。磷酸化作為一種重要的蛋白質翻譯后修飾，廣泛參與植物的激素信號轉導，抗逆境脅迫、氣孔發育、光信號轉導等多種生命活動[1-2]。近年來的研究表明，蛋白質磷酸化修飾也存在于植物開花調控過程中[3-5]。轉錄因子FD只有在被磷酸化之后才能與成花素蛋白FT以及生長調節因子14-3-3蛋白形成成花素激活復合體(FAC)[6-10]。蛋白激酶CPKs家族成員CPK6和CPK33能夠磷酸化FD蛋白C末端第282位蘇氨酸[11-13]。

筆者在篩選FD互作蛋白時發現了蛋白激酶SnRK1.1。SnRK1.1是植物蔗糖非發酵-1相關蛋白激酶SnRK1的催化亞基，此外，還有SnRK1.2和SnRK1.3 2個同源基因編碼其催化亞基。SnRK1通常由1個催化亞基和2個具有調節功能的亞基組裝成三聚體發揮功能[14-17]。SnRK1參與調控植物礦物質營養的攝取、脫落酸ABA信號轉導、非生物/生物脅迫、逆境響應等很多植物生長發育過程[18-20]。蛋白激酶SnRK1.1與CPKs都能識別并磷酸化具有R-X-X-pS/T-X-P氨基酸序列的蛋白[21]。但是，SnRK1.1是否也能磷酸化轉錄因子FD尚不清楚。本研究從大腸桿菌中分別純化了SnRK1.1、FD和FD-T282A(第282位絲氨酸突變為丙氨酸)融合蛋白，體外激酶試驗檢測發現SnRK1.1能夠磷酸化轉錄因子FD，不能磷酸化帶有突變位點的FD-T282A蛋白，表明T282位點參與SnRK1.1對轉錄因子FD的磷酸化作用。研究結果為后續研究SnRK1.1通過磷酸化轉錄因子FD參與植物開花調控提供了直接的證據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

DH5α和BL21菌株由華北理工大學基因組學與計算生物學研究中心保存；基因克隆相關試劑購于大連生工公司；GST蛋白純化介質、純化柱和HRP標記的二抗購于美國Bio-Rad公司；anti-pThr抗體購于Sigma公司；Western Blot免疫印跡檢測底物購于Pierce公司。

1.2 試驗方法

1.2.1FD、FD-T282A及SnRK1.1基因的克隆 分別利用各自的基因特異引物擴增獲得全長基因。第282位蘇氨酸靠近FD蛋白KC末端，因此可以直接設計帶有突變位點的引物來擴增FD-T282A。所用的引物分別如下(下劃線標注酶切位點)：FD-BamH Ⅰ-F：5′-CGGGATCCATGTTGTCATCAGCTAAGCATC-3′，FD-NotⅠ-R：5′-ATAAGAATGCGGCCGCAAATGGAGCTGTGGAAGACCG-3′，FD-T282A-NotⅠ-R：5′-ATAAGAATGCGGCCGCTCAAAATGGAGCTGCGGAAGAC-3′，SnRK1.1-BamH I-F：5′-CGGGATCCATGGATGGATCAGGCACAGG-3′，SnRK1.1-NotⅠ-R：5′-ATAAGAATGCGGCCGCGAGGACTCGGAGCTGAGCA-3′。

1.2.2 GST-FD、GST-FD-T282A和GST-SnRK1.1表達載體構建 利用BamH Ⅰ和NotⅠ酶切擴增產物，連入PGEX-4T-3載體，分別獲得GST-FD、GST-FD-T282A和GST-SnRK1.1表達載體。

1.2.3 GST-FD、GST-FD-T282A和GST-SnRK1.1蛋白純化 離心收集菌體，棄上清，用樣品緩沖液重懸沉淀。菌體經過超聲破碎后于4 ℃，14 000 r/min離心15～20 min。將上清液于離心管中與純化介質混合低溫低速混勻2～3 h。500～1 000 r/min離心后舍棄上清，樣品緩沖液重懸洗滌GST基質3次。利用適量體積的蛋白洗脫緩沖液與純化介質孵育洗脫目標蛋白，可重復洗脫多次，再用濃縮管離心來收集目標蛋白。

