不同TNM分期肝癌患者微血管密度與腫瘤標志物水平相關性研究

黨存曙 劉大鵬 趙孟杰 劉志春 楊明

·論著·

不同TNM分期肝癌患者微血管密度與腫瘤標志物水平相關性研究

黨存曙 劉大鵬 趙孟杰 劉志春 楊明

目的探討不同TNM分期肝癌患者微血管密度(microvessel density，MVD)與腫瘤標志物水平的相關性。方法選取我院接受肝癌手術治療的患者70例，同期因外傷接受肝臟手術的患者20例，健康體檢者20例，采用免疫組織化學法檢測不同分期腫瘤組織、癌旁組織以及正常肝臟組織中的MVD水平，采用酶聯免疫分析法(ELISA)檢測血清甲胎蛋白(AFP)、惡性腫瘤特異性生長因子(TSGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)水平。結果與正常肝臟組織比較，腫瘤組織及癌旁組織中MVD水平較高，且腫瘤組織高于癌旁組織(P<0.05)；腫瘤組織中MVD水平隨TNM分期增高而增加，且不同分期間比較差異有統計學意義(P<0.05)；與健康體檢者比較，肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平明顯較高(P<0.05)；肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平隨TNM分期增高而增加，且不同分期比較差異有統計學意義(P<0.05)；肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平分別與MVD呈正相關(r值分別為0.853,0.920,0.846，P<0.05)。結論肝癌患者腫瘤組織的MVD及腫瘤標志物AFP、TSGF、VEGF水平與臨床TNM分期有關，TNM分期越高，MVD及AFP、TSGF、VEGF水平越高，且患者血清AFP、TSGF、VEGF水平分別與MVD呈正相關關系，提示腫瘤標志物AFP、TSGF、VEGF水平與肝癌侵襲、轉移能力有關。

肝腫瘤；TNM分期；微血管密度；腫瘤標志物；相關性

原發性肝癌(PHC)是中年男性人群常見的惡性腫瘤，其發生與酒精、病毒性肝炎、肝硬化、黃曲霉素等化學致癌物質、水土環境等因素有關，病理類型以肝細胞癌最為常見，占70%～85%[1,2]。統計資料顯示，我國每年約有46.61萬新發PHC患者，每年約42.21萬患者因PHC死亡[3]，并且該發病率隨著工業社會發展、人口老齡化、生活節奏改變等仍不斷增加。PHC起病隱匿、惡性程度高、進展迅速、易復發轉移，從確診開始的平均生存期僅為4個月左右，因此早期診斷、明確臨床分期，對于及時控制腫瘤生長、浸潤、轉移尤為重要。腫瘤標志物是惡性腫瘤細胞相關的特異性物質，對于PHC的早期診斷具有非常重要的意義[4]。現代研究認為，血管形成在惡性腫瘤的發展中起到重要作用，不僅能為腫瘤細胞提供營養物質，促進其生長增殖，還為腫瘤的轉移提供了路徑[5]。微血管密度(MVD)是反映惡性腫瘤生物學行為的重要參數[6]，與腫瘤生長、轉移、預后關系密切。本研究主要探討不同TNM分期肝癌患者的MVD及與腫瘤標志物水平的相關性，報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料收集自2011年5月到2013年1月在中國石油天然氣集團公司中心醫院外科接受肝癌手術治療的患者70例，男51例，女19例；年齡35～72歲，平均年齡(53.82±9.74)歲；腫瘤TNM臨床分期:Ⅰ期17例，Ⅱ期24例，Ⅲ期20例，Ⅳ期9例；術中取患者的腫瘤組織、癌旁組織作為研究標本。選取20例同期因外傷接受肝臟手術的患者，其中男15例，女5例；年齡32～73歲，平均年齡(52.63±9.28)歲，取其正常肝臟組織標本。所有組織標本常規固定、脫水、石蠟包埋，制備4 μm的組織石蠟切片備用。另外選取20例同期健康體檢者，其中男14例，女6例;年齡34～70歲，平均年齡(51.84±8.92)歲。

