中國水仙凝集素基因在大花煙草中的定量表達及抗蚜性分析

楊會苗，陳段芬

(河北農業大學 園藝學院，河北 保定 071001)

中國水仙凝集素基因在大花煙草中的定量表達及抗蚜性分析

楊會苗，陳段芬

(河北農業大學 園藝學院，河北 保定 071001)

為了確定中國水仙凝集素基因NTL1的抗蚜功能及培育具有抗蚜功能的大花煙草，利用qPCR方法，研究了中國水仙凝集素基因(NTL1)在轉基因大花煙草4個株系中的相對表達情況；利用自然感蚜、活體接種和離體接種方法研究了不同轉基因株系的抗蚜能力。結果表明，NTL1在不同株系中的相對表達量差異顯著，從高到低依次為3，4，1，2；抗蚜蟲試驗結果顯示：轉基因煙草具有一定抗蚜性，但不同煙草株系的抗蚜能力有所不同；活體轉基因煙草單株與離體煙草葉片的平均蚜蟲密度抑制率分別為8.22%～76.61%，4.62%～65.65%；轉基因大花煙草可加速蚜蟲的死亡。對比NTL1在不同轉基因大花煙草株系中的相對表達量及抗蚜效果，發現NTL1在不同株系中的相對表達量與植株抗蚜性具有高度一致性。

中國水仙；凝集素基因；qPCR；大花煙草；抗蚜性

植物凝集素(Lectin)是由Stillmark于1888年從蓖麻(RicinuscommunisL.)籽中獲得的一種可以可逆結合特異單糖或寡糖并具有凝血活性的蛋白，之后在多種植物的種子、根、莖、葉、果實、子房中均發現有植物凝集素的廣泛存在[1]。對其功能研究發現，植物凝集素具有一定的抗蟲能力[2-4]，尤其對鱗翅目[5-7]、同翅目蚜蟲[7-17]、褐飛虱[18-19]、葉蟬[20]等刺吸式口器害蟲具有一定抗性。

蚜蟲作為一種重要的害蟲，通過吸食營養、影響光合和傳播病毒三方面危害植物[21]。由于蚜蟲具有種類多、世代周期短、繁殖速度快、寄主范圍廣等特點，防治難度甚大。當前防治蚜蟲的方法主要為化學藥劑防治、生物防治、選育抗蚜品種等[22-23]，但化學藥劑的大量使用對生態環境造成巨大破壞，生物防治無法廣泛應用于農業生產，選育抗蚜品種則費時費力。

隨著轉基因技術的發展，植物凝集素廣泛應用于植物的抗蟲育種。目前，已發現的具有抗蟲功效的凝集素基因有麥胚凝集素、豌豆凝集素、雪花蓮凝集素、莧菜凝集素、半夏外源凝集素等。其中，雪花蓮凝集素對蚜蟲具有強烈的毒性[12-13,24-28]。中國水仙凝集素基因NTL1是從中國水仙金盞銀臺中克隆到的一個凝集素基因，該基因編碼的前體蛋白的一級結構與雪花蓮凝集素的一致性達81%，且三級結構極其相似[29]。而對于該基因的抗蟲功能，尚未有人對其進行研究。本研究通過對轉入中國水仙凝集素基因NTL1的大花煙草進行qPCR表達分析，同時對轉基因植株進行抗蚜蟲試驗，一方面分析該基因的抗蚜蟲性能，另一方面為今后抗蚜大花煙草新品種的選育提供借鑒和參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

攜帶NTL1基因的大花煙草(Nicotianaalata)T0植株由河北農業大學園藝實驗室保存。煙蚜(Myzuspersicae)由山東農業大學惠贈。

1.2 試驗方法

1.2.1 T0轉基因大花煙草不同單株的qPCR表達分析 選取4個轉基因大花煙草的不同單株和對照植株，提取總RNA，用HiFi-MMLVcDNA第1鏈合成試劑盒反轉錄合成的cDNA為模板，在NTL1基因的特異性區域設計引物(上、下游引物見表1)，以煙草β-actin為內參基因(表1)，對NTL1基因進行qPCR擴增，采用2-ΔΔCT法進行數據的相對定量分析。

