向日葵核心種質資源基礎類群劃分研究

郭樹春，張艷芳，孫瑞芬，李素萍，于海峰，劉臘青，王洪波，安玉麟

(1.內蒙古大學 物理科學與技術學院，內蒙古 呼和浩特 010010；2.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031；3.和林格爾縣黑老夭鄉農技推廣綜合服務站，內蒙古 呼和浩特 011500；4.鄂爾多斯生態環境職業學院，內蒙古 鄂爾多斯 017010)

向日葵核心種質資源基礎類群劃分研究

郭樹春1,2，張艷芳2，孫瑞芬2，李素萍2，于海峰2，劉臘青3，王洪波4，安玉麟2

(1.內蒙古大學 物理科學與技術學院，內蒙古 呼和浩特 010010；2.內蒙古自治區農牧業科學院，內蒙古 呼和浩特 010031；3.和林格爾縣黑老夭鄉農技推廣綜合服務站，內蒙古 呼和浩特 011500；4.鄂爾多斯生態環境職業學院，內蒙古 鄂爾多斯 017010)

向日葵是一種重要的油料作物，同時也是一種潛在的能源植物，其核心種質資源基礎類群的劃分可為向日葵遠緣雜交提供理論依據。采用形態學標記與RAPD標記相結合的方法，利用UPGMA聚類法對50份向日葵核心種質資源材料親緣關系進行了深入研究。形態學標記法結果顯示，50份供試種質資源可分為三大類群，其中第Ⅰ類群27份種質，第Ⅱ類群22份種質，第Ⅲ類群只包含1份種質，進一步研究表明，供試種質資源的種質地理分布以及用途與聚類結果關聯性較強。同時，分子標記的UPGMA聚類結果也驗證了上述結論；RAPD分子標記聚類法也將供試材料分為三大類群，其中第Ⅰ類群26份種質，第Ⅱ類群23份種質，第Ⅲ類群包含1份種質，形態學與RAPD聚類結果的吻合率為96.30%；形態學標記結果與RAPD標記分類結果可靠。

向日葵；形態學；RAPD；類群劃分

向日葵(HelianthusannuusL.)是一種集觀賞、藥用、油用于一身的優良資源植物[1-2]，其具有耐鹽堿、耐干旱、耐瘠薄、適應性強的特點，特別適合在我國西部干旱少雨地區栽培種植[3]。20世紀70年代法國人用向日葵雄性不育系三系配套技術育成雜交種[4-5]，我國20世紀80年代開始從國外引進向日葵雜交種。目前，遠緣雜交在向日葵育種中占據重要地位，種質資源基礎類群劃分是實現遠緣雜交的基礎，因而很多學者開始運用分子標記技術對向日葵種植資源類群劃分進行了深入研究[6-7]，從而揭示向日葵種質資源間的親緣關系，尋找產量、抗性、品質與基因的對應關系，提高向日葵育種的準確性，并為育種材料的深入研究提供依據。

自從20世紀80年代向日葵雜交種在得到大面積推廣、應用以來，我國乃至其他國家收集了豐富的向日葵種質資源，并提出了核心種質(Core collection)理念，其有效促進了種質資源利用與發掘重要基因的效率。目前，可利用已建立向日葵的核心種質為多元化向日葵育種打下良好基礎，對選育高產、優質、抗逆向日葵新品種具有重要的現實意義。向日葵種質資源蘊藏產量基因、品質基因及抗性基因是現代多元化向日葵育種的物質基礎，為了促進有利基因發掘及其在生產上有效利用，對其種質資源進行系統評價顯得十分重要，也是向日葵研究的先決條件，可減少親本選配的盲目性進而提高育種工作的預見性和準確性。運用傳統手段與生物技術結合的方法辨識資源親緣關系在常規育種中尤為常見，特別是形態學標記與分子標記技術結合的方法對向日葵核心種質資源類群劃分已成為向日葵育種的應用典范，本研究采用了形態學標記與RAPD相結合的方法，運用聚類分析對50份向日葵種質材料的基礎類群進行了劃分研究，將50份核心向日葵種質資源材料分為4個基礎類群，并對其與地理分布的關系做了進一步分析，該研究結果可直接指導向日葵育種，并為優良基因的挖掘提供有價值的信息。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

本試驗在內蒙古農牧業科學院完成，參試種質是內蒙古農牧業科學院從國內外收集的50份向日葵核心資源材料，包含：25份恢復系、10份不育系、15份自交系(表1)。

表1 50份參試向日葵材料Tab.1 50 sunflower germplasms in the study

1.2 試驗方法

1.2.1 形態學標記分析 將50份材料3次重復種植，每份材料重復種60株，并保持各重復的培養條件(光照、溫度、濕度等)相同，并分階段對其不同性狀進行調查統計，調查性狀包括：出苗期、現蕾期、莖粗、株高、花盤的直徑、形狀、傾斜度，葉片的數量、大小、粒型、粒色、產量等。

