HPLC法測定肝康寧顆粒中綠原酸的含量

國宏偉

山東省濟寧市第一人民醫院藥學部，山東濟寧 272011

HPLC法測定肝康寧顆粒中綠原酸的含量

國宏偉

山東省濟寧市第一人民醫院藥學部，山東濟寧 272011

目的 建立肝康寧顆粒中綠原酸含量的合理有效穩定的測定方法。方法 采用高效液相色譜法測定綠原酸的含量。色譜柱:ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流動相：乙腈-2%醋酸溶液（13:87）。流速：1 mL/min,測定波長 327 nm。結果 綠原酸在0.32～1.93 μg范圍線性相關良好，相關系數(r=0.999 8)，回歸方程為Y=1 025 887X-65 235,平均回收率99.06%(RSD=1.10%,n=6)。精密度RSD=0.61%(n=6),重復性RSD=0.56%(n=6)。 結論 方法穩定、可靠，可作為該制劑的質量控制方法。

肝康寧顆粒；綠原酸；HPLC法；含量

近年來,肝病的發病率呈明顯上升趨勢,其發病機制有些尚未明確。現代醫學認為可能與多種因素有關,如脂質代謝異常、激素水平改變、環境與遺傳因素等原因,引發肝臟病變所致。肝病的病變為可逆性病變在早期診斷和合理治療下可康復。如不及時治療,部分肝病患者可能發展為肝纖維化,甚至肝硬化[1]。

肝康寧顆粒系中藥制劑，功能為清肝利濕,用于肝膽濕熱所致的黃疸，癥見周身，小便俱黃，體疲乏力，納呆，惡心厭油，苔黃膩，脈弦滑數；及急慢性肝炎，遷延性肝炎及慢性膽囊炎等。經國家認定列為全國中醫院急診科（室）必備中成藥，該藥已被國家列為中藥保護品種[2]。

肝康寧顆粒由柴胡、田基黃、茵陳、蒲公英、甘草、金錢草等組成[3]。原標準僅有茵陳藥材的薄層鑒別，難以控制藥品質量，因此用高效液相色譜法測定了綠原酸的含量，并進行了方法學研究，提高了該品質量的可控性[4]。選擇茵陳中主要成分綠原酸，進行了含量測定。該試驗采用高效液相色譜法。

1 儀器與試劑

Waters515 泵(美國)，2487 紫外檢測器（美國）。工作站：CEMO.甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。藥品為中試品（批號分別為20041201、20041203和20041206）。綠原酸（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，110753-200413）。

1.1 對照品溶液的制備

精密稱取綠原酸對照品12.00 mg,置50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，精密量取該溶液5 mL,置25 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液（0.048 0 mg/mL）[5]。

1.2 供試品溶液的制備

取裝量差異項下的該品，研細，取2 g精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇溶液50 mL,稱定重量，超聲處理（功率 250 W,頻率 50 kHz）50 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，即得[6]。

標準溶液的制備：精密稱取綠原酸對照品10.05 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL、12 mL，分別置 25 mL 棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：ODS C18 柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）。 流動相:乙腈-2%醋酸溶液（13：87）。理論板數按綠原酸峰計不得低于2 500[7-8]。

2.2 檢測波長的確定

取綠原酸對照品溶液，在200～500 nm光譜掃描，其最大吸收波長在327 nm,因此選用檢測波長為327 nm。

2.3 供試液制備方法考察

2.3.1 提取溶劑的選擇 分別采用甲醇、50%甲醇和95%甲醇為溶劑，超聲提取（功率250 W，頻率40 kHz）50 min。見表1。

表1 提取溶劑的選擇

結果表明，以50%甲醇為提取溶劑，綠原酸提取率最高，故選擇50%甲醇作為提取溶劑。

2.3.2 提取方式的選擇 以50%甲醇為溶劑，分別采用下列提取方式提取50 min。見表2。

表2 提取方式的選擇

結果表明:兩種提取方式無明顯差異，考慮到超聲提取易于操作，故選擇超聲提取作為含量測定的提取方式。

2.3.3 提取時間的選擇 以50%甲醇作為提取溶劑，對下列超聲提取時間（功率250 W,頻率40 kHz）進行了考察。見表3。

表3 提取時間的選擇

結果表明，提取50 min與提取70 min無明顯差異，其提取率均比提取30 min高，為節約時間，提高效率，選擇超聲提取50 min。

2.4 綠原酸線性關系考察

照高效液相色譜法（中國藥典2005年版一部附錄VID）試驗，分別精密吸取上述對照品溶液各20 μL依次注入高效液相色譜儀，測定峰面積。見表4。

表4 綠原酸線性關系考察

圖1 綠原酸標準曲線

以綠原酸進樣量（μg）對綠原酸峰面積值進行線性回歸，以進樣量為橫坐標，峰面積值為縱坐標繪制標準曲線，得回歸方程為：Y=1 025 887X-65 235,相關系數r=0.999 8。結果表明：綠原酸進樣量在0.32～1.93 μg范圍內與峰面積稱線性關系。見圖1。

