紅景天苷對乳鼠心肌肥大細胞的保護作用研究

吳阿新 劉杭 童芬美

紅景天苷對乳鼠心肌肥大細胞的保護作用研究

吳阿新 劉杭 童芬美

目的 在原代培養的新生大鼠心肌細胞上，觀察紅景天苷（Sal）對苯腎上腺素（PE）誘導的心肌細胞肥大的影響。方法 應用細胞培養技術培養新生大鼠心肌細胞，采用倒置顯微鏡和圖像分析測量細胞面積，測定心肌細胞3H-亮氨酸摻入率作為心肌細胞肥大的指標；用Western blot法檢測心肌細胞熱休克蛋白HSP70蛋白的表達。結果 濃度50μg/ml的Sal能抑制PE誘導的心肌細胞增大及心肌細胞合成速率的增加（P＜0.05）；能顯著增加心肌肥大細胞HSP70蛋白表達（P＜0.05）。結論 Sal可以抑制PE誘導的心肌細胞肥大，這可能與其增加HSP70蛋白表達有關。

紅景天苷 苯腎上腺素 心肌細胞肥大 HSP70

心肌肥大與纖維化是心臟長期負荷過重時發生的一種心室重構，除心肌細胞蛋白質合成增加和細胞體積增大外，還伴隨心肌細胞間結締組織沉積［1］，也是多種心血管系統疾病常見并發癥和病理基礎［2］。持續存在的心肌肥大逐漸發展為失代償，常導致嚴重的心律失常、心力衰竭［3］。紅景天苷（Sal）是紅景天中的主要有效成分之一［4］，其具有抗缺氧、抗疲勞、保護心肌和增強收縮力作用。研究發現，HSP70作為心肌細胞耐受缺血、缺氧損傷的一種內源性物質，在心血管疾病中發揮著重要作用［5］。2015年9月至12月作者采用乳鼠心肌細胞原代培養，觀察Sal對心肌細胞肥大中HSP70蛋白表達的影響，探討其心肌肥大的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 （1）受試藥物：Sal為Sigma公司生產。20、5、1.25mg Sal分別溶于100ml DMEM培養液中，高、中、低劑量的終濃度分別為200μg/ml 、50μg/ml和12.5μg/ml。（2）主要試劑及儀器：青霉素、鏈霉素（華美生物），全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒（凱基生物），DMEM細胞培養基、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液（Hyclone），D-Hanks液（Solarbio），Ⅱ型膠原酶（Worthington），5-溴-2-脫氧尿苷（BrdU）、苯腎上腺素（PE）（Sigma），3H-亮氨酸（中科院上 海原子能研究所），牛血清白蛋白（biosharp），SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、辣根酶標記山羊抗兔IgG（中杉金橋），預染Marker（Thermo），ECL顯色劑（Thermo），Anti-HSP70 antibody，Anti-GAPDH antibody（abcam），PVDF膜（millipore），低溫離心機（eppendorf），酶標儀（ANTAI），電泳儀（Power Pac TM HC，Bio-Rad），電轉儀（XCell Sure Lock?，Invitrogen），二氧化碳培養箱（HF240，Heal Force），倒置顯微鏡（CKX41，OLYMPUS），超凈工作臺（SWGL-2FD，蘇凈安泰），LS3810液體閃爍儀（Beckman公司），凝膠成像系統（BIO-RAD）。