表1 qPCR引物Tab.1 Primers for qPCR

1.2.2 T0轉基因大花煙草不同株系自然感蚜性鑒定 不同株系自然感蚜性鑒定參照蚜量比值法[30]。以徐雪蓮等[31]抗蚜方法為參照并加以改進。選取同期栽植長勢一致的轉基因植株，以非轉基因植株為對照株，搭建塑料小棚，將轉化植株放于塑料小棚中，同時放入已感蚜植株，調查各個植株的自然感蚜情況(圖1-A)。感蚜性標準以平均單株蚜量比值大小進行分級：0～0.25(高抗HR)、0.26～0.50(抗蚜R)、0.51～0.90(中抗MR)、0.91～1.25(感蚜S)、大于1.25(高感HS)。平均單株蚜量比值= 平均單株蚜量/ 所有參試植株平均單株蚜量。

1.2.3 T0轉基因大花煙草不同株系蚜蟲密度抑制試驗 選取長勢一致的轉基因植株與非轉基因植株，每株接蟲5只，煙草幼苗外部遮蓋孔徑為0.150 mm防蟲網，重復5次。將煙草苗移到人工氣候室進行培養(圖1-B)。培養條件為：濕度80%，溫度22 ℃，光照∶黑暗=14 h∶10 h。每天上午9：00調查蚜蟲數量，共調查14 d。

抗蚜效果評價標準[8]：

蚜蟲密度抑制率=(對照植株蟲數-參試植株蟲數)/對照植株蟲數×100%；

平均蚜口密度抑制率=各個參試植株的蚜蟲密度抑制率之和/參試植株數×100%。

1.2.4 T0轉基因大花煙草不同株系離體葉片蚜蟲密度抑制試驗 培養皿底部鋪2層無菌水浸濕的濾紙，每皿中放置1枚狀態一致的葉片，葉柄處用浸水脫脂棉進行包裹。用毛筆向煙草葉片上接蚜蟲5只，重復5次。將培養皿移到人工氣候室進行培養，培養條件同1.2.3(圖1-C)。每天調查蚜蟲生長狀況，共調查14 d。抗蚜效果評價標準參照1.2.3。

1.2.5 生殖能力調查 方法及培養條件同1.2.4，但每個葉片接蚜蟲一只，重復5次。每天觀察母體蚜蟲的存活狀況及幼蚜的生殖情況，并挑出新生蚜蟲，直至母體蚜蟲死亡為止(圖1-D)。

A.感蚜性試驗；B.轉基因植株抗蚜試驗；C.離體葉片蚜量測定；D.離體葉片蚜蟲生殖能力測定。

A. Test of aphid susceptibility; B. Aphid bioassay of transgenic tobacco plant; C.Determination of aphid quantity on the detached leaf; D.Determination of aphid fecundity on the detached leaf .

圖1 轉基因煙草抗蚜試驗
Fig.1 Aphid bioassay of transgenic tobacco

2 結果與分析

2.1 T0轉基因大花煙草不同單株的qPCR表達分析

2.1.1 中國水仙凝集素基因NTL1引物篩選 選取煙草cDNA配置成5，52，53，54，55倍5個梯度稀釋，稀釋后取2 μL作模板，用NTL1基因引物進行擴增，同時在60～95 ℃進行融解曲線分析，儀器自動繪制出基因標準曲線。從圖2可見，NTL1基因標準曲線的R2達到0.99，說明線性相關度很高，且擴增效率均在90%以上，溶解曲線只有明顯的單一峰，因此，可采用此種方法和上述引物進行后續樣本的擴增分析。