1.2.4 蛋白質的透析與純度檢測 透析的目的是去除蛋白質溶液中的谷胱甘肽，避免對后續試驗的影響。將純化的蛋白溶液裝入透析袋，置于裝有適量透析液的燒杯中，緩慢攪拌，更換數次透析液，直至充分降低蛋白溶液中谷胱甘肽的濃度。透析后取0.5～1.0 μg蛋白，加入適量的2×SDS上樣緩沖液，95 ℃加熱10 min，12 000 r/min離心5 min，取上清液進行SDS-PAGE電泳，檢測目標蛋白的質量。

1.2.5 體外激酶試驗 將1.0 μg GST-SnRK1.1與0.5 μg GST-FD或者0.5 μg GST-FD-T282A在激酶反應緩沖液(40 mmol/L Tris.HCl，pH值7.4，1 mmol/L MgCl2，10 μmol/L ATP)中室溫孵育20～30 min。然后利用Western Blot免疫印跡技術以及特異檢測磷酸化修飾的抗體anti-pThr檢測GST-FD或者GST-FD-T282A是否被GST-SnRK1.1磷酸化。

2 結果與分析

2.1FD、FD-T282A基因的克隆及表達載體的構建

利用FD特異性引物PCR擴增，分別獲得858 bp的FD和858 bpFD-T282A全長基因(圖1-A)。將目的條帶利用BamH Ⅰ和NotⅠ酶切后與表達載體PGEX-4T-3連接轉化DH5α，菌落PCR擴增鑒定后測序獲得正確的表達載體GST-FD和GST-FD-T282A(圖1-B)。

A. PCR擴增FD基因：1.FD，2.突變的FD-T282A； B. GST-FD和GST-FD-T282A的菌落PCR擴增結果：1～3. GST-FD菌落，4～6. GST-FD-T282A菌落；M.DNA分子量標準。

A. PCR amplification ofFD：1.FDgene，2. MutatedFD-T282Agene； B. Colony PCR amplification of GST-FDand GST-FD-T282A： 1-3. GST-FDcolonies，4-6. GST-FD-T282Acolonies；M.DNA Marker.

圖1FD表達載體的構建
Fig.1 Construction of expression vector ofFD

2.2SnRK1.1基因的克隆及表達載體的構建

利用SnRK1.1基因上下游引物擴增，獲得1 608 bp的SnRK1.1全長基因(圖2-A)。BamHⅠ和NotⅠ酶切后連接到PGEX-4T-3載體上，經菌落PCR及測序鑒定獲得正確的表達載體GST-SnRK1.1(圖2-B)。

A. PCR擴增SnRK1.1基因:1.SnRK1.1； B. GST-SnRK1.1菌落PCR擴增結果:1～4. GST-SnRK1.1菌落;M.DNA分子量標準。 A. PCR amplification of SnRK1.1；B.Colony PCR amplification of GST-SnRK1.1:1-4.GST-SnRK1.1 colonies；M.DNA Marker.

2.3 GST-FD和GST-FD-T282A蛋白的誘導表達

將分別轉化重組載體GST-FD或GST-FD-T282A的大腸桿菌利用合適濃度的IPTG室溫誘導6 h。SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色(CBB)結果表明，室溫0.5 mmol/L IPTG能夠誘導出分子量約為58 kDa的GST-FD和GST-FD-T282A蛋白(圖3)。

1.GST-FD誘導前；2.GST-FD誘導后；3.GST-FD-T282A誘導前；4.GST-FD-T282A誘導后；M.蛋白分子量標準。 1. GST-FD before induction；2.GST-FD after induction； 3. GST-FD-T282A before induction；4.GST-T282A after induction；M.Protern Marker.

