三七NAC轉(zhuǎn)錄因子基因PnNAC1的克隆及表達(dá)特性分析

王國(guó)東，李金晶，白智偉，關(guān)瑞攀，楊 野，曲 媛，崔秀明，劉迪秋

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

三七NAC轉(zhuǎn)錄因子基因PnNAC1的克隆及表達(dá)特性分析

王國(guó)東，李金晶，白智偉，關(guān)瑞攀，楊 野，曲 媛，崔秀明，劉迪秋

(昆明理工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500)

為了揭示三七抗病防衛(wèi)反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制，對(duì)三七的一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行了克隆和表達(dá)特性分析。以一年生三七幼苗為材料，根據(jù)編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的三七轉(zhuǎn)錄組Unigene設(shè)計(jì)引物，采用快速擴(kuò)增cDNA末端技術(shù)，克隆得到一個(gè)新的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，命名為PnNAC1。序列分析表明，該基因全長(zhǎng)815 bp，含有24 bp的5′非翻譯區(qū)和215 bp的3′非翻譯區(qū)，以及576 bp開(kāi)放閱讀框，共編碼191個(gè)氨基酸，具有保守的NAC結(jié)構(gòu)域。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示茉莉酸甲酯預(yù)處理三七根部大幅提高了PnNAC1在根中的轉(zhuǎn)錄水平，接種茄腐鐮刀菌后，PnNAC1的表達(dá)進(jìn)一步上升，在接種后4 h轉(zhuǎn)錄水平達(dá)最大值；無(wú)菌水預(yù)處理的三七中，PnNAC1也快速響應(yīng)茄腐鐮刀菌的侵染，但表達(dá)水平明顯低于茉莉酸甲酯預(yù)處理的樣品。接種人參鏈格孢后PnNAC1在葉片的表達(dá)量受抑制。茉莉酸甲酯、乙烯利、水楊酸和過(guò)氧化氫4種信號(hào)分子處理三七根部均誘導(dǎo)PnNAC1的表達(dá)。表明PnNAC1響應(yīng)幾種逆境相關(guān)信號(hào)分子，并參與三七對(duì)茄腐鐮刀菌和人參鏈格孢的防衛(wèi)反應(yīng)。

三七；NAC轉(zhuǎn)錄因子；茄腐鐮刀菌；人參鏈格孢；防衛(wèi)反應(yīng)

轉(zhuǎn)錄因子又稱(chēng)反式作用因子，通過(guò)調(diào)節(jié)基因表達(dá)水平參與調(diào)控生物體的生長(zhǎng)代謝過(guò)程。NAC (NAM，ATAF and CUC)轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的最大的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子之一。最早在矮牽牛(Petuniahybrida)中分離出第一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子NAM[1]，緊接著在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中發(fā)現(xiàn)了具有類(lèi)似功能的ATAF1/2和CUC2基因[2]，它們編碼的蛋白質(zhì)N端都有一段保守的氨基酸序列。分別取自矮牽牛NAM、擬南芥AT-AF1/ATAF2和CUC2基因的首字母將這類(lèi)蛋白質(zhì)命名為NAC[3]。大部分NAC轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)保守的N端DNA結(jié)合域和一個(gè)核定位信號(hào)以及一個(gè) C端可變結(jié)構(gòu)域[4]，N端保守的NAC結(jié)構(gòu)域可進(jìn)一步分為A～E 5個(gè)保守的子結(jié)構(gòu)域，具有結(jié)合DNA或蛋白質(zhì)的功能及二聚體化的作用。與N端的高度保守性不同，NAC轉(zhuǎn)錄因子的C端無(wú)論是在氨基酸序列還是序列長(zhǎng)度上都表現(xiàn)出多樣性，C端具有轉(zhuǎn)錄激活、抑制或結(jié)合蛋白質(zhì)活性[5]。

NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在植物的生命活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。擬南芥AtNAC2主要在花和根中高度表達(dá)，在擬南芥中超表達(dá)AtNAC2能夠促進(jìn)側(cè)根的發(fā)育，同時(shí)增加植株的耐鹽性，AtNAC2的超表達(dá)以及促進(jìn)側(cè)根的形成受乙烯和生長(zhǎng)素的誘導(dǎo)[6]。大豆GmNAC004通過(guò)促進(jìn)生長(zhǎng)素信號(hào)，抑制ABA信號(hào)，從而促使側(cè)根的發(fā)育[7]。此外，NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子還參與調(diào)控葉片的衰老和凋亡[8]、頂端分生組織的形成[2,9]、木質(zhì)部形成及生長(zhǎng)調(diào)節(jié)[10]、促進(jìn)次生壁的形成和增厚[11-13]。NAC類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子也參與植物對(duì)生物和非生物脅迫的防衛(wèi)反應(yīng)。小麥(Triticumaestivum)TaNAC5參與非生物逆境脅迫及相關(guān)信號(hào)分子的應(yīng)答，在小麥?zhǔn)軡B透和低溫脅迫下TaNAC5基因的表達(dá)受誘導(dǎo)并上調(diào)，而高鹽脅迫則抑制TaNAC5基因表達(dá)[13]。水稻(Oryzasativa)SNAC2過(guò)表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因水稻植株對(duì)冷和鹽脅迫的抗性，還增強(qiáng)植株對(duì)ABA的靈敏度[14]。在水稻中過(guò)量表達(dá)水稻SNAC1能通過(guò)調(diào)控保衛(wèi)細(xì)胞的閉合來(lái)增強(qiáng)水稻的抗旱性[4]，在小麥植株中表達(dá)SNAC1基因增加了小麥對(duì)ABA的敏感性，并提高了轉(zhuǎn)基因小麥對(duì)干旱和鹽堿化的耐受性[15]。

三七(Panaxnotoginseng(Burk) F.H. Chen)是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材的一顆璀璨明珠，有“南國(guó)神草”、“參中之王”等美稱(chēng)。三七主要分布在云南、廣西等地，尤其云南省文山州，主要化學(xué)成分有皂苷、多糖、氨基酸和揮發(fā)油，具有止血、活血、補(bǔ)血、抗腫瘤、降血糖、調(diào)節(jié)免疫和抗炎等作用。三七藥材的市場(chǎng)需求量逐年上升，然而三七的生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，三年生三七才能入藥，三七喜溫濕環(huán)境，生長(zhǎng)過(guò)程中極易滋生病蟲(chóng)害，尤其是根腐病、黑斑病等幾種真菌病害[16]。揭示三七的抗病機(jī)制，培育三七抗病品種，對(duì)保證三七種植業(yè)及相關(guān)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。外源茉莉酸甲酯(Methyl jasmonate，MeJA)能明顯誘導(dǎo)三七對(duì)根腐病菌茄腐鐮刀菌(Fusariumsolani)的抗性，從MeJA預(yù)處理三七受茄腐鐮刀菌侵染過(guò)程的轉(zhuǎn)錄組序列中發(fā)現(xiàn)了一個(gè)差異表達(dá)的Unigene編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子。為了揭示MeJA對(duì)三七抗病性調(diào)控的分子機(jī)制，本研究對(duì)一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的全長(zhǎng)cDNA進(jìn)行了克隆和表達(dá)特性分析。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

植物材料為一年生三七幼苗，種于昆明理工大學(xué)的遮陰大棚中。試驗(yàn)所用茄腐鐮刀菌以及人參鏈格孢(Alternariapanax)菌株由昆明理工大學(xué)國(guó)家中醫(yī)藥管理局三七資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室從三七根腐病及黑斑病病株中分離、鑒定并保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 用剪刀對(duì)正常生長(zhǎng)的一年生三七根部進(jìn)行受傷處理，然后用MeJA (100 μmol/L)和無(wú)菌水(對(duì)照) 蘸根處理三七30 min，24 h后用200 mL茄腐鐮刀菌分生孢子懸液(2×106個(gè)孢子/mL) 蘸根接種三七30 min，最后收集接種后4，12，24，48，72 h的三七根；一年生三七葉片受傷處理后接種人參鏈格孢菌絲，采集接種后2，12，24，48，72，96 h的三七葉片；分別用200 mL茉莉酸甲酯(100 μmol/L)、水楊酸(Salicylic acid，SA，200 μmol/L)、H2O2(1 mmol/L)以及乙烯利(Ethephon，ETH，1 mmol/L)溶液蘸根處理三七30 min，收集處理后4，12，24，48，72 h的三七根。所有樣品先經(jīng)液氮速凍，然后保存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 RNA提取、mRNA分離及RACE (Rapid-amplification of cDNA ends) 用TRIGene總RNA提取試劑盒(GenStar Biosolutions)提取上述各樣品中的總RNA。分別從各RNA樣品中取等量混勻，然后按照張南南等[17]的方法分離mRNA，并采用SMARTRACE cDNA Amplification Kit (Clontech，USA)分別合成5′-RACE和3′-RACE 的cDNA模板。依據(jù)MeJA預(yù)處理三七受茄腐鐮刀菌侵染過(guò)程轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)生的編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的Unigene序列，設(shè)計(jì)并合成基因特異引物。5′-RACE及3′-RACE特異引物序列分別為5′-CATCGTCGTAGTTGTGCTCGTAAACTCG-3′和 5′-TAGATGGTAAAGCTATGGCAGAAGGCAA-3′。擴(kuò)增DNA條帶經(jīng)TA克隆后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，并挑選單克隆進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 全長(zhǎng)ORF的克隆以及生物信息學(xué)分析 5′-RACE擴(kuò)增序列、3′-RACE擴(kuò)增序列和三七NAC轉(zhuǎn)錄因子Unigene序列進(jìn)行拼接，然后查找拼接序列中的最大開(kāi)放閱讀框(Open reading frame，ORF)。根據(jù)所拼接的cDNA序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)ORF的特異引物，再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)T-A克隆后測(cè)序。擴(kuò)增ORF的特異引物序列為5′-TTAATTAATCATGGGGGATAATAAT-3′和 5′-TATTGATGGGTTACACTTTTGTGAT-3′。接著對(duì)克隆所得 cDNA序列及編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，具體方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)[18]。