圖2 NTL1基因標準曲線及溶解曲線Fig.2 Standard curve and melt curve for NTL1

2.1.2 不同單株的qPCR表達分析 將各樣品cDNA 10倍稀釋，取2 μL作模板，分別用目的基因NTL1引物和內參基因β-actin引物進行擴增。同時在60～95 ℃進行溶解曲線分析。結果發現：NTL1基因與大花煙草內參基因β-actin的溶解曲線均只有一個明顯單峰，說明所用引物是正確的，能夠特異性地擴增各個基因的相應產物，沒有形成引物二聚體等其他產物，且每個樣品的 PCR 擴增曲線正常，整體平行性和重復性較好，由此可推斷試驗數據是準確可靠的(圖3，4)。

圖3 目的基因NTL1的擴增曲線(左)和溶解曲線(右)Fig.3 Amplification curve (left) and melt curve (right) of NTL1

圖4 內參基因的擴增曲線(左)和溶解曲線(右)Fig.4 Amplification curve (left) and melt curve (right) for reference gene

根據qPCR原始檢測結果，按照2-ΔΔCT相對定量計算公式，計算出各樣品中目的基因的相對定量結果。結果顯示：中國水仙凝集素基因NTL1在4個轉基因植株單株中均有表達，但表達量不同，3>4>1>2(圖5)。

a、b、c、d.在0.05水平上顯著。圖6-8同。a,b,c,d.Correlation is significant at the 0.05 level.The same as Fig.6-8.

2.2 T0轉基因大花煙草抗蚜試驗

2.2.1 自然感蚜試驗 自然感蚜試驗表明，接種蚜蟲第7，14天對照株植株上的蚜蟲數量多于轉化植株；第21，28天1號植株上的蚜蟲數量最多，其次為對照株，2，3，4號相對較少；各處理大花煙草植株上的蚜蟲數量均表現相同的規律，即隨時間的發展呈現先增多后減少的趨勢(圖6)。

不同大花煙草植株的抗蚜性結果顯示(表2)：第7，14，21，28天的對照株蚜量比值分別為2.21，1.73，1.65，1.74，均大于1.25，屬于高感株。第7天時，轉基因植株蚜量比值分別為0.77，0.19，0.87，0.96，對蚜蟲的抗性表現為中抗、高抗、中抗和感蚜。隨時間推進，1號植株蚜量比值增大，分別為1.38，1.80，1.87，均大于1.25，對蚜蟲的抗性表現為高感；2號植株蚜量比值增大，分別為0.42，0.45，0.45，對蚜蟲抗性表現為抗蚜；3號蚜量比值分別為0.56，0.23，0.56，對蚜蟲的抗性表現分別為中抗、高抗、中抗。4號煙草蚜量比值為0.91，0.87，0.37，對蚜蟲的抗性表現為感蚜、中抗、抗蚜。

圖6 不同煙草植株蚜量比較Fig.6 Comparison of aphid amount on tobacco plants

調查日期 Time 蚜量比值ThenumberratioofaphidCK1234接蚜后7d7daysafterinoculateaphid2.210.770.190.870.96接蚜后14d14daysafterinoculateaphid1.731.380.420.560.91接蚜后21d21daysafterinoculateaphid1.651.800.450.230.87接蚜后28d28daysafterinoculateaphid1.741.870.450.560.37

2.2.2 轉基因大花煙草的抗蚜蟲試驗 將試驗植株和對照植株轉接蚜蟲后，每天觀察煙草上蚜蟲的分布情況及群體的繁殖情況(圖1-B)。結果顯示，接種蚜蟲初期即第1，2天時，各個轉基因煙草植株上的蚜蟲量與對照相比差異不明顯；對照株、1，2號株系隨接種時間的延長，單株上的蚜蟲量逐漸增多，在第7天前增長緩慢，后期增長迅速，第14天時蚜量達到最大值；3號與4號株系上的蚜量隨接種時間的變化并不大(圖7-A)。接種后期即12～14 d時對比各個株系上的蚜蟲，1，3，4號煙草株系低于對照株，2號植株與對照相差不大。

圖7 不同轉基因煙草植株的蚜蟲總量與蚜蟲密度抑制率Fig.7 The gross and the rate inhibition of aphids on different transgenic tobacco