2.4 GST-SnRK1.1蛋白的誘導表達

將轉化空載體PGEX-4T-3或重組載體GST-SnRK1.1的大腸桿菌利用合適濃度的IPTG，18 ℃誘導過夜。SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色(CBB)結果表明，0.5 mmol/L IPTG誘導出分子量為84 kDa的GST-SnRK1.1蛋白和26 kDa的GST蛋白(圖4)。

2.5 GST-FD和GST-FD-T282A融合蛋白的純化

將分別轉化GST-FD或GST-FD-T282A表達載體的大腸桿菌進行大量誘導，超聲破碎菌體，離心，收集上清液使用GST純化介質純化。透析去除蛋白洗脫液中的谷胱甘肽。SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色(CBB)分析，獲得的GST-FD和GST-FD-T282A蛋白純度高，分子量為58 kDa(圖5)。

1.GST誘導前；2.GST誘導后；3.GST-SnRK1.1誘導前；4. GST-SnRK1.1誘導后；M.蛋白分子量標準。 1. GST before induction；2.GST after induction； 3. GST-SnRK1.1 before induction；4.GST-SnRK1.1 after induction；M.Protein Marker.

2.6 GST-SnRK1.1融合蛋白的純化

利用上述同樣的方法進行GST-SnRK1.1蛋白的純化。SDS-PAGE電泳和考馬斯亮藍染色(CBB)分析，獲得了純度好、分子量84 kDa 的GST-SnRK1.1融合蛋白，與預期蛋白分子量大小一致(圖6)。

2.7 蛋白激酶GST-SnRK1.1能夠磷酸化GST-FD

室溫條件下，將1.0 μg GST-SnRK1.1分別與0.5 μg GST-FD或0.5 μg GST-FD-T282A于激酶反應緩沖液中孵育30 min。然后利用Western Blot免疫印跡技術和anti-pThr抗體檢測GST-FD或GST-FD-T282A是否能被激酶GST-SnRK1.1磷酸化。蛋白質的蘇氨酸(Thr)位點被磷酸化后可以被anti-pThr抗體識別。試驗結果顯示，與GST-SnRK1.1共同孵育的GST-FD(泳道2)被anti-pThr識別，但是與GST-SnRK1.1共同孵育的GST-FD-T282A(泳道3)未被anti-pThr識別，其余泳道為單獨的GST-SnRK1.1、GST-FD或者GST-FD-T282A作為陰性對照。該結果直接證實了GST-SnRK1.1能夠磷酸化GST-FD但不能磷酸化GST-FD-T282A(圖7)。

1. GST-SnRK1.1蛋白；M. 蛋白分子量標準。 1. GST-SnRK1.1 recombinant protein；M. Protein Marker.

1.單獨GST-SnRK1.1；2. GST-SnRK1.1和GST-FD；3. GST-SnRK1.1和GST-FD-T282A；4. 單獨GST-FD；5. 單獨GST-FD-T282A；M.蛋白分子量標準。

1.GST-SnRK1.1 alone；2.GST-SnRK1.1 and GST-FD；3.GST-SnRK1.1 and GST-FD-T282A；4.GST-FD alone；5.GST-FD-T282A alone；M.Protein Marker.

