尿培養(yǎng)標(biāo)本直接細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)的價(jià)值

王憲靈 王縛鯤 賈克然 趙會(huì)海 張海譜

·論著·

尿培養(yǎng)標(biāo)本直接細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)的價(jià)值

王憲靈 王縛鯤 賈克然 趙會(huì)海 張海譜

目的探討尿培養(yǎng)標(biāo)本采用美華MA120系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌直接鑒定及藥敏試驗(yàn)方法的可靠性和臨床應(yīng)用價(jià)值。方法住院疑似尿路感染患者送檢中段尿標(biāo)本835份，從中篩選出符合比對(duì)要求的標(biāo)本492份，分別采用經(jīng)典手工方法、常規(guī)培養(yǎng)法和直接方法(美華MA120系統(tǒng))進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，以經(jīng)典手工方法為標(biāo)準(zhǔn)，分析直接方法細(xì)菌鑒定的正確率、未鑒定率及錯(cuò)誤率，藥敏試驗(yàn)的正確率、有誤差率及錯(cuò)誤率，并與常規(guī)培養(yǎng)法相比較。結(jié)果492份標(biāo)本共檢測(cè)到革蘭陰性桿菌369株，革蘭陽性球菌123株。常規(guī)培養(yǎng)法鑒定細(xì)菌的正確率為88.82% (437/492)、未鑒定率為6.91%(34/492)、錯(cuò)誤率為4.27%(21/492)；直接法鑒定的正確率為85.37%(420/492)、未鑒定率為10.16%(50/492)、錯(cuò)誤率為4.47%(22/492)，兩種方法細(xì)菌鑒定結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。常規(guī)培養(yǎng)法與直接法的革蘭陰性桿菌的藥敏試驗(yàn)正確率分別為94.04%和93.13%，有誤差率分別為4.12%和4.01%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但常規(guī)培養(yǎng)法的平均錯(cuò)誤率1.84%明顯低于直接方法的平均錯(cuò)誤率2.85%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。常規(guī)培養(yǎng)法與直接法的革蘭陽性球菌的藥敏試驗(yàn)正確率分別為92.89%和86.79%，有誤差率分別為5.39%和9.65%，錯(cuò)誤率分別為1.73%和3.56%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論應(yīng)用美華MA120對(duì)尿培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行直接鑒定及藥敏試驗(yàn)時(shí)，細(xì)菌鑒定及革蘭陰性桿菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果比較可靠，可以為臨床合理使用抗菌藥物提供參考依據(jù)，但革蘭陽性球菌的藥敏結(jié)果的可靠性有待進(jìn)一步論證。

尿培養(yǎng)；直接細(xì)菌鑒定；藥敏試驗(yàn)

尿路感染(urinary tract infection，UTI)是臨床常見感染性疾病之一，抗菌藥物使用中很大部分用于治療UTI。經(jīng)驗(yàn)性推薦使用治療UTI的抗菌藥物，一般需要滿足耐藥率低于10%的要求，但衛(wèi)生部細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：除呋喃妥因外沒有其他能夠滿足需要的廣譜抗生素用于治療UTI。由于常規(guī)培養(yǎng)和藥敏方法耗時(shí)較長(zhǎng)，不能及時(shí)報(bào)告細(xì)菌耐藥結(jié)果，一方面造成無效治療，另一方面增加患者負(fù)擔(dān)，造成疾病遷延不愈。因此早期識(shí)別UTI的病原菌以及藥敏結(jié)果可以明顯提高治愈率，并且降低患者藥品、實(shí)驗(yàn)室檢查等費(fèi)用。近年來，隨著細(xì)菌自動(dòng)化鑒定和藥敏分析系統(tǒng)的發(fā)展，大部分細(xì)菌的鑒定和藥敏分析結(jié)果可以在2～12 h內(nèi)得到，而且有很高的準(zhǔn)確性。將尿培養(yǎng)標(biāo)本直接用自動(dòng)化鑒定和藥敏系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)在國(guó)外已有研究，并取得一定結(jié)果[1]。本研究中，我們利用美華MA120型自動(dòng)化細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)及其配套測(cè)試卡對(duì)尿培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行直接細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn)的研究，并和常規(guī)方法比較，探討該方法的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1一般資料2014年1月至2015年12月在我院住院疑似USI患者送檢中段尿培養(yǎng)標(biāo)本835份。所有標(biāo)本為晨起留取中段尿，尿常規(guī)檢測(cè)(UF1000)白細(xì)胞數(shù)≥500 WBC/μl，2 h內(nèi)送檢。患者男212例，女623例；年齡3～87歲，平均60.4歲。