1.2.2 RAPD分子標記分析 挑選飽滿度、大小一致的各參試向日葵種子播種在營養缽中，播種深度2～3 cm，每缽播種10～12粒，設3個重復，每缽澆水50～100 mL，在光照培養箱中培養，每天定時澆水1～2次，保持營養缽表面土壤濕潤為宜，出苗后保留每缽5～6株整齊一致的向日葵幼苗待用。

從每份制備好的材料中選擇3～5個生長良好的向日葵幼苗，取幼嫩葉片提取DNA(提取方法參考Plant Genomic DNA Kit產品說明)。各樣品DNA用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后保存在-70 ℃超低溫冰箱。RAPD反應體系優化結果：體系大小20 μL；2×Taq MasterMix 10 μL；引物(10 μmol/L)2 μL；植物總DNA(20 ng/μL)100 ng；ddH2O 3 μL[8-9]；PCR擴增程序(RAPD)：95 ℃預變性4 min；94 ℃變性40 s，38 ℃退火90 s，72 ℃延伸70 s，40個循環；72 ℃ 10 min[10-11]。

本試驗選用的RAPD引物共100條，經篩選得到19條特異性好的引物作為向日葵RAPD標記特異引物，序列信息見表2。

表2 篩選出的RAPD引物序列及擴增結果 Tab.2 The RAPD sequences and results of selected primers

1.3 數據統計分析

根據形態學性狀調查的數據，采用SPSS軟件，利用歐氏距離法對50份核心資源材料進行UPGMA聚類分析[12]。根據RAPD擴增結果，同一引物的擴增產物中電泳遷移率一致的條帶被認為具有同源性，本試驗分別以DL1200和DL500為標準分子量標記，對照反應物在瓊脂糖凝膠上的位置，按照相同遷移率位置上有擴增帶記為1無帶記為0的方法記錄電泳譜帶，并建立0、1矩陣，該過程由Quantity one軟件完成[13]，本試驗中3次重復都出現的條帶記為1，否則記為0。

條帶多態性計算方法：

相異性系數與聚類分析方法：相異系數與聚類分析均采用SPSS分析軟件進行分析，以RAPD條帶為基礎建立的0，1矩陣計算Jaccard相異系數[14]，公式如下：Jij=a/(n-d)，a為i品種和j品種的多態性條帶數之和，n為RAPD總帶數，d為i和j品種都記為0的帶數。然后用非加權配對算術平均聚類方法(UPGMA)對其進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 形態學標記分析結果

為研究參試向日葵種質資源在形態學上的親緣關系，采用SPSS軟件，利用12個性狀的田間調查結果計算50份種質間的遺傳距離。經計算50份種質的遺傳距離為8.00～360.11，均值為123.13，可見參試種質在形態學性狀上具有較廣泛的變異，形態多樣性較豐富。在種質間的遺傳距離中，以種質17(T785)與24(T837)間的最大，為306.11；遺傳距離最小的是種質3(T364)與2(T361)，為8.25。根據12個形態學性狀計算種質間的遺傳距離，對50份種質進行聚類分析，將供試種質分為三大類群(圖1)。

圖1 基于形態學性狀的向日葵種質聚類圖Fig.1 The dendrogram of sunflower germplasms on morphological characteristics

第Ⅰ類群(共27份材料、2個亞類)：

第一亞類(13份材料)包括種質1：T649；13：T702；16：T752；22：T824；12：T717；18：T764；7：T676；8：T682；48：T1295；14：T736；15：T740；17：T758；24：T837。

第二亞類(14份材料)包括種質2：T361；3：T364；6：T663；19：T794；25：T933；23：T827；4：T366；5：T660；20：T796；21：T810；9：T700；10：T707；11：T710；47：T1269。

第Ⅱ類群(共22份材料)：

第一亞類(11份材料)包含種質27：T22；29：T38；36：T590；35：T232；41：T2；39：T594；44：T11；33：T192；43：T8；38：T593；46：T18。

第二亞類(11份材料)包含種質28：T37；31：T42；30：T41；37：T592；49：T1484；32：T191；34：T231；42：T3；45：T16；50：赤葵2號；40：T595。

第Ⅲ類群只有種質26：T21。

結果表明，形態學聚類與參試種質的地理來源關系密切，第Ⅰ類群(27份種質資源材料)主要是來自國外的一些材料，其中第一類亞類(13份材料)包含：以色列的8份(12、13、14、15、16、17、18、24)，美國的3份(1、7、8)；第二亞類(14份材料)包括：以色列4份(9、10、11、23)，美國的6份材料(2、3、4、5、6、25)，其余6份為國內材料。第Ⅱ類群(22份材料)均為國內的材料。第Ⅲ類群(1份材料)：26為國內材料，詳細信息見表3。