1.2.4 Quantitative reverse transcription-PCR (qRT-PCR) 本研究采用qRT-PCR分析三七PnNAC1的轉(zhuǎn)錄水平。三七NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的特異引物為5′-GTTGTGCTCGTAAACTCGACAGAC-3′和5′-ATATAGGCTTTGGCATGGTACTGG-3′。內(nèi)參基因選擇、qRT-PCR反應(yīng)體系、程序以及相對(duì)表達(dá)水平的計(jì)算等參照陳瑞等[19]的qPCR方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七PnNAC1全長(zhǎng)cDNA的克隆

根據(jù)前期研究中三七轉(zhuǎn)錄組測(cè)序產(chǎn)生的編碼NAC轉(zhuǎn)錄因子的EST序列，通過(guò)快速擴(kuò)增cDNA末端技術(shù)擴(kuò)增獲得該EST的全長(zhǎng)cDNA序列。RACE的結(jié)果見(jiàn)圖1，序列測(cè)定結(jié)果顯示NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的5′-RACE產(chǎn)物長(zhǎng)511 bp，3′-RACE產(chǎn)物長(zhǎng)為633 bp。經(jīng)過(guò)序列拼接獲得NAC轉(zhuǎn)錄因子基因的全長(zhǎng)cDNA序列長(zhǎng)為815 bp，其中包含一個(gè)長(zhǎng)度為576 bp的ORF、24 bp 5′-UTR (Untranslated region)以及215 bp 3′-UTR。ORF編碼的蛋白質(zhì)由191個(gè)氨基酸殘基組成。根據(jù)拼接的全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)并合成特異性引物，成功擴(kuò)增出了576 bp的全長(zhǎng)ORF (圖1)。后續(xù)序列分析結(jié)果表明該基因編碼NAC蛋白，因此將該基因命名為PnNAC1 (GenBank登錄號(hào)KX530029)。

M.DL2000標(biāo)記；1.5′-RACE擴(kuò)增結(jié)果；2.3′-RACE擴(kuò)增結(jié)果；3.PnNAC1基因全長(zhǎng)ORF的擴(kuò)增結(jié)果。M. DL2000 Marker；1.Amplification result of 5′RACE；2.Amplification result of 3′RACE；3.Amplification result of ORF of PnNAC1.

2.2 序列分析、多重序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

BlastN分析結(jié)果顯示，三七PnNAC1的第25-405位核苷酸序列與馬鈴薯(Solanumtuberosum)StNAC25 (XM015310658.1)的第250-627位核苷酸序列的相似性為80%。PnNAC1 ORF編碼的蛋白質(zhì)序列與芝麻(Sesamumindicum) SiNAC25 (XP_011092697.1)、可可(Theobromacacao) TcNAC (XP007043034.1)和StNAC25 (XP_015166144.1)的同源性較高，分別為75%，74%和74%。PnNAC1與StNAC25、煙草(Nicotianatomentosiformis) NtNAC25 (XP_009622295.1)、大豆(Glycinemax) GmNAC56(XP_003531559.1)的多重序列比對(duì)見(jiàn)圖2。PnNAC1編碼的蛋白質(zhì)序列與其他3種植物的NAC轉(zhuǎn)錄因子高度相似，其中一些堿性氨基酸(R、K、H)和酸性氨基酸(D、E)殘基高度保守。在幾個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子的C端分布較多的酸性氨基酸，堿性氨基酸則主要集中于N端。

