木豆GDSL脂肪酶基因的克隆及表達分析

喬 光，文曉鵬*，丁貴杰

木豆GDSL脂肪酶基因的克隆及表達分析

喬 光1，文曉鵬1*，丁貴杰2

(1.貴州大學農業生物工程研究院，山地植物資源保護與種質創新省部共建教育部重點實驗室，貴州貴陽 550025;2.貴州大學貴州省森林資源與環境研究中心，貴州貴陽 550025)

【目的】為探明GDSL家族脂肪酶的抗逆機理，【方法】在前期研究基礎上，利用RACE技術克隆木豆GDSL脂肪酶基因，并通過熒光定量PCR技術檢測其表達特性?！窘Y果】獲得1條木豆GDSL脂肪酶基因，命名為CcGDSL1，該基因含開放閱讀框全長1 107 bp，編碼369個氨基酸;經同源性分析，CcGDSL1編碼的氨基酸序列與豆科植物中GDSL脂肪酶具有較高的相似性。該基因在葉、莖和根中均表達，且葉和莖中表達量顯著高于根;干旱脅迫能提高CcGDSL1的表達量，隨干旱的持續表現出先降后升隨后趨于穩定的表達模式?！窘Y論】推測CcGDSL1基因參與木豆應激干旱脅迫。

木豆;GDSL脂肪酶;克隆;表達

【研究意義】植物脂肪酶根據編碼蛋白催化活性區域氨基酸序列的保守型分為GXSXG脂肪酶和GDSL脂肪酶[1]。GDSL型脂肪酶是一類水解酶，廣泛存在于原核和真核生物中[2]。隨著科學研究的深入發現，GDSL型脂肪酶是一個較大的基因家族，具有器官特異性表達的特點[3]，在生物代謝、發育及形態建成等方面都發揮著重要作用。【前人研究進展】近年來，越來越多的研究發現，GDSL脂肪酶參與了植物逆境脅迫防御過程。Hong等[4]報道辣椒中CaGLIP1同源物受高鹽、干旱和傷害等多種脅迫因子的誘導。Naranjo等[5]發現，過表達一個擬南芥GDSL酯酶(AtLTL1)能提高酵母和擬南芥的抗鹽能力?？梢娮鳛榇蟮闹参锘蚣易?，GDSL脂肪酶功能多樣，且因物種不同功能也有所差異。木豆(Cajanus cajan)是豆科木豆屬唯一栽培種，其植株直立、木質化，為多年生常綠灌木[6]，主要分布在我國云南、貴州、廣東、福建和湖南等西南和華南省區[7]。除具有較高的藥用和營養價值[8]外，木豆更重要的價值表現在生態保護方面，其耐旱、耐瘠、生長迅速、根系發達，成為南方山地造林、水土保持的優良先鋒樹種[9]。【本研究切入點】基于木豆抗旱相關基因富集的抑制消減雜交(SSH)文庫中1條表達差異顯著的EST(NCBI登錄號為JK087058)，經序列分析發現其編碼的蛋白質與擬南芥GDSL脂肪酶(Q9SVU5.1)同源性較高，目前關于木豆GDSL脂肪酶基因的研究鮮見報道?！緮M解決的關鍵問題】筆者在此基礎上開展木豆GDSL脂肪酶基因的克隆及表達分析研究，以期豐富GDSL脂肪酶生物學功能，并為木豆抗旱性研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

供試木豆品種為桂木1號，播種前先將種子用0.1%升汞消毒5 min，接著用45℃溫水浸泡約1 min，無菌水沖洗4次后放置于墊有1張濕潤濾紙的培養皿中，轉入30℃恒溫培養箱中催芽培養1 d。將催芽處理后的種子播種于裝有培養基質的塑料盆(15 cm×12 cm)中，每盆播15粒種子，在土壤相對含水量70%～80%、溫度20～25℃條件下培養。播種90 d后挑選長勢基本一致的幼苗進行干旱脅迫處理，通過稱重法控制土壤相對含水量約為田間持水量的50%，對照處理控制在70%～80 %，每處理10次重復(10盆)。分別于脅迫處理后第3、5、10、15、20、25、30天收集植株葉片、莖段和根，液氮速凍后置于-80℃保存備用。

1.2 RNA提取

采用RNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)提取各樣品總RNA，使用RNase-free DNase I(天根生化科技有限公司，北京)去除殘留基因組DNA。所有操作均參照說明書，提取的RNA于-80℃保存備用。