1.2納入與排除標準

1.2.1納入標準：符合2011年中國抗癌協會肝癌專業委員會、中國抗癌協會臨床腫瘤學協作專業委員會、中華醫學會肝病學會肝癌學組《原發性肝癌規范化病理診斷方案專家共識》關于原發性肝細胞癌的診斷標準[7]，且經術后病理學檢查確診。

1.2.2排除標準：術前接受過放療、化療或其他任何針對腫瘤治療的患者，存在手術禁忌證、無法耐受手術治療的患者，合并其他部位惡性腫瘤的患者，孕期、哺乳期女性，臨床資料不完整的患者。

1.3主要試劑與儀器鼠抗人CD34單克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術有限公司；S-P免疫組織化學試劑盒(包含試劑A：內源性過氧化物酶阻斷劑，B：正常動物非免疫血清，C：生物素標記的第二抗體，D：鏈霉菌抗生素蛋白-過氧化物酶)，購自福州邁新生物技術開發有限公司； DAB顯色試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；PBS溶液、枸櫞酸緩沖液、1%鹽酸酒精，購自南京森貝伽生物科技有限公司；人甲胎蛋白(AFP)、惡性腫瘤特異性生長因子(TSGF)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)ELISA試劑盒，購自上海仁捷生物科技有限公司；DM300徠卡光學顯微鏡，德國Leica公司產品； Freedom EVOlyzer全自動酶聯免疫分析儀，瑞士Tecan公司。

1.4研究方法受檢者于術前采集清晨空腹靜脈血5 ml。血液樣本均置于含有肝素的抗凝管中，靜置1 h，3 000 r/min離心15 min，取血清置于-20℃環境保存備用。

1.4.1免疫組織化學法檢測組織CD34表達:取出石蠟切片置于烘片機中，70℃烘烤1 h，依次進行二甲苯脫蠟、梯度濃度酒精(95%-85%-75%-65%)水化；嚴格按照S-P免疫組織化學試劑盒的說明書步驟進行操作，將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液，微波爐高溫加熱至沸騰，冷卻后再加熱，重復冷卻進行抗原修復；切片采用PBS沖洗2 min×3次，滴加50 μl試劑A，室溫孵育10 min以滅活內源性過氧化物酶；切片采用PBS沖洗2 min×3次，滴加試劑B封閉20 min；除去試劑B，滴加鼠抗人CD34單克隆抗體(1∶60稀釋)，4℃過夜；切片采用PBS沖洗2 min×3次，滴加試劑C，37℃孵育30 min；采用PBS沖洗2 min×3次，滴加50 μl試劑D，37℃孵育10 min；切片采用PBS洗滌5 min×4次，滴加DAB顯色劑顯色5 min，自來水充分沖洗終止顯色；切片一次采用蘇木素進行復染，1%鹽酸酒精分化，自來水沖洗藍化；常規脫水、透明、干燥，中性樹膠封片；在光學顯微鏡下對組織切片進行觀察、分析。

1.4.2 ELISA法檢測血清AFP、TSGF、VEGF水平:取出保存的血清樣本，按照AFP、TSGF、VEGF ELISA試劑盒的說明書步驟，采用全自動酶聯免疫分析儀檢測血清中AFP、TSGF、VEGF水平。

1.5免疫組織化學染色結果判定及MVD計數CD34主要位于血管內皮細胞膜，染色呈棕色或棕褐色，常用來標記微血管；由兩位高年資病理醫師對切片進行觀察，參照Weidner血管計數法，先在低倍光鏡(×100)下觀察，選取5個微血管染色密度最高的視野，再于高倍鏡(×400)下觀察，對5個視野內的MVD進行計數，之后取平均值作為最終結果。微血管計數標準：任何內皮細胞或細胞簇染色呈棕黃色，并且與周圍組織、血管、細胞等區別明顯，均可看作一個血管進行計數；若血管腔>8個紅細胞直徑，或血管壁具有較厚基層，或微血管位于細胞稀少區域、纖維硬化區域、炎癥區域，或微血管染色模糊，均不計數[8]。