使用MEGA6軟件對(duì)11個(gè)NACs以及PnNAC1蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。如圖3所示，所選NAC轉(zhuǎn)錄因子聚類(lèi)為兩大支，Group Ⅰ和Group Ⅱ。PnNAC1與StNAC25、NtNAC25、GmNAC56、LOC Os04g35660.1和LOC Os02g34970.1屬于Group Ⅰ，包括AT2G02450.1在內(nèi)的另外6個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子屬于Group Ⅱ。Group Ⅰ又分為兩小支，PnNAC1與StNAC25、NtNAC25、GmNAC5位于同一小支，LOC Os04g35660.1和LOC Os02g34970.1聚為另一小支，可見(jiàn)PnNAC1與StNAC25和NtNAC25具有更高的同源性。

黑色倒三角標(biāo)識(shí)的是保守的酸性氨基酸；星號(hào)標(biāo)識(shí)的是保守的堿性氨基酸；黑色下劃線是預(yù)測(cè)的可能的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域。The conserved amino acid acid residues were labelled with black triangle；The conserved basic amino acid residues were labelled with asterisk；The putative DNA binding domain was underlined.

圖3 PnNAC1與一些植物NACs的進(jìn)化樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic tree of the deduced amino acid sequence of PnNAC1 and some plant NACs

2.3PnNAC1編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及信號(hào)肽預(yù)測(cè)

利用ProtParam在線工具對(duì)PnNAC1的理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示PnNAC1的分子量約為22.13 kDa，等電點(diǎn)約為5.08。PnNAC1蛋白由191個(gè)氨基酸殘基組成，富含Asp (19，9.9%)、Leu ( 16，8.4%)、Ser (16，8.4%)、Gly (14，7.3%)，此外，有29個(gè)氨基酸殘基(Asp+Glu)帶負(fù)電，21個(gè)氨基酸殘基(Arg+Lys)帶正電。PnNAC1蛋白在酵母和大腸桿菌中的半衰期分別大于20 h和10 h。SignalP 4.1分析結(jié)果表明PnNAC1中不存在信號(hào)肽。此外，PredictProtein分析結(jié)果顯示該蛋白在植物細(xì)胞中定位于細(xì)胞核中，PnNAC1編碼的蛋白質(zhì)可能為核內(nèi)蛋白。

2.4PnNAC1編碼蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

根據(jù)PredictProtein分析結(jié)果，PnNAC1蛋白結(jié)構(gòu)中含有α-螺旋(H)、β-折疊(E)以及無(wú)規(guī)則卷曲(L)這3種二級(jí)結(jié)構(gòu)，且它們的百分比分別為5.24%，21.99%和72.77%。蛋白質(zhì)功能在很大程度上取決于蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)。PnNAC1與水稻SNAC1 (Stress-responsive NAC1，3ULX)的一級(jí)結(jié)構(gòu)相似，以水稻SNAC1為模板預(yù)測(cè)PnNAC1的三級(jí)結(jié)構(gòu)。PnNAC1的三維結(jié)構(gòu)二聚體模型如圖4所示，主要特征為幾個(gè)螺旋環(huán)繞一個(gè)由反向平行β-折疊組成的桶狀結(jié)構(gòu)。

2.5PnNAC1的表達(dá)特性分析

MeJA預(yù)處理明顯增強(qiáng)了PnNAC1在三七根中的轉(zhuǎn)錄水平，接種茄腐鐮刀菌后PnNAC1的表達(dá)量繼續(xù)上升，4 h表達(dá)量最高，約為無(wú)菌水預(yù)處理對(duì)照的28倍，4 h后PnNAC1的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降。對(duì)照(無(wú)菌水預(yù)處理三七)接種茄腐鐮刀菌后PnNAC1的表達(dá)量迅速上升，與接種前相比，4 h轉(zhuǎn)錄水平增加了16倍，之后表達(dá)量開(kāi)始降低(圖5)。人參鏈格孢是三七黑斑病的致病菌，人參鏈格孢接種三七葉片后96 h內(nèi)，PnNAC1的表達(dá)水平不同程度地受到抑制(圖5)。