1.3 全長序列克隆

對已獲得的木豆GDSL脂肪酶基因片段進行序列比對分析發現，該片段已具有3'末端的全序列，因此僅需克隆其5'末端序列。利用RACE試劑盒(Clontech，美國)，等量混合對照處理不同時期葉片RNA，以此為模板，利用引物GSP-1(表1)和SUPERSCRIPT IIRT酶(RACE試劑盒提供)進行5' RACE cDNA第1鏈的合成。以5'RACE cDNA為模板，以GSP-2(表1)和橋連鉚釘引物AAP(RACE試劑盒提供)為引物進行第1輪PCR反應;以第1輪PCR反應產物為模板，以GSP-3(表1)和橋連通用擴增引物AUAP(試劑盒提供)為引物，進行第2輪巢式PCR反應，2輪PCR反應條件均參考說明書設置。將第2輪PCR產物回收，克隆到PMD-18T載體(寶生物工程有限公司，大連)上，轉化DH5α感受態細胞(天根生化科技有限公司，北京)，挑選陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4 序列生物信息學分析

基因核酸序列的檢索及同源性分析由NCBI的BLAST服務器在線完成(http://blast.ncbi.nlm. nih.gov/);基因序列讀碼框搜索利用在線ORF Finder進行(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi);氨基酸進化樹運用Clustal進行多重序列比對，由MEGA 6.0軟件生成;氨基酸理化性質預測參照Protparam程序(http://web.expasy.org/protparam/);蛋白質親水/疏水性分析使用ProtScale在線分析工具(http://expasy.org/tools/protscale.html);磷酸化位點分析和跨膜區分析分別利用丹麥科技大學(DTU)的CBS服務器上的NetPhos 2.0 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/Net-Phos/)和TMHMM Server v.2.0程序(http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)完成;亞細胞定位通過WoLF PSORT工具完成(http://wolfpsort.seq. cbrc.jp/);蛋白質二級結構預測使用GOR方法完成(http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa-automat. pl?page=/NPSA/npsa-hnn.html);蛋白質三級結構預測使用SWISS-MIDEL工具(http://swissmodel. expasy.org)，觀察使用Raswin軟件。

1.5 基因表達分析

等量混合各處理不同時期根、莖和葉的RNA，以此為模板進行組織特異性表達分析;以各處理不同時期葉片RNA為模板，進行持續干旱脅迫下基因表達分析。參照Quantscript RT Kit(天根生化科技有限公司，北京)操作說明合成cDNA。以RTPF和RTPR(表1)為引物，利用RealMasterMix(SYBR Green)試劑盒(天根生化科技有限公司，北京)在ABI 7500PCR儀上進行熒光定量PCR擴增，3次重復，反應條件為94℃預變性60 s;94℃變性15 s，58℃退火20 s，68℃延伸40 s，40個循環。以ACTF和ACTR(表1)為引物擴增ACTIN基因作為內參，利用2-ΔΔCt計算基因相對表達量。

2 結果與分析

2.1 木豆GDSL脂肪酶基因全長

經過第1輪5'RACE PCR擴增反應后，無特異條帶出現。隨后進行第2輪巢式PCR擴增，獲得約960 bp目的片段，將此目的條帶純化后與pMD18T載體連接、轉化后對陽性克隆測序。將測序獲得的5'序列與文庫中已獲得的含3'序列通過中間重疊區拼接，獲得該基因cDNA全長序列，共1448 bp，其中開放閱讀框(ORF)長度為1107 bp，編碼369個氨基酸(圖1)，命名為CcGDSL1。

表1 PCR和RACE的引物序列Table 1 Primer sequence of PCR and RACE

2.2 木豆CcGDSL1基因序列的同源性及進化樹

2.2.1 同源性 通過對氨基酸序列同源性比對后發現，木豆CcGDSL1與大豆GmGDSL(XP-003542450.1，90%)和野生大豆GsGDSL (KHN05905.1，88%)同源性較高，其次是鷹嘴豆CaGDSL(XP-004495029.2，77%)、首蓿MtGDSL (XP-013468381.1，75%)和菜豆PvGDSL(XP-007162645.1，74%)，而與葡萄VvGDSL(XP-010648948.1，72%)、煙草NtGDSL(XP-009587010. 1，67%)和擬南芥AtGDSL(AEE85543.1，63%)同源性較低(圖2)。

圖1 木豆CcGDSL1基因核苷酸序列及推測的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of C.cajan CcGDSL1