1.2 方法 （1）心肌細胞的培養：①出生1～2d的SD乳鼠（浙江省醫學科學院動物實驗中心提供），置于75%酒精中消毒，無菌條件下剪取心室組織，放入D-Hanks液中洗滌3次，剝離心房與血塊后，將心室剪成1mm3大小的碎塊。②濃度為1%的Ⅱ型膠原酶與D-Hanks液1：4混合配成消化液，置于4℃冰箱過夜，消化心室組織碎塊。③用槍頭吹打消化液，以終止液終止消化（終止液為每10m1消化液加入4ml含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基），1000r/min離心15min。④細胞計數后，以3×105～5×105/ml密度接種于12孔板內，每1mlDMEM高糖培養基加10μl配好的抗生素溶液，置于CO2孵箱、37 ℃培養。⑤孵育24h后，先用細胞培養級PBS清洗，再換成含10%胎牛血清和0.1mM BrdU的DMEM高糖培養基，以抑制摻雜的少量非心肌細胞增殖，繼續孵育48h后換成不含血清與抗生素的DMEM高糖培養基。（2）分組及給藥：無血清無抗生素的DMEM高糖培養基孵育24h后，進行給藥。分成五組：control 組不作處理，PE組給予PE刺激（10uM，10μl/ml），PE+Sal高、中、低組分別給予PE（10uM，10μl/ml）及Sal（200μg/ml、50μg/ml、12.5μg/ml），稍震蕩混勻后，37℃細胞培養箱中培養48h。（3）心肌細胞肥大檢測：①心肌細胞3H-亮氨酸摻入測定：心肌細胞在無血清培養液中培養24h后，加入各種處理因素和18.3kBq3H-亮氨酸繼續培養24h。棄培養液，PBS沖洗2遍，用25mg/L胰蛋白酶消化后收集細胞于玻璃纖維素膜上，用10%的三氯乙酸固定，濾膜烘干后用，LS3910液體閃爍儀測定放射強度。②心肌細胞面積的測定：心肌細胞接種于12孔板，每組設4個平行孔，藥物作用48h后棄培養液，用PBS平衡鹽溶液快速沖洗2遍，于倒置顯微鏡下觀察并拍照（物鏡20倍），每孔取5個視野，每個視野約5個細胞，用Image-Pro Plus5.0專業圖像分析軟件測量單個細胞面積（μm2）。（4）Western blot法檢測HSP70的表達：①蛋白樣品的制備：取control組、PE組和PE+Sal中劑量組的12孔板心肌細胞，按每孔60μl加入蛋白裂解液，室溫靜置裂解15min，無菌槍頭收集上清液，12000r/min 4℃離心30min，吸取上清液保存于-20℃冰箱備用。②Western blot法檢測靶蛋白HSP70含量：測定樣品中蛋白濃度后，用SDS-PAGE上樣緩沖液（還原，5X）與稀釋后的蛋白樣品按體積比1：4混合，置于水浴鍋中恒溫變性5min。將變性處理過的細胞蛋白樣品加入濃縮膠中，每孔加細胞蛋白樣品500ng進行電泳，電壓80 V。蛋白進入分離膠后，將電壓調至 100V。電泳結束后，將分離膠上的蛋白轉移至 PVDF 膜上。轉膜條件：恒定電流200mA，轉移120min。轉膜結束后將膜放入封閉液中封閉。封閉后與1：1000稀釋的一抗HSP70抗體4℃孵育過夜，與1：5000稀釋的二抗室溫孵育1h。二抗結合結束后，在膜上加ECL化學發光底物，凝膠成像系統拍照，最后對結果進行灰度掃描分析。

1.3 統計學分析 采用SPSS13.0統計軟件。計量資料以（x±s）表示，用方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Sal對心肌細胞蛋白質合成速率的影響 給藥24h后，PE組心肌細胞合成速率較control組明顯增加（P＜0.01）；Sal能抑制PE刺激的心肌蛋白質合成速率的增加；PE+Sal中劑量組與PE組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；PE+Sal高劑量組及PE+Sal低劑量組與PE組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 Sal對心肌細胞蛋白質合成速率的影響（x±s）

2.2 Sal對心肌肥大細胞面積的影響 PE組細胞面積明顯大于control組和PE+Sal中劑量組（P＜0.05）；PE+Sal中劑量組細胞面積與control組比較差異無統計學意義；PE+Sal高、低劑量組與PE組細胞面積差異無統計學意義，見表2。

表2 Sal對心肌肥大細胞面積的影響（x±s）

2.3 Sal對心肌細胞HSP70蛋白表達的影響 給藥24h后，PE+Sal中劑量組心肌HSP70蛋白表達顯著高于control組與PE組，為control組的（57.4±0.27）倍；為PE組的（13.6±0.15）倍（P＜0.05，n=3）（見圖1）。