圖4 PnNAC1二聚體的三維結(jié)構(gòu)模型Fig.4 The putative 3D structure of dimer of PnNAC1

分別用4種信號(hào)分子MeJA、ETH、H2O2、SA處理三七均會(huì)迅速誘導(dǎo)三七根中PnNAC1的轉(zhuǎn)錄水平，只是PnNAC1受這4種信號(hào)分子的誘導(dǎo)程度不同(圖6)。MeJA處理三七后，PnNAC1的轉(zhuǎn)錄水平升高，與對(duì)照相比處理后24 h轉(zhuǎn)錄水平增加了14倍，之后表達(dá)量持續(xù)下降，至72 h，其表達(dá)量仍高于對(duì)照。ETH處理三七后的4 h時(shí)，PnNAC1的表達(dá)量達(dá)到最高，約為處理前的4倍，隨后表達(dá)量開(kāi)始下降，在12～48 h又開(kāi)始上升，48 h以后表達(dá)量下降到處理前的3倍。H2O2處理三七后24 h內(nèi)，PnNAC1表達(dá)量持續(xù)上升，在24 h時(shí)達(dá)到最高，約為處理前的7.5倍，然后其表達(dá)量又開(kāi)始持續(xù)下降，到72 h時(shí)的表達(dá)量只到處理前的1.5倍左右。三七根部受SA處理后4 h，PnNAC1的表達(dá)量達(dá)到最高，約為處理前的5倍，隨后表達(dá)量下降。綜上所述，PnNAC1在轉(zhuǎn)錄水平響應(yīng)茄腐鐮刀菌、人參鏈格孢的侵染以及外源MeJA、ETH、H2O2、SA處理，在三七應(yīng)對(duì)幾種真菌病害的防御過(guò)程中PnNAC1可能起重要作用。

圖5 茄腐鐮刀菌和人參鏈格孢侵染過(guò)程PnNAC1的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平Fig.5 The relative transcription levels of PnNAC1 during F.solani and A. panax infection

圖6 茉莉酸甲酯、乙烯利、過(guò)氧化氫和水楊酸處理后PnNAC1的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平Fig.6 The relative transcription of PnNAC1 after treatment by MeJA，ETH，H2O2 and SA

3 討論

三七是我國(guó)特有的名貴中藥材，隨著三七原藥材的需求量和種植面積逐年上漲，三七栽培過(guò)程中連作障礙和病蟲(chóng)危害等問(wèn)題也日益受到關(guān)注。三七需在遮陰網(wǎng)下栽培，喜陰濕環(huán)境，病害多發(fā)，尤其是根腐病和黑斑病，嚴(yán)重影響了三七藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)。本研究從三七中分離了一個(gè)參與根腐病和黑斑病防衛(wèi)反應(yīng)的NAC轉(zhuǎn)錄因子基因，PnNAC1。PnNAC1的全長(zhǎng)cDNA序列為815 bp，編碼一個(gè)由191個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，分子量約為22.13 kDa，等電點(diǎn)約為5.08。進(jìn)化樹(shù)分析表明PnNAC1編碼的蛋白質(zhì)屬于Group Ⅰ。NAC是植物中一類(lèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，其N(xiāo)端相對(duì)保守，而C端的氨基酸殘基高度多變[20]。PnNAC1與幾個(gè)來(lái)自其他植物的NAC轉(zhuǎn)錄因子的序列比對(duì)結(jié)果表明，C端有2個(gè)部位高度可變，一個(gè)是絲氨酸(S)富含區(qū)，另一個(gè)是天冬氨酸(D)富含區(qū)。