2 結果

2.1腫瘤組織、癌旁組織及正常肝臟中MVD的差異CD34染色陽性的血管內皮細胞胞漿內散在分布棕黃色顆粒，CD34標記陽性的血管內皮作為MVD計數的血管。本研究中，正常肝臟組織CD34染色較淺，MVD水平為(5.88±0.82)；癌旁組織CD34染色主要分布于匯管區周圍肝實質內血竇，MVD水平為(16.73±2.31)；腫瘤組織CD34染色程度較深，主要分布于腫瘤周邊，形態呈點狀、線狀、竇隙狀、簇狀等，MVD水平為(33.31±4.73)。與正常肝臟組織比較，腫瘤組織及癌旁組織中MVD的水平較高，且腫瘤組織>癌旁組織，差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖1～3。

表1 腫瘤組織、癌旁組織及正常肝臟中的MVD差異

注：與腫瘤組織比較，*P<0.05；與癌旁組織比較，#P<0.05

圖1 正常肝臟組織的MVD情況(免疫組化×400)

圖2 癌旁組織的MVD情況(免疫組化×400)

2.2 不同TNM分期腫瘤組織的MVD水平比較 不同TNM分期腫瘤組織中MVD水平比較，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2，圖4～7。

圖3 腫瘤組織的MVD情況(免疫組化×400)

表2 不同TNM分期肝癌腫瘤組織MVD水平比較

注：與Ⅰ期比較,*P<0.05；與Ⅱ期比較，#P<0.05；與Ⅲ期比較，△P<0.05

圖4 TNMⅠ期腫瘤組織MVD情況(免疫組化×400)

圖5 TNMⅡ期腫瘤組織MVD情況(免疫組化×400)

2.3 肝癌患者與健康體檢者血清AFP、TSGF、VEGF水平比較 與健康體檢者比較，肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平明顯較高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表3。

圖6 TNMⅢ期腫瘤組織MVD情況(免疫組化×400)

圖7 TNMⅣ期腫瘤組織MVD情況(免疫組化×400)

表3 肝癌患者與健康體檢者血清AFP、TSGF、VEGF水平比較

2.4 不同TNM分期肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平比較 不同TNM分期肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平比較，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 不同TNM分期肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平比較

注：與Ⅰ期比較,*P<0.05；與Ⅱ期比較，#P<0.05；與Ⅲ期比較，△P<0.05

2.5 肝癌患者的MVD與血清AFP、TSGF、VEGF水平相關性 經Pearson線性相關性分析，肝癌患者的MVD與血清AFP、TSGF、VEGF水平呈正相關(r值分別為0.853,0.920,0.846,P<0.05)。見圖8～10。

圖8 肝癌患者MVD與血清AFP水平相關性(r=0.8534)

3 討論

有研究認為，腫瘤生長包括兩個階段，無新生血管形成時，腫瘤組織主要依靠彌散供氧，生長緩慢，微血管生成后，可以為腫瘤細胞生長提供必需的營養物質以及轉移路徑，腫瘤生長迅速，并且出現侵襲、轉移情況[9]，可見，腫瘤組織內微血管形成在PHC病情進展過程中起到重要作用[10]。MVD是反映腫瘤內血管形成情況的客觀指標，MVD水平與腫瘤的侵襲、轉移能力關系密切。在本研究中，我們采用CD34單克隆抗體標記血管內皮細胞，用于MVD計數，分析肝癌腫瘤組織MVD的水平。CD34抗原是表面分子唾液粘蛋白的一種，屬于糖基化Ⅰ型膜蛋白，具有促進細胞間黏附及造血細胞分化的作用，主要選擇性的表達于微血管內皮細胞。CD34抗體能夠特異性結合CD34抗原，造成微血管內皮細胞染色，有助于MVD計數[11]。

圖9 肝癌患者MVD與血清TSGF水平相關性(r=0.9203)

圖10 肝癌患者MVD與血清VEGF水平相關性(r=0.8458)

本研究結果顯示，與正常肝臟組織比較，腫瘤組織及癌旁組織中MVD水平較高，且腫瘤組織>癌旁組織(P<0.05)，提示MVD水平升高與腫瘤組織的進展程度有關。不同TNM分期腫瘤組織中MVD水平比較，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期(P<0.05)，TNM分期是根據腫瘤原發灶、區域淋巴結受累、遠處轉移情況劃分的，分期越高，腫瘤的進展程度越高，預后越差[12]，研究結果說明TNM分期不同，腫瘤組織的MVD水平不同，MVD水平越高，腫瘤侵襲、轉移能力越強，預后越差。