表3 形態學聚類向日葵種質地理來源分析Tab.3 Analysis of sunflower origin on morphological characteristics

2.2 RAPD分子標記分析結果

利用篩選出的19條引物對50份向日葵基因組DNA進行PCR擴增，19條引物共擴增出150條DNA條帶，每個引物擴增的條帶數在4～11條，平均每個引物產生7.42條，擴增出的DNA條帶的大小在300～1 200 bp。進一步分析表明，在擴增的150條帶中，多態性條帶數為123條，占總條帶的82.00%，表明試用材料的遺傳多樣性豐富，可作為雜交育種的核心資源庫(圖2)。

編號見種質名稱表1；M.100 bp Ladder。See number of germplasm in Tab.1;M.100 bp Ladder.

為研究參試向日葵種質資源在分子水平的遺傳關系，采用SPSS軟件，利用19條RAPD引物計算了50份種質間的遺傳距離。這些種質資源的遺傳距離為0.812～0.241，均值為0.563，可見參試種質在分子水平上遺傳差異較大，從而驗證了各材料多態性研究結果。在種質間的遺傳距離中，種質16(T752)與24(T837)間的遺傳距離最大，為0.812；種質6(T663)和種質5(T660)遺傳距離最小，為0.241。根據19條RAPD引物計算得到的種質間遺傳距離，對50份種質進行聚類分析，供試種質可分為三大類群(圖3)。

圖3 RAPD標記遺傳聚類圖Fig.3 The dendrogram of sunflower germplasms on RAPD markers

RAPD聚類結果顯示，第Ⅰ類包括26份種質資源材料：

第一亞類(3份材料)包含種質1：T649；22：T824；48：T1295。

第二亞類(23份材料)包含種質2：T361；3：T364；12：T717；13：T720；15：T740；16：T752；14：T736；9：T700；10：T707；47：T1269；6：T663；7：T676；18：T764；21：T810；8：T682；24：T837；19：T794；20：T796；25：T933；17：T758；23：T827；4：T366；5：T660。

第Ⅱ類(包括23份材料)：

第一亞類(19份材料)包含種質26：T21；28：T37；29：T38；30：T41；31：T42；32：T191；40：T595；37：T592；41：T2；50：赤葵2號；42：T3；45：T16；34：T231；35：T232；39：T594；27：T22；46：T18；33：T192；43：T8。

第二亞類(4份材料)包含種質36：T590；38：T593；44：T11；49：T1484。

第Ⅲ類(包括1份材料)包含種質11：T710。

RAPD聚類與參試種質的地理來源也密切相關，第I類群(共26份)主要是來自國外的一些材料，其中包含：美國的9份種質(1、2、3、4、5、6、7、8、25)，以色列的11份種質(9、10、12、13、14、15、16、17、18、23、24)，其余6份為國內種質；第Ⅱ類群(共23份)均為我們收集的國內的種質資源材料，第Ⅲ類群是以色列種質T710(表4)。

表4 RAPD聚類向日葵種質地理分布分析Tab.4 Analysis of sunflower origin on RAPD

2.3 形態標記結果與RAPD標記結果的比較分析

從聚類分析來看，形態學性狀與RAPD標記的遺傳關系基本一致。2種方法根據遺傳距離分別把50份向日葵種質資源劃分為三類，在第Ⅰ類群中只有11號種質是不同的，第Ⅱ類群全部相同。為進一步研究形態標記和RAPD標記之間的關系，綜合考慮聚類圖特點和適宜的分組數，本研究把2種方法的聚類結果劃分為4組，將2種聚類結果進行比較時，首先選擇吻合率最大的2個組進行比較，然后在剩余的組中再選擇吻合率最大的比較，依此類推，從表5中可以看出，形態標記與RAPD標記吻合率達到90%以上，而且材料較多的前2組之間的吻合率達96.30%和95.65%，并且前兩類的聚類結果和地理分布有密切的關系。

表5 形態標記和RAPD標記聚類結果比較Tab.5 The comparation between morphological characteristics and RAPD