NAC轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受多種不同環(huán)境因素及植物自身發(fā)育時(shí)期的誘導(dǎo)，在不同植物不同時(shí)期以及不同組織中表達(dá)程度存在差異。擬南芥中NAC1在根、莖、葉中表達(dá)水平各不相同，根中表達(dá)水平最高，在莖和葉中表達(dá)水平相對(duì)較低[9]。SbNAC0584參與了高粱(Sorghumvulgare)的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，在各個(gè)組織(根系、氣生根、葉片、穗、莖、旗葉)中均有表達(dá)，但SbNAC0584在高粱氣生根和旗葉中的表達(dá)量相對(duì)較高，其次是在根中，而在高粱莖和穗中的表達(dá)量相對(duì)較低[21]。擬南芥中，ANAC019和ANAC055基因能夠激活JA誘導(dǎo)基因LOX2 (Lipoxygenase2)和VSP1 (Vegetativestorageprotein1)的轉(zhuǎn)錄，從而提高植株抗病能力[22]。致病疫霉(Phytophthorainfestans)侵染馬鈴薯后，顯著誘導(dǎo)了StNAC2的表達(dá)[23]。水稻接種稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)后，ONAC122和ONAC131表達(dá)受誘導(dǎo)[24]。水稻OsNAC19的表達(dá)響應(yīng)外源MeJA、ABA和ETH的誘導(dǎo)，且更易于被MeJA所誘導(dǎo)[25]。本研究qRT-PCR結(jié)果顯示，茉莉酸甲酯預(yù)處理三七根部大幅提高了PnNAC1在根中的轉(zhuǎn)錄水平，接種茄腐鐮刀菌后，PnNAC1的表達(dá)進(jìn)一步上升，在接種后4 h轉(zhuǎn)錄水平達(dá)最大值；無(wú)菌水預(yù)處理的三七中，PnNAC1也快速響應(yīng)茄腐鐮刀菌的侵染，但表達(dá)水平明顯低于茉莉酸甲酯預(yù)處理的樣品。而接種人參鏈格孢后PnNAC1在葉片的表達(dá)量受抑制。茉莉酸甲酯、乙烯利、水楊酸和過(guò)氧化氫4種信號(hào)分子處理三七根部均明顯誘導(dǎo)PnNAC1的轉(zhuǎn)錄水平，暗示PnNAC1可能通過(guò)這些信號(hào)通路介導(dǎo)三七對(duì)茄腐鐮刀菌、人參鏈格孢等生物脅迫的防衛(wèi)機(jī)制。

NACs是一類(lèi)多功能蛋白，不僅調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育，還參與植物的自身免疫過(guò)程。上述結(jié)果表明，在三七應(yīng)對(duì)幾種真菌病害的防衛(wèi)反應(yīng)中PnNAC1可能起重要作用，因此有必要對(duì)其功能及生物學(xué)活性進(jìn)行深入研究。下一步我們將驗(yàn)證PnNAC1的反式激活能力，并驗(yàn)證PnNAC1的生物學(xué)功能。

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Cloning and Expression Analysis of a NAC Transcription Factor GenePnNAC1 fromPanaxnotoginseng

WANG Guodong，LI Jinjing，BAI Zhiwei，GUAN Ruipan，YANG Ye，QU Yuan，CUI Xiuming，LIU Diqiu

(Faculty of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China)

To reveal the regulatory mechanism of defense response inPanaxnotoginseng(Burk) FH Chen against diseases，a NAC transcription factor gene was cloned fromP.notoginseng，and its expression pattern was analyzed in the present study. One year oldP.notoginsengseedlings were used as materials. According to an Unigene fromP.notoginsengtranscriptome which encoded a NAC transcription factor，the gene-specific primers were designed. Using the rapid amplification of cDNA end technology，a new NAC transcription factor gene ofP.notoginsengwas obtained which was namedPnNAC1. The cDNA sequence ofPnNAC1 was 815 bp in length and contained an intact open reading frame (ORF) of 576 bp，a 24 bp 5′-untranslated region (UTR)，and a 215 bp 3′-UTR. The ORF ofPnNAC1 encoded a putative protein with 191 amino acid residues which had a conserved NAC domain. Real-time PCR results indicated that pre-treatment with methyl jasmonate to roots ofP.notoginsengseedlings increased the transcription level ofPnNAC1 in roots，then the transcription level ofPnNAC1 was further risen after inoculation withFusariumsolani，and its expression level was maximal at 4 h post inoculation withF.solani. For the control (pretreatment with sterile water)，PnNAC1 also rapidly responded to infection ofF.solani，but its expression level was evidently lower than that in samples which were pre-treated with methyl jasmonate. Moreover，the expression ofPnNAC1 was inhibited in the leaves after inoculation withAlternariapanax. Furthermore，the transcription level ofPnNAC1 was induced by treatment with four kinds of signaling molecules including methyl jasmonate，ethylene，salicylic acid，and hydrogen peroxid. The above results suggest thatPnNAC1 responds to several stress-related signaling molecules and is involved in the defense response ofP.notoginsengagainst the infection ofF.solaniandA.panax.

Panaxnotoginseng；NAC transcription factor；Fusariumsolani；Alternariapanax；Defense response

2017-07-06

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81560610)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2014FA003)

王國(guó)東(1993-)，男，云南普洱人，主要從事生物工程研究。

劉迪秋(1979-)，女，湖北建始人，教授，博士，主要從事植物抗病基因工程研究。

S567.03;Q78

A

1000-7091(2017)04-0091-07

10.7668/hbnxb.2017.04.015