圖2 木豆CcGDSL1與其他植物中GDSL脂肪酶氨基酸序列的同源比對Fig.2 Homologous alignment in amino acid sequence between C.cajan CcGDSL1and GDSL lipase of other plants

2.2.2 進化樹 由系統進化樹(圖3)可得，參與比對的GDSL脂肪酶可以分為3個亞組，其中木豆CcGDSL1與大豆、野生大豆、鷹嘴豆、首蓿和菜豆等豆科植物的GDSL脂肪酶聚為一類，擬南芥與葡萄的GDSL脂肪酶聚為一類，而煙草的GDSL脂肪酶獨自分為一類，說明豆科植物GDSL脂肪酶同源性高，進化關系較近，而與擬南芥、葡萄和煙草等植物進化關系較遠。

圖3 木豆CcGDSL1與其他植物中GDSL脂肪酶的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of C.cajan CcGDSL1 and GDSL lipase of other plants

2.3 木豆CcGDSL1基因的生物信息學序列

圖4 木豆CcGDSL1的三維結構Fig.4 Three dimensional structure of C.cajan CcGDSL1

理化性質預測結果表明，木豆CcGDSL1分子量為40.44 kDa，理論等電點(PI)為8.88，含量較豐富的是纈氨酸(V)8.1%、甘氨酸(G)8.9%、亮氨酸(L)9.8%，帶負電荷的氨基酸殘基總數為22個，帶正電荷的氨基酸殘基總數為28個，其消光系數為23880，蛋白質不穩定指數為35.16，該蛋白質屬于穩定蛋白質，脂肪族指數86.37;根據ProtScale Sever在線分析，木豆CcGDSL1為疏水蛋白;根據磷酸化位點分析和跨膜區分析，該脂肪酶屬跨膜蛋白，含8個色氨酸(Ser)、6個蘇氨酸(Thr)和6個酪氨酸(Tyr)，可能成為蛋白激酶磷酸化位點;亞細胞定位預測得分為液泡6.0分，葉綠體3.0分，細胞外3.0分，細胞核1.0分，表明該蛋白最大可能定位于液泡;使用GOR方法進行蛋白質二級結構預測，表明木豆CcGDSL1由37.13%的α-螺旋、14.36%的延伸鏈和48.51%的無規則卷曲構成;用SWISSMODEL數據庫預測該蛋白三維結構，包括12個α-螺旋，11個β-折疊和38個β-轉角(圖4)。

圖5 木豆CcGDSL1基因在不同組織(A)和葉中不同干旱處理時間(B)的表達量Fig.5 Expression quantity of C.cajan CcGDSL1 in different tissues(A)and leaf under different drought treatment days(B)

2.4 木豆CcGDSL1基因的時空表達

利用熒光定量PCR檢測木豆CcGDSL1基因的組織表達差異發現，該基因在木豆幼苗葉、莖和根中均表達，其中葉和莖中表達量差異較小，顯著高于根中表達量(圖5A)，說明木豆CcGDSL1基因表達具有組織特異性。以干旱和對照2個處理葉片cDNA為模板，進行熒光定量PCR擴增，檢測木豆CcGDSL1基因持續干旱條件下表達情況，隨著處理時間的增加，干旱和對照處理木豆CcGDSL1基因表達量均呈先降后升的趨勢，在處理5～15 d時，表達量降到最低，隨后表達量上升，在25～30 d時表達量趨于穩定，并且在整個處理時間內，干旱脅迫下其表達量均高于對照處理(圖5B)。

3 討 論

GDSL脂肪酶是廣泛存在于植物界的一個多基因家族，具有水解酶活性，能水解多種脂類物質[10]。近年來，人們從擬南芥、水稻、玉米、葡萄和楊樹等多種植物中發現的GDSL脂肪酶成員超過1100個，其中在擬南芥中共發現108個家族成員，葡萄中發現96個家族成員[11-12]。本研究在前期構建的木豆干旱脅迫SSH文庫基礎上，克隆獲得了1個木豆CcGDSL1基因的全長序列，豐富了植物GDSL脂肪酶家族成員。植物GDSL脂肪酶蛋白質的一級結構包括5個保守區域(I～V)，在酶催化過程中起重要作用的氨基酸殘基Ser(S)、Gly(G)、Asn(N)和His (H)分別位于I、II、III和V4個保守域中[13]。由氨基酸序列同源性分析發現，木豆CcGDSL1脂肪酶氨基酸序列與其他植物存在差異，但在這4個保守域中未發生變異。系統進化樹分析表明，GDSL酯酶在豆科植物進化中具有較高保守性。