腫瘤標志物腫瘤是惡性腫瘤細胞相關的特異性物質，能夠用于腫瘤的篩查、早期診斷、治療效果監測、預后判斷等，AFP、TSGF、VEGF均為肝癌常見的腫瘤標志物[13]。AFP是一種酸性糖蛋白，生理情況下，主要來自胚胎的肝細胞，成人血清含量較低，而癌變的肝細胞可以產生AFP，使得其血清水平異常升高，可用于肝癌早期診斷，敏感性約70%[14]；TSGF是新型腫瘤標志物，屬于可溶性多肽類物質，主要由惡性腫瘤細胞分泌，能夠促進外周毛細血管擴增，可與AFP等聯合檢測提高診斷肝癌的精確度[15]；VEGF是作用最強的促進血管生成因子，在多種惡性腫瘤中呈高表達狀態，不僅能夠強烈刺激血管生成，為腫瘤細胞提高氧氣和營養，還能增加血管的通透性，促進腫瘤細胞進入血液循環，發生遠處轉移[16,17]。本次研究顯示，與健康體檢者比較，肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平明顯較高(P<0.05)，不同TNM分期肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平比較，Ⅰ期<Ⅱ期<Ⅲ期<Ⅳ期(P<0.05)，表明肝癌患者腫瘤標志物水平與腫瘤分期有關，AFP、TSGF、VEGF水平越高，提示腫瘤分期越高。Pearson線性相關性分析，肝癌患者MVD與血清AFP、TSGF、VEGF水平分別呈正相關(r值分別為0.853,0.920,0.846，P<0.05)，提示肝癌患者血清AFP、TSGF、VEGF水平能夠反映腫瘤內血管形成程度以及侵襲、轉移能力。

綜上所述，肝癌患者腫瘤組織的MVD及腫瘤標志物AFP、TSGF、VEGF水平與臨床TNM分期有關，TNM分期越高，MVD及AFP、TSGF、VEGF水平越高，且患者血清AFP、TSGF、VEGF水平分別與MVD水平呈正相關關系，提示腫瘤標志物AFP、TSGF、VEGF水平與肝癌侵襲、轉移能力有關，可用于肝癌患者復發、轉移的檢測以及預后評估。

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StudyonthecorrelationbetweenmicrovesseldensityandtumormarkerlevelsindifferentTNMstagesoflivercancer

DANGCunshu,LIUDapeng,ZHAOMengjie,etal.

CentralHospitalofChinaPetroleumNaturalGasGroup,Hebei,Langfang065000,China

ObjectiveTo investigate the correlation between microvessel density(MVD) and tumor marker levels in different TNM stages of liver cancer.MethodsSeventy patients with liver cancer who

surgical treatment were enrolled as liver cancer group,the other 20 patients with liver external injury who underwent surgery were enrolled as liver surgery group, moreover 20 healthy subjects were enrolled as control group,The MDA levels were detected by immunohistochemistry in tumor tissues, paracancerous tissues and normal liver tissues,and the serum levels of alpha fetoprotein (AFP),tumor specific growth factor (TSGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF) were detected by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsAs compared with those in normal liver tissues,the levels of MVD in tumor tissues and adjacent tissues were higher,moreover,which in tumor tissues were significantly higher than those in adjacent tissues (P<0.05). The levels of MVD in tumor tissues were increased with the increase of TNM stages,furthermore, there were significant differences in the levels of MVD among different stages,stageⅠ

liver cancer; TNM stages; MVD; tumor marker; correlation

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.18.001

項目來源：河北省廊坊市科技支撐計劃項目(編號：2011013036)

065000 河北省廊坊市，中國石油天然氣集團公司中心醫院(黨存曙、劉大鵬、趙孟杰、劉志春)；河北省廊坊市人民醫院(楊明)

R 735.7

A

1002-7386(2017)18-2725-05

2017-02-15)