圖7 GST-SnRK1.1蛋白能夠磷酸化GST-FD
Fig.7 GST-SnRK1.1 could phosphorylate GST-FD

3 討論與結論

生物體執行生命活動最終是依靠蛋白質來完成的，并且常常通過蛋白翻譯后修飾來傳遞遺傳信息。由蛋白激酶和蛋白磷酸酶分別控制的蛋白質可逆磷酸化修飾是一種十分重要的修飾方式，參與調控生物體內許多的生物學過程。近年來的研究表明，蛋白質的磷酸化修飾在植物開花途徑中發揮重要作用，主要在于開花途徑轉錄因子FD蛋白存在磷酸化修飾調節。FD是bZIP轉錄因子家族成員，FD的磷酸化修飾對于其在開花途徑中發揮必不可少的作用。只有磷酸化狀態的FD才能夠與成花素蛋白FT結合進而調節下游SOC1和AP1基因的表達，促進花分生組織的形成。因此，尋找并研究開花途徑中負責磷酸化FD的蛋白激酶對于解讀植物開花機制具有十分重要的意義。SnRK1.1是植物蔗糖非發酵-1相關蛋白激酶SnRK1家族的重要成員，結構非常復雜，廣泛參與植物非生物/生物脅迫、逆境信號轉導、脫落酸ABA信號轉導以及植物生長發育等眾多生物學過程，但是目前關于SnRK1.1是否參與植物開花調控還不清楚。Williams等[9-10，14]的研究結果表明，擬南芥SnRK1.1過表達轉基因植株表現出輕微的晚花表型。那么，SnRK1.1是否直接參與開花時間調控值得進一步研究和探索。

蛋白激酶CPKs家族成員CPK6和CPK33能夠磷酸化FD蛋白，作用位點是第282位的蘇氨酸[13]。本研究利用原核表達技術純化了高質量的GST-SnRK1.1、GST-FD以及GST-FD-T282A蛋白，體外激酶試驗證實了蛋白激酶SnRK1.1能夠磷酸化FD，不能磷酸化突變的GST-FD-T282A蛋白。由此看出SnRK1蛋白激酶也能夠磷酸化FD蛋白的第282位蘇氨酸位點。CPKs與SnRK1蛋白激酶都能夠磷酸化FD蛋白，那么CPKs與SnRK1對FD的磷酸化有何區別，二者如何協調控制FD蛋白的磷酸化,二者是否在不同的條件下或者不同的時段分別磷酸化FD,對FD蛋白氨基酸序列進行分析發現該蛋白上存在多個絲氨酸/蘇氨酸位點，除了第282位蘇氨酸位點，CPKs與SnRK1是否能夠磷酸化其他的絲氨酸/蘇氨酸位點，以及CPKs與SnRK1是否通過磷酸化不同的位點或者不同數目的位點發揮作用等都將是值得研究的問題。

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Protein Kinase SnRK1.1 Phosphorylates Transcriptional Factor FD inArabidopsisthaliana

YUAN Min，GE Weina，WANG Li，ZHANG Lan，ZHANG Jiaqi

(College of Life Sciences，North China University of Science and Technology，Genomics and Computational Biology Research Center,Tangshan 063000,China)

This study aimed at obtaining purified SnRK1.1 and FD proteins，and analyzing whether SnRK1.1 could phosphorylate transcription factor FD in flowering regulation pathway. 1 608 bpSnRK1.1 gene and 858 bpFD/FD-T282Agenes were cloned successfully and linked into PGEX-4T-3 vector respectively. GST-SnRK1.1,GST-FDand GST-FD-T282Aexpression vectors were made and transformed intoE.colistrain BL21. SDS-PAGE and CBB staining showed that 0.5 mmol/L IPTG could successfully induce GST-SnRK1.1,GST-FD and GST-FD-T282A proteins. 84 kDa GST-SnRK1.1 and 58 kDa GST-FD or mutated GST-FD-T282A proteins were purified using GST tag protein purification system. The purified GST-SnRK1.1 recombinant protein could phosphorylate GST-FD proteins but not mutated GST-FD-T282A protein. This result would provide a good basis to study how SnRK1.1 mediates flowering through phosphorylating FD.

SnRK1.1；FD；Protein kinase；Transcription factor；Phosphorylation

2017-06-01

國家自然科學基金項目(31401212)；河北省自然科學基金項目(C2014209134)；唐山市科技局項目(15140202a)

袁 敏(1982- )，女，河北盧龍人，講師，博士，主要從事植物激素與生長發育方面的研究。

Q71;Q78

A

1000-7091(2017)04-0037-05

10.7668/hbnxb.2017.04.006