Oh等[14]對1個含有GDSL結構域的分泌蛋白(GLIP1)進行亞細胞定位發現，GLIP1定位于胞外基質。奈婕菲等[15]構建了GFP融合表達載體，將1個楊樹GDSL蛋白定位于細胞壁。Ling等[12]利用亞細胞定位分析工具將99個擬南芥GDSL脂肪酶蛋白定位于內質網。還有研究報道將含有GDSL結構域的蛋白定位于細胞內膜和囊泡等[16]，本研究利用WoLF PSORT預測工具將CcGDSL1蛋白定位于液泡，這些蛋白在細胞亞結構的不同定位，顯示著不同GDSL具有的多種生物學功能[2]。

植物GDSL脂肪酶家族成員組織表達模式存在冗余性和特異性[15]，Lee等[17]研究發現，擬南芥與抗病相關的GDSL脂肪酶基因(AtGLP1)在幼苗、葉、根、莖和花中均有表達，而與之高度同源的AtGLP2卻僅在幼苗、莖和根中表達。奈婕菲等[15]發現，楊樹GDSL基因在不同莖節上轉錄表達豐度不同。本研究發現，木豆CcGDSL1基因在葉和莖中表達量接近，顯著高于根中表達量。

植物GDSL脂肪酶廣泛參與植物正常生長發育、器官形態建成和次生代謝等生理活動。近年來，越來越多文獻報道其參與逆境脅迫生理過程。Kram等[18]研究發現，藍花楹花蜜中的GDSL脂肪酶JNP1可以直接破壞微生物的細胞膜而抑制微生物活性，從而參與植物的抗逆反應。Kwon等[19]研究證明，擬南芥GLIP1蛋白能夠響應乙烯信號而激發系統抗性。本研究發現，木豆CcGDSL1基因在干旱脅迫下表達量升高，說明其有可能參與到木豆抗旱的生理過程。同時，干旱與對照處理隨著木豆幼苗的生長CcGDSL1基因均表現出先下降后上升的趨勢，說明該基因也參與到木豆生長發育過程，其原因可能是脂肪酶是脂代謝中的關鍵酶，能催化長鏈脂肪酸甘油酯水解為甘油和長鏈脂肪酸，而脂肪酸是生物體中重要的組成成分，可作為重要的信號分子參與細胞的生長發育[20]。由此可見，木豆CcGDSL1基因具有復雜功能，要想全面闡明該基因的功能還有待于進一步研究。

4 結 論

克隆獲得了木豆CcGDSL1基因序列，其ORF全長1107 bp，編碼369個氨基酸。生物信息學分析結果表明CcGDSL1脂肪酶為穩定的疏水蛋白，有20個磷酸化位點，定位于液泡，屬跨膜蛋白，與豆科植物GDSL脂肪酶同源性較高、進化關系較近。該基因具有組織表達特異性，在葉和莖的表達量顯著高于根中表達量，且干旱脅迫能誘導其大量表達，說明木豆CcGDSL1參與抗旱生理過程，其生理功能豐富。

[1]佟祥超，王麗曼，胡文靜，等.一個棉花GDSL脂肪酶基因的克隆與功能分析[J].作物學報，2013，39(7):1164-1171.

[2]李志蘭，華水金，蔣立希.植物GDSL酯酶家族基因的研究進展[J].農業生物技術學報，2014，22(7):916-924.

[3]BRICK D J，BRUMLIK M J，BUCKLEY JT，etal.A new family of lipolytic plant enzymes with members in rice，Arabidopsis and maize [J].FEBSLett，1995，377(3):475-480.

[4]HONG J，CHOIH，HWANG I，et al.Function of a novel GDSL-type pepper lipase gene，CaGLIP1，in disease susceptibility and abiotic stress tolerance[J].Planta，2008，227(3):539-558.

[5]NARANJO M，FORMENT J，ROLDAN M，et al.Overexpression of Arabidopsis thaliana LTL1，a salt-induced gene encoding a GDSL-motif lipase，increase salt tolerance in yeast and transgenic plants [J].Plant Cell&Environment，2006，29(10):1890-1900.

[6]鄭菲艷，鞠玉棟，黃惠明，等.木豆及其開發利用價值[J].福建農業科技，2016，4:65-68.

[7]劉秀賢，李正紅，鄧 疆，等.不同品種及單株木豆葉蛋白質含量的研究[J].生物質化學工程，2006，40(4):19-21.

[8]趙真忠.一種很有發展潛力的熱帶亞熱帶植物——木豆[J].福建熱作科技，2003，28(3):31-32.