圖1 紅景天苷對心肌肥大細胞HSP70蛋白表達的影響（n=3）

3 討論

隨著對紅景天的研究日益增多，其藥理作用也不斷被發現并應用。目前研究表明，紅景天對冠心病、高血壓病等疾病的治療效果理想；心腦血管疾病的發生與血小板聚集、粘附等活性增高相關以外，還與血液流變性異常、血液粘度增加有關。在藏藥紅景天對正常家兔血小板聚集、血液流變性的影響中發現，藏藥紅景天對ADP、AA、COLL誘導血小板聚集均具有不同程度的抑制及改善血液流變學作用，其具體作用機制，尚待進一步研究［6］。紅景天具有上調AM、CRLR表達和促進AMI大鼠缺血心肌血管新生的作用，紅景天苷是紅景天發揮該作用的有效成分之一［7］。

心肌細胞是一種高度分化的終末細胞，但當受到多種因素刺激時，心肌細胞體積變大，細胞內蛋白質含量增加，肌節數量增多，肌原纖維積聚而出現心肌肥大，這是心肌細胞對多種病理刺激的一種適應性反應。HSP70是研究最多的熱休克蛋白亞族，分為組成型和誘導型兩類，前者位于細胞漿內，主要發揮分子伴侶功能，而誘導型HSP70廣泛存在于細胞漿和細胞核，在細胞膜上也可檢測到。HSP在正常細胞內低表達；HSP70的異常表達在疾病的發生發展過程中起重要作用：當細胞受到各種應激時誘導型HSP70表達增加，以提高細胞對有害刺激的抵抗力，是細胞水平上的抗損傷反應，如缺血缺氧誘導熱休克蛋白表達，可減輕再灌注損傷［8］。心肌肥大時，由于應激產生使得HSP70蛋白表達增加，產生對機體的保護作用；適合濃度的Sal可能通過增加HSP70的表達水平，抑制心肌肥大。

［1］ Sugden PH,Clerk A． Cellular mechanisms of cardiac hypertrophy． J Mol Med,1998,76:725-746．

［2］ D'Andrea A,Scarafile R, Frrrara I,et al． An unusual case of apical hypertrophic cardiomyopathy in a transplanted heart．Monaldi Arch Chest Dis,2010,74(4):192-194．

［3］ Lorell BH, Carabello BA．Left ventricular hypertrophy:pathogenesis ,detection,and prognosis．Circulation,2000,102:470-479．

［4］ 李西林,南藝蕾．紅景天多糖的化學藥理研究進展．中國中醫藥信息雜志,2006,13(3):109-110．

［5］ Chaggar PS, Malkin CJ, Shaw SM, et al． Neuroendocrine effects on the heart and targets for therapeutic manipulation in heart failure．Cardiovasc Ther,2009,27(3):187-193．

［6］ 王孝琴,王保和,李玉紅,等．藏藥紅景天對正常家兔血小板聚集、血液流變性的影響．時珍國醫國藥,2012,23(6):1561-1562．

［7］ 姜曉斐,施海明,羅心平,等．紅景天對急性心肌梗死大鼠心肌組織腎上腺髓質素及其受體表達的影響．中華中醫藥雜志,201 1,26(10):2442-2445．

［8］ Alexzander Asea, Stine-Kathrein Kraeft, Evelyn A, et al． HSP70 stimulates cytokine production through a CD14-dependant pathway,demonstrating its dual role as a chaperone and cytokine．Nature Medicine, 2000,6:435-442．

Objective To explore the regulatory effect of salidroside（Sal）on HSP70 expression in improving rat myocardial hypertrophy. Methods Cultured cardiomyocytes of nude rats were used to establish a myocardial hypertrophy model by phenylephrine（PE）stimulation. The cardiomyocyte surface area was detected by inverted microscope and digital image analysis technology. 3H-leucine incorporation was measured to evaluate myocardial hypertrophy. The expression of HSP70 protein was detected by Western blot. Results Sal（50μg/ml）was able to decrease the increased cell surface area and the 3H-leucine incorporation was stimulated by PE（P＜0.05）. Sal was able to increase HSP70 protein expression. Conclusion Sal can ameliorate myocardial hypertrophy，probably through increases HSP70 protein expression.

Salidroside Phenylephrine Myocardial hypertrophy HSP70

310013 杭州市西溪醫院