2.5 系統適應性及空白試驗

稱取茵陳陰性樣品2 g，同上操作，制成空白對照溶液。按上述儀器和試驗條件，精密吸取對照品溶液、供試品溶液及空白對照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，分別進行測定。從色譜圖可見，供試品溶液色譜中在與對照品溶液色譜中綠原酸峰相應位置處顯相同的峰，且與其它峰完全分開；而空白對照溶液色譜中在與對照品溶液色譜綠原酸峰相應位置處均未出現相同的峰。所以，空白對照溶液不干擾樣品中綠原酸的測定。

2.6 精密度試驗

精密吸取供試品溶液20 μL，重復進樣測定，測定6次。結果表明，該法精密度良好。見表5。

表5 精密度試驗結果

2.7 穩定性試驗

精密吸取供試品溶液20 μL，每隔一定時間進樣測定一次，共測定8 h。結果表明，供試品溶液在8 h內基本穩定。見表6。

表6 穩定性試驗結果

2.8 重復性試驗

按前文所述“含量測定”方法，對同一批樣品（20041201）分別制備6份供試品溶液，各吸取20 μL注入液相色譜儀，測定。結果表明，該法重復性良好。見表7。

2.9 回收率試驗

精密稱取綠原酸對照品60.00 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為已知量的對照品（1.200 mg/mL）。 稱取批號為（20041201）的樣品 6 份，每份約0.1 g，按法配成供試品，分別精密加入上述對招聘1 mL,按供試品溶液項下測定，得如下結果。結果表明，回收率在95%～105%之間，加樣回收良好。見表8。

表7 重復性試驗結果

表8 綠原酸回收率試驗結果

2.10 樣品的測定及最低限量的確定

按上述測定方法，對10批中試樣品進行了綠原酸的含量測定。見表9。

表9 樣品的測定結果

參考不同產地茵陳藥材中綠原酸的最低含量0.41%，并根據成品中綠原酸轉移率為36.29%及上述10批中試樣品的測定結果，暫定該品每袋含綠原酸(C16H1809)計不少于6.0 mg。

3 討論

曾對下述流動相進行了使用摸索，乙腈-2%磷酸溶液（9：91），乙腈-2%醋酸溶液（13：87），結果以乙腈-2%醋酸溶液（13：87）分離效果及峰形最好，因而選擇此流動相為綠原酸測定的流動相。

提取方式的選擇方面以50%甲醇為溶劑，分別采用回流提取和超聲提取50 min，結果表明兩種提取方式無明顯差異，考慮到超聲提取易于操作，故選擇超聲提取作為含量測定的提取方式。

采用高效液相色譜法測定該品中綠原酸含量，結果顯示所采用的方法準確、重現性、回收率和線性相關系良好，操作簡便，可作為該品的質量控制標準。

[1]國家藥品委員會.中國藥典2005年[M].北京：化學工業出版社，2000：177.

[2]卓菊,孫春燕.高效液相色譜法測定茵陳清肝顆粒中綠原酸的含量[J].時珍國醫國藥，2005，16（6）：509.

[3]黃麗丹,闞家義.降脂沖劑的質量標準研究 [J].中成藥，2002，24（3）：184-185.

[4]王隸書，程東巖.HPLC法測定不同產地的三七葉中人參皂苷Rb3的含量[J].中國藥師，2004,7(11):857-858.

[5]國家藥品監督管理局.中成藥地方標準上升國家標準部分·內科·肝膽分冊[M].北京：上海科學技術出版社，2002：309.

[6]衛生部藥品標準[S].中藥成方制劑第十冊，1998：36.

[7]陳延清.HPLC法測定消核片中丹參素的含量[J].中草藥，2000，31（4）：269-270.

[8]呂武清，龍新華.中成藥中的薄層鑒別[M].北京：人民衛生出版社，1997:435，557.

Measurement of Chlorogenic Acid in Gankangning Granula by HPLC

GUO Hong-wei
Department of Pharmacy,Jining No.1 People’s Hospital,Jining,Shandong Province,272011 China

ObjectiveA reasonable,stable and effective method of measuring the content of chlorogenic acid in gankangning granula is to be established.MethodsHigh Performance Liquid Chromatography method was used to measure the content of the chlorogenic acid.Chromatographic column:ODS C18(4.6 mm×250 mm,5 μm).Mobile phase:acetonitrile-2%Acetic acid solution(13:87).Flowrate:1mL/min,determinationwavelength:327nm.ResultsChlorogenicacidintherangeof0.32～1.93 μg linear correlation performed well.The regression equation was Y=1 025 887X-65 235,and the average recovery was 99.06%(RSD=1.10%,n=6).The correlation coefficient(r=0.999 8).The precision RSD=0.61%(n=6)and reproducibility RSD=0.56%(n=6).ConclusionThis method is stable and reliable and can be used as the quality control method of the preparation.

Gankangning granula;Chlorogenic acid;HPLC method;Content

R286.0

A

1672-5654（2017）08（a）-0036-04

2017-05-09）

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.22.036

國宏偉（1981-），男，山東濟寧人，本科，主管藥師，研究方向：抗菌藥物的臨床應用。