[9]徐曉俞，李愛萍，鄭菲艷，等.木豆在南方水土流失治理中的作用及發展對策[J].福建農業科技，2015，9:52-54.

[10]凌 華.油菜GDSL脂肪酶基因BnLIP1的克隆及其原核表達[J].農業生物技術科學，2007，123(12):102-106.

[11]BEISSON F，GARDIES A M，TEISSERE M，et al.An esterase neosynthesized in post-germinated sun flower seeds is related to a new family of lipolytic enzymes[J].Plant Physiology and Biochemistry，1997，35(10):761-775.

[12]LING H.Sequence analysis of GDSL lipase gene family in Arabidopsis thalian a[J].Pakistan Journal of Biological Sciences，2008，11(5):763-767.

[13]郝曉云，蔡勇智，錢雯婕，等.植物GDSL脂肪酶家族研究進展[J].植物生理學報，2013，49(12):1286-1290.

[14]OH IS，PARK A R，BAE M S，et al.Secretome analysis reveals an Arabidopsis lipase involved in defense against Alternaria brassicicola[J].Plant Cell，2005，17(10):2832-2847.

[15]奈婕菲，程玉祥.一個楊樹GDSL基因組織表達的特性及其在擬南芥異源的表達[J].江蘇農業科學，2014，42(3):16-18.

[16]RIEMANN M，GUTJAHR C，KORTE A，et al.GER1，a GDSL motif-encoding gene from rice is a novel early light-and jasmonate-induced gene[J].Plant Biology，2007，9(1):32-40.

[17]LEE D S，KIM B K，KWON S J，et al.Arabidopsis GDSL lipase 2 plays a role in pathogen defense via negative regulation of auxin signaling[J].Biochem Biophys Res Commun，2009，379(4):1038-1042.

[18]KRAM BW，BAINBRIDGE E A，PERERAM A，etal.Identification，cloning and characterization of a GDSL lipase secreted into the nectar of Jacarandamimosifolia[J].PlantMol Biol，2008，68(1): 173-183.

[19]KWON S J，JIN H C，LEE S，et al.GDSL lipase-like 1 regulates systemic resistance associated with ethylene signaling in Arabidopsis [J].Plant Journal for Cell&Molecular Biology，2009，58(2):235 -245.

[20]QIN Y M，HU C Y，PANG Y，etal.Saturated very-long-chain fatty acids promote cotton fiber and Arabidopsis cell elongation by activating ethylene biosynthesis[J].Plant Cell，2007，19(11):3692 -3704.

(責任編輯 劉忠麗)

Cloning and Expression Analysis of GDSL Lipase Gene in Cajanus cajan

QIAO Guang1，WEN Xiao-peng1*，DING Gui-jie2
(1.Key Laboratory of Plant Resource Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region Ministry of Education，Institute of Agro-bioengineering，Guizhou University，Guizhou Guiyang 550025，China;2.Research Center for Forestry Resources and Environment，Guizhou University，Guizhou Guiyang 550025，China)

【Objective】The aim of the present paper is to discuss the adverse stress resistancemechanism of GDSL lipases.【Method】The GDSL lipase of C.cajan is cloned by RACE technology based on the preliminary study and then the expression characteristics are detected by fluorogenic quantitative PCR.【Result】An obtained GDSL lipase of C.cajan is named as CcGDSL1 and its total length of open reading frame is 1107 bp with 369 amino acids.The homology analysis shows that the amino acid sequence of CcGDSL1 has a high similarity with GDSL lipases of other legume plants.CcGDSL1 can express in leaf，stem and rootbut the expression quantity in leaf and stem is higher than in root significantly.Drought stress can increase the expression quantity of CcGDSL1 and the expression quantity of CcGDSL1 presents an expression pattern of first declining，then rising and finally stable with sustained drought.【Conclusion】CcGDSL1 may participate in stress reaction of C.cajan under drought stress.

Cajanus cajan;GDSL lipase;Cloning;Expression

S643.9

A

1001-4829(2017)8-1720-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.005

2016-12-17

國家自然科學基金項目“利用GeneFishing解析VA菌根增強木豆抗旱能力的分子機理”(30860224);貴州省科學技術基金項目“在轉錄水平解析木豆抗旱的分子機理”(20092076)

喬 光(1981-)，男，山西晉中人，博士，從事森林培育研究，E-mail:13518504594@163.com，*為通訊作者:文曉鵬，E-mail:xpwensc@hotmail.com。