1.2儀器與試劑珠海美華生物科技公司MA120型細(xì)菌鑒定和藥敏分析系統(tǒng)及其配套檢測(cè)板，細(xì)菌鑒定試劑購自杭州天和生物制品公司，血基礎(chǔ)培養(yǎng)基為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品；質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922和金黃色葡萄球菌ATCC25923，購自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本篩選與預(yù)處理:參考文獻(xiàn)[1]中的方法首先對(duì)標(biāo)本進(jìn)行篩選。取中段尿標(biāo)本5 ml加入無菌離心管中，1 000 g/min離心1 min，上清轉(zhuǎn)移至另一無菌離心管中，10 000 g/min離心10 min，棄去上清留底部約留50 μl打散，用10 μl接種環(huán)取菌液加在玻片上自然干燥，固定后染色鏡檢，根據(jù)染色結(jié)果確定進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)的標(biāo)本。經(jīng)篩選共有302份標(biāo)本不符合要求，未進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，其中鏡檢大于1種細(xì)菌的115份(38.08%)，檢測(cè)為酵母菌的27份(8.9%)，未檢測(cè)到細(xì)菌或細(xì)菌數(shù)目小于30個(gè)/油鏡視野的137份(45.36%),樣本量少不適于實(shí)驗(yàn)的23份(7.62%)。其他533份標(biāo)本初步篩選合乎要求可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3.2經(jīng)典手工方法和常規(guī)培養(yǎng)方法:經(jīng)典手工方法參考臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程進(jìn)行常規(guī)尿細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定，并利用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)。常規(guī)培養(yǎng)法為取尿液定量接種于普通血平板及巧克力平板，在35℃二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h形成菌落后，首先進(jìn)行細(xì)菌定量，對(duì)≥103/ml的樣本進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)。根據(jù)細(xì)菌菌落革蘭染色結(jié)果，革蘭陽性菌進(jìn)行觸媒試驗(yàn)，觸媒試驗(yàn)陽性球菌利用葡萄球菌板，觸媒試驗(yàn)陰性球菌利用鏈/腸球菌板，進(jìn)行相應(yīng)的鑒定和藥敏試驗(yàn)；革蘭陰性菌接種克氏雙糖管，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇腸桿菌鑒定板或非發(fā)酵菌鑒定板進(jìn)行相應(yīng)的鑒定和藥敏試驗(yàn)。

1.3.3直接細(xì)菌鑒定和藥敏方法:取離心后的菌液根據(jù)要求制備0.5～1.0 McF菌液，以無菌滴管吸取少量菌液，依據(jù)1.3.1的革蘭染色結(jié)果，陽性菌進(jìn)行觸媒試驗(yàn)，觸媒試驗(yàn)陽性球菌利用葡萄球菌鑒定板，觸媒試驗(yàn)陰性球菌利用鏈/腸球菌鑒定板，進(jìn)行相應(yīng)的鑒定和藥敏試驗(yàn)；革蘭陰性菌進(jìn)行氧化酶試驗(yàn)，氧化酶試驗(yàn)陰性桿菌利用非發(fā)酵菌鑒定板，氧化酶試驗(yàn)陽性桿菌利用腸桿菌鑒定板，進(jìn)行相應(yīng)的鑒定和藥敏試驗(yàn)；革蘭陽性菌溫箱孵育24 h、革蘭陰性菌溫箱孵育8 h后取出進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏分析。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析533份標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)檢測(cè)，其中32份標(biāo)本有2中以上細(xì)菌生長(zhǎng)，9份標(biāo)本無細(xì)菌生長(zhǎng)，不適宜進(jìn)行對(duì)比分析，實(shí)際進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的標(biāo)本為492份。以經(jīng)典手工方法為標(biāo)準(zhǔn)，分析應(yīng)用美華MA120型自動(dòng)化細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)對(duì)尿培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和直接細(xì)菌鑒定的準(zhǔn)確率，并比較兩種方法的差異；藥敏試驗(yàn)的結(jié)果分為3種，正確、有誤差和錯(cuò)誤，分析并比較常規(guī)培養(yǎng)和直接藥敏試驗(yàn)的正確率。由于革蘭陰性桿菌和革蘭陽性球菌所做的藥物敏感試驗(yàn)差異較大，所以分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有統(tǒng)計(jì)分析利用SPSS 13.0軟件完成，兩者比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果判斷定義表