轉基因煙草植株對蚜蟲的抑制率如圖7-B右所示。結果顯示：不同植株在不同時期的蚜蟲抑制率不同。接種初期，轉基因植株與對照株對蚜蟲的抑制效果差異不顯著，隨時間的推進抑制率有所變化，接種后期，1，3，4號植株表現一定的抑制效果。試驗植株的平均蚜蟲抑制率為8.22%～76.61%。對比蚜蟲量及蚜蟲抑制率結果發現：轉基因大花煙草株系具有一定抗蟲效果。

2.2.3 轉基因大花煙草離體葉片抗蟲試驗 將試驗與對照煙草的葉片上分別轉接5只蚜蟲后，每天調查蚜蟲生長狀況及繁殖情況，連續調查14 d(圖1-C)。圖8-A為連續14 d各個煙草葉片每天的蚜蟲量。對各個煙草葉片進行對比發現：接種后的第1～5天，各個煙草葉片上的蚜蟲量差異不明顯；從第6天開始，植株葉片上的蚜蟲量開始明顯增加，到第14天觀察結束時數量達到最大。其中，2，3，4號煙草葉片的蚜蟲量低于對照，1號與對照相差不大。

圖8 不同轉基因煙草葉片上的蚜蟲總量與蚜蟲密度抑制率Fig.8 The gross and the rate inhibition of aphid on different transgenic tobacco

統計發現(圖8-B)，轉基因煙草的蚜蟲抑制率明顯高于對照，但蚜蟲密度抑制率因接種的時間與葉片的不同而有所不同，平均蚜蟲密度抑制率集中于4.62%～65.65%。綜合蚜量與蚜蟲抑制率結果發現，2，3，4號株系對蚜蟲具有一定的抗蚜效果。

2.2.4轉基因大花煙草離體葉片對蚜蟲生殖力影響 離體葉片對蚜蟲生殖力影響試驗結果如表3和圖9所示。由表3可看出，不同轉基因煙草葉片上的母體蚜蟲開始產蚜的日期與非轉基因煙草相差不大，均在接種蚜蟲的第1，2天就開始產生幼蚜；而母體蚜蟲死亡時間有所差異，對照植株平均于17 d時母體蚜蟲死亡，轉基因煙草上的蚜蟲死亡平均時間早于對照，分別于接蟲后7，14，7，8 d母蚜死亡。

轉基因煙草對于母體蚜蟲生產的幼蚜數量有一定影響，圖9為不同轉基因煙草葉片上的母體蚜蟲產生的幼蚜總數。結果表明，1，3，4號轉基因大花煙草的幼蚜量顯著少于對照株。

表3 轉基因煙草對蚜蟲生殖能力的影響Tab.3 The effect of transgenic tobacco on fecundity of aphid

圖9 不同轉基因煙草葉片上母蚜生產的幼蚜數量Fig.9 Number of larva aphid produced from maternal aphids

3 結論與討論

本試驗將轉入中國水仙凝集素基因NTL1的大花煙草進行了qPCR分析。qPCR結果表明，NTL1基因在不同轉基因大花煙草株系中的相對表達量不同，由高到低分別為3，4，1，2號株系。

抗蚜性試驗主要從自然感蚜性、蚜蟲抑制率、生殖能力三方面進行測試。

自然感蚜試驗通過蚜量比值法對抗蚜性進行分級，分級結果表明，非轉基因大花煙草植株屬于高感株；轉基因大花煙草株系表現一定的抗蚜性，但抗性效果有所不同，1號前期表現為中抗，后期表現為感蚜；2號株系由高抗變為抗蚜；3號株系主要表現為中抗；4號株系由感蚜變為抗蚜。

蚜蟲抑制率試驗結果顯示，轉基因大花煙草的蚜蟲總量明顯低于對照，各轉基因株系的平均蚜蟲密度抑制率為8.22%～76.61%。說明外源基因的介入提高了植株對蚜蟲的抗性。