3 討論與結論

本研究采用了形態學標記與RAPD分子標記相結合的方法，運用聚類分析工具UPGMA對50份向日葵種質材料的基礎類群進行了劃分。采用形態標記方法對參試種質的12個形態學性狀進行聚類，結果表明：50份種質的遺傳距離為8.00～360.11，其可分為三大類群：第Ⅰ類群27份種質，第Ⅱ類群22份種質，第Ⅲ類群只包含1份種質，聚類結果與種質的地理分布有密切聯系。利用RAPD技術，得到19條多態性高、重復性好的引物共擴增出150條特異帶，其中有123條多態性條帶，占82.00%，種質間遺傳距離在0.812～0.241。UPGMA聚類結果顯示，供試種質可分為三大類群：第I類群共有26份種質，第Ⅱ類群23份種質，第Ⅲ類群1份種質，且聚類結果也與地理分布有相關性。進一步研究發現形態學與RAPD吻合率高達96.30%，形態學標記與RAPD標記的聚類結果基本一致。

從上述結果可知，形態學方法雖然是一種最古老的類群劃分方法，它簡單、直觀、容易獲得，具有不可替代的作用，但是它的均一性和穩定性容易受到環境條件和發育時期的影響[15-16]。本研究利用形態學標記方法對50份核心向日葵資源材料進行基礎類群劃分，經計算50份種質的遺傳距離在8.00～360.11，50份種質可分為三大類群。RAPD標記穩定性好，不受環境影響，缺點是難以區分雜合和純合基因型，而且容易受到反應條件的影響，重復性較差，但可以通過固化反應條件得到解決，已經成為植物種質資源研究的重要手段[17]。RAPD分子標記方法在本研究中對供試材料的類群劃分結果顯示，篩選出的19條引物共擴增出150條DNA帶，每個引物擴增的條帶數在4～11條，平均每個引物產生7.42條，擴增出的DNA條帶大小在300～1 200 bp。分析表明，在擴增的150條帶中，多態性條帶數為123條，占總條帶的82.0%，UPGMA方法聚類結果顯示50份向日葵核心資源可分為三大類群[18-20]，將2種方法的結果綜合分析可以有效降低因其自身缺陷造成的誤差，將分析供試材料分為4個基礎類群。

綜上所述，通過對向日葵核心種質資源的類群劃分研究，可以為選育優良品種以及對各資源特定性狀改良打下基礎。我國向日葵品種資源比較豐富，利用傳統標記方法和分子標記方法對向日葵核心資源庫遺傳多樣性進行分析，并且得到一批穩定性好且具有豐富多態性的RAPD標記，通過對2種方法的比較發現，向日葵種質資源的親緣關系和地理分布具有緊密聯系，因而地理分布可作為雜交育種親本選擇的一個依據，并且2種方法的結果一致性較好，形態學標記和RAPD標記可以作為研究類似問題的核心方法。

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Analysis of Classification and Genetic Relationship among Core Sunflower Germplasm Resources

GUO Shuchun1,2，ZHANG Yanfang2，SUN Ruifen2，LI Suping2，YU Haifeng2，LIU Laqing3，WANG Hongbo4，AN Yulin2

(1.School of Physical Science and Technology，Inner Mongolia University，Huhhot 010010，China；2.Inner Mongolia Academy of Agricultural and Animal Husbandry Sciences，Huhhot 010031，China；3.Helingeer Heilaoyao Township Agricultural Extension Service Station，Huhhot 011500，China；4.Ordos Vocational College of Eco-environment，Ordos 017010，China)

Sunflower is one of most important oil crops,and is also a kind of potential ornamental plants. Analysis of classification among the core sunflower germplasm resources is helpful for utilizing hetero.Morphological characteristics and RAPD markers were employed in detecting the genetic diversity among 50 sunflower germplasm resources with UPGMA method. The genetic diversity among the resources was revealed by cluster analysis on morphological characteristics. Clustering analysis indicated that the germplasms could be divided into three groups：27 germplasms were classified into group Ⅰ；group Ⅱ had 22 germplasms and group Ⅲ had 1 germplasm.Clustering analysis on morphological characteristics was associated with geological distribution.Furthermore，the results of RAPD cluster indicated that the germplasms could be divided into three groups，which were confirmed by the result of morphological characteristics cluster.The germplasms could be divided into three groups：26 germplasms were classified into group Ⅰ;group Ⅱ had 23 germplasms；group Ⅲ had 1 germplasm. Coincidence rate between morphological characteristics and RAPD was 96.30%. The results of the morphology and RAPD were identical.

Sunflower；Morphological characteristics；RAPD；Classification

2017-06-01

國家向日葵產業技術體系項目(CARS-16)；內蒙古農牧業科學院創新基金項目(2013CXJJN06)

郭樹春(1981-)，男，內蒙古烏蘭察布人，助理研究員，博士，主要從事生物信息學研究。

安玉麟(1954-)，男，內蒙古包頭人，研究員，主要從事作物遺傳育種研究。

S595.5

A

1000-7091(2017)04-0107-07

10.7668/hbnxb.2017.04.018