注：R:耐藥；I：中介；S：敏感

2 結(jié)果

2.1 492例尿培養(yǎng)標(biāo)本的細(xì)菌鑒定結(jié)果492例尿培養(yǎng)陽性標(biāo)本共檢測(cè)到革蘭陰性桿菌369株，革蘭陽性球菌123株，檢出最多的分別是大腸埃希菌278株(56.50%)，表皮葡萄球菌42株(8.54%)、屎腸球菌31株(6.30%)、肺炎克雷伯菌27株(5.49%)、糞腸球菌26株(5.28%)，奇異變形桿菌23株(4.67%)。采用常規(guī)培養(yǎng)法細(xì)菌鑒定的正確率為88.82%(437/492)、未鑒定率為6.91%(34/492)、鑒定錯(cuò)誤率為4.27%(21/492)；采用直接法鑒定的正確率為85.37%(420/492)、未鑒定率為10.16%(50/492)鑒定錯(cuò)誤率為4.47%(22/492)，兩種方法細(xì)菌鑒定結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.613,P=0.106; χ2=3.332,P=0.068;χ2=0.024,P=0.876)。檢出最多的大腸埃希菌和表皮葡萄球菌常規(guī)培養(yǎng)法鑒定的正確率分別為85.25%(237/278)和97.62%(41/42)，與采用直接法鑒定的正確率84.17%(234/278)和90.48%(38/42)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.125,P=0.724；F=0.360)。其他細(xì)菌由于例數(shù)較少未做統(tǒng)計(jì)分析。見表2。

2.2革蘭陰性桿菌藥敏結(jié)果分析以經(jīng)典手工法為標(biāo)準(zhǔn)，分析采用常規(guī)培養(yǎng)法所鑒定的369株革蘭陰性桿菌對(duì)15種常用抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，其平均正確率94.04%、有誤差率4.12%與采用直接法的平均正確率93.13%、有誤差率4.01%相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.76,P=0.05;χ2=0.83,P=0.77)，但常規(guī)培養(yǎng)法的平均錯(cuò)誤率1.84%明顯低于直接法的平均錯(cuò)誤率2.85%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.35,P=0.00)。單種抗生素的藥敏分析結(jié)果表明兩種方法對(duì)所有369株革蘭陰性桿菌檢測(cè)的藥敏結(jié)果正確率均無明顯差異(P>0.05)。見表3。

2.3革蘭陽性球菌藥敏分析結(jié)果以經(jīng)典手工法為標(biāo)準(zhǔn)，分析采用常規(guī)培養(yǎng)法所鑒定的123株革蘭陽性球菌對(duì)16種常用抗生素的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，其平均正確率92.89%、有誤差率5.39%、錯(cuò)誤率1.73%，與采用直接法的平均正確率86.79%、有誤差率9.65%、錯(cuò)誤率3.56%相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2值分別為40.07、25.78、12.80,P<0.05)。常規(guī)培養(yǎng)法與直接方法的多西環(huán)素正確率分別為100%和94.31%，克林霉素正確率分別為91.87%和77.24%，克拉霉素正確率分別為91.06%和73.98，兩種方法比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

3 討論

尿路感染治療最重要的是選擇有效的抗菌藥物，合理使用抗菌藥物，可以有效減少尿路感染患者住院天數(shù)，改善患者預(yù)后，減少治療費(fèi)用[2-4]。由于常規(guī)培

表2 492例標(biāo)本兩種方法細(xì)菌鑒定結(jié)果比較 份

注：與常規(guī)方法比較，*P<0.05

表3 369株革蘭陰性桿菌藥敏分析結(jié)果 份(%)

注：與常規(guī)培養(yǎng)法比較，*P<0.05

表4 123株革蘭陽性球菌藥敏分析結(jié)果 份(%)

注：與常規(guī)方法比較，*P<0.05

養(yǎng)法耗時(shí)較長(zhǎng)，通常在藥敏結(jié)果報(bào)告前，臨床都是依靠經(jīng)驗(yàn)選擇用藥。針對(duì)尿路感染推薦的經(jīng)驗(yàn)性抗感染藥物，一般需要滿足耐藥率低于10%的要求，但衛(wèi)生部細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示：除呋喃妥因外沒有其他能夠滿足需要的廣譜抗生素用于治療尿路感染[5,6]。而我們所做的研究顯示在腎盂腎炎患者中依靠經(jīng)驗(yàn)應(yīng)用抗菌藥物總的有效率僅為64.1%[7],這表明依靠經(jīng)驗(yàn)用藥所用抗菌藥物許多都是無效用藥，延誤了患者治療，造成患者經(jīng)濟(jì)損失和醫(yī)療資源的巨大浪費(fèi)。因此早期識(shí)別尿路感染中的病原菌以及藥敏結(jié)果有重要意義。采用尿液標(biāo)本直接進(jìn)行細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)，可以在8～24 h內(nèi)得到結(jié)果，極大縮短了檢測(cè)時(shí)間。雖然NCCLS未推薦尿液標(biāo)本進(jìn)行直接藥敏試驗(yàn)，但國(guó)外的研究表明，采用自動(dòng)化儀器對(duì)尿液標(biāo)本進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果可靠，并取得良好應(yīng)用效果[1]。本研究利用美華MA120型自動(dòng)化細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)及其配套測(cè)試卡對(duì)尿液標(biāo)本進(jìn)行直接鑒定及藥敏試驗(yàn)，可以極大縮短檢測(cè)時(shí)間，有很大的臨床應(yīng)用價(jià)值。