生殖能力測試結果顯示，對照植株上母體蚜蟲生產的幼蚜數最多，其次為2，4，1，3號株系；對照株系上母體蚜蟲生存天數長于轉基因株系的母蚜生存天數，這與張曉英等[8]發現轉雪花蓮凝集素國槐加速母蚜死亡的研究結果一致。

離體葉片試驗不僅對蚜蟲的生殖能力進行測定，還對蚜蟲的增殖情況進行測定，結果顯示：1號株系與對照株系的蚜蟲量增加明顯，二者差異并不顯著，2，3，4號株系蚜蟲增殖較少，且明顯少于對照植株，平均蚜蟲密度抑制率為4.62%～65.65%，說明轉基因大花煙草株系對蚜蟲具有一定的抑制效應。王關林等[25]研究發現，轉雪花蓮凝集素基因(GNA)不同菊花株系蚜口密度抑制率為10%～84%；Hilder等[9]研究發現，轉GNA煙草的平均蚜蟲密度抑制率為50%。高澤發等[26]研究發現，轉GNA的小麥的平均蚜蟲密度抑制率約為47%；張曉英等[8]研究發現，轉GNA的不同國槐植株具有明顯的抗蚜性，平均蚜口密度抑制率為30.3%；周巖等[28]研究發現，轉GNA的煙草對桃蚜具有較強的抗蚜能力，平均密度抑制率達到45%～60%。由此可見，中國水仙凝集素基因NTL1與GNA具有相似的抗蚜性，是一個值得繼續研究的新型抗蚜基因。

通過比較本試驗中NTL1在不同轉基因大花煙草株系中的相對表達量及其抗蚜效果，結果發現，不同轉基因大花煙草的抗蚜性與NTL1在不同株系中的表達結果是高度一致的，即表達量高的植株抗蟲效果明顯，而表達量低的植株抗蟲效果較差。

離體葉片的抗蟲試驗結果略有不同，原因可能是由于在離體試驗中蚜蟲的增殖不僅受供試煙草的影響，還有可能受到試驗空間及中途換葉等人為因素的影響。因此，有必要探索更為精確的試驗方法，繼續研究該基因在其他植物材料上的抗蚜效果。

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Analysis of qPCR and Resistance to Aphid ofNTL1 Gene fromNarcissustazettavar.chinensisinNicotianaalata

YANG Huimiao,CHEN Duanfen

(College of Horticulture，Hebei Agricultural University，Baoding 071001，China)

The expression of the lectin gene (NTL1) fromNarcissustazzettavar.chinensisinNicotianaalatawas studied by qPCR method in order to determine the aphid-resistant function ofNTL1 and cultivateN.alatawith aphid-resistant. By means of susceptible to aphid，inoculationinvivoandinvitro，the resistance to aphid in different transgenic tobacco was studied. The result showed thatNTL1 gene had been integrated into the tobacco，but the expression of different tobacco was different，the expression ofNTL1 in tobacco by descending order was 3,4,1,2. The bioassay of aphid indicated that transgenic tobacco had a certain resistance to aphid，but the capacity of aphid-resistance in different tobacco plant was slightly different；The average density inhibition rate of aphid in inoculationinvivoandinvitrowas 8.22%-76.61% and 4.62%-65.65%. The transgenic tobacco could speed up the aphid′s death. The relative expression ofNTL1 gene in different transgenic tobacco and the result of resistance to aphid were compared，showed that two results came with a high degree of consistency.

Narcissustazettavar .chinensis；Lectin gene；qPCR；Nicotianaalata；Resistance to aphid

2017-06-12

河北省自然科學基金項目(C2014204131)

楊會苗(1990-)，女，河北柏鄉人，在讀碩士，主要從事觀賞植物種質資源與創新研究。

陳段芬(1968-)，女，河北寧晉人，教授，博士，主要從事觀賞植物種質創新利用研究。

S433.1

A

1000-7091(2017)04-0078-07

10.7668/hbnxb.2017.04.013