本研究對(duì)492例尿培養(yǎng)陽性標(biāo)本進(jìn)行鑒定和藥敏試驗(yàn)，直接法鑒定的正確率85.37%與常規(guī)培養(yǎng)法的正確率88.82%比較無明顯差異。藥敏結(jié)果表明，采用直接法的平均正確率93.13%與常規(guī)培養(yǎng)法的平均正確率94.04%相比無明顯差異。單種抗生素的藥敏分析結(jié)果表明，兩種方法對(duì)所有369株革蘭陰性桿菌的藥敏結(jié)果正確率均無明顯差異。采用常規(guī)培養(yǎng)法的革蘭氏陽性球菌藥敏結(jié)果平均正確率92.89%明顯高于采用直接方法的平均正確率86.79%，差異顯著。分析直接法革蘭陽性球菌藥敏試驗(yàn)平均正確率較低的原因，是因?yàn)橛袔追N抗生素的正確率直接法明顯低于常規(guī)培養(yǎng)法。單種抗生素的藥敏分析結(jié)果表明，革蘭氏陽性球菌對(duì)多西環(huán)素、克林霉素、克拉霉素的藥敏試驗(yàn)兩種方法比較正確率有差異。分析多西環(huán)素、克林霉素、克拉霉素錯(cuò)誤率較高的原因第一可能是細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)本身的原因，這幾種藥物的敏感性和穩(wěn)定性存在差異；第二可能是細(xì)菌方面的原因，因?yàn)槌霈F(xiàn)錯(cuò)誤的多為具有生長(zhǎng)較慢、生化特征不明顯、難以鑒定等特點(diǎn)的細(xì)菌，本身鑒定比較困難。國(guó)外相關(guān)研究表明，尿液培養(yǎng)標(biāo)本直接細(xì)菌鑒定正確率為82.3%[1]。藥敏試驗(yàn)正確率為84.7%，本研究中革蘭陽性球菌雖然直接法藥敏正確率低于常規(guī)方法，但仍高達(dá)86.79%，表明本系統(tǒng)的鑒定和藥敏結(jié)果可以接受，可被臨床參考應(yīng)用。

本研究應(yīng)用國(guó)產(chǎn)自動(dòng)化細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)對(duì)篩選的尿液培養(yǎng)標(biāo)本進(jìn)行直接鑒定藥敏試驗(yàn)，革蘭陰性桿菌選在8 h測(cè)定結(jié)果，因?yàn)榇蠖喔锾m陰性桿菌生長(zhǎng)迅速，8 h測(cè)定不影響結(jié)果，而且也可以在實(shí)驗(yàn)當(dāng)天將結(jié)果報(bào)告臨床醫(yī)生方便醫(yī)生調(diào)整用藥；革蘭陽性球菌選在24 h后測(cè)定，是因?yàn)檠芯恐邪l(fā)現(xiàn)，本系統(tǒng)對(duì)大部分陽性球菌10 h內(nèi)進(jìn)行測(cè)定所得的結(jié)果不準(zhǔn)確，因?yàn)榇蟛糠株栃郧蚓诒鞠到y(tǒng)生長(zhǎng)較慢，需要培養(yǎng)過夜才能得到可靠結(jié)果，但這也比常規(guī)實(shí)驗(yàn)先得到純菌落再進(jìn)行試驗(yàn)大大縮短了時(shí)間，對(duì)臨床具有積極意義。與國(guó)外相關(guān)系統(tǒng)比較[8]，革蘭陽性球菌直接鑒定藥敏實(shí)驗(yàn)檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，需要進(jìn)一步提高，而且在幾種特殊抗生素的的藥敏試驗(yàn)中正確率較低，需要特別注意。綜上所述，應(yīng)用國(guó)產(chǎn)自動(dòng)化細(xì)菌鑒定和藥敏系統(tǒng)對(duì)尿液標(biāo)本進(jìn)行直接鑒定藥敏試驗(yàn)，結(jié)果可靠，快速，經(jīng)濟(jì)，可以為臨床合理使用抗菌藥物提供及時(shí)、可靠的幫助。

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050082 石家莊市，中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)科

張海譜,050082 石家莊市，中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)科;

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