金邊黃楊和金心黃楊葉綠素合成與葉綠體結構分析

朱雪云，李建謀，王海燕，孔凡芹

金邊黃楊和金心黃楊葉綠素合成與葉綠體結構分析

朱雪云，李建謀，王海燕，孔凡芹

(武漢生物工程學院園林系，湖北武漢 430415)

【目的】本文探索了金邊黃楊和金心黃楊彩葉形成的機理。【方法】利用分光光度計和電子顯微鏡等，對金邊黃楊和金心黃楊葉片黃色和綠色組織的葉綠素含量和葉綠體超微結構進行檢測。【結果】黃色組織的葉綠素a和葉綠素b含量均顯著低于綠色組織和對照大葉黃楊。黃色組織中葉綠素合成中間產物原卟啉IX(ProtoIX)、Mg-ProtoIX以及Pchlide的含量急劇降低。超微結構觀察發現黃色組織的葉綠體數量減少，內膜排列紊亂，缺乏有序的基粒類囊體。【結論】黃色組織葉綠素含量降低的原因可能是糞卟啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)向原卟啉IX(ProtoIX)合成過程出現障礙所致。

金邊黃楊;金心黃楊;黃色組織;葉綠素;葉綠體結構

【研究意義】金邊大葉黃楊(Euonymus japonicus L.var.aureamarginatus)和金心大葉黃楊(E.japonicus L.var.aureovariegatus)(以下簡稱金邊黃楊和金心黃楊)是衛矛科衛矛屬大葉黃楊(E.japonicus L.)的2個變種[1]。金邊黃楊葉緣為黃色，中央為綠色;而金心黃楊葉片中心呈黃色，葉緣為綠色。它們屬于鑲邊類彩葉植物。彩葉植物因其特殊的葉片顏色而具有較高的觀賞價值，然而我國原產彩葉植物品種較少，彩葉形成機理和育種體系尚未建立[2]。【前人研究進展】彩葉形成的遺傳因素主要歸納為以下幾種:核基因突變、轉座子插入導致基因重組、質體發生突變、形成植物嵌合體、半配合遺傳等[3-5]。Chen等[6]總結前人的研究將彩葉的形成機制歸納為2種，一種是由核基因發生突變導致葉片一部分組織或細胞產生有缺陷的葉綠體，但綠色部分和白色(黃色)部分的遺傳背景是一致的，而突變表型只局限在白色或黃色組織中[7];另一種機制是白色(黃色)組織與綠色組織的遺傳組成(核基因或質基因)不同，白色(黃色)組織具有突變的基因型而綠色組織具有野生型基因型，嵌合體[8]、轉座子刪除或插入[9]屬于此種情況。盡管彩葉植物的遺傳模式各異，但葉片彩斑形成歸根結底是色素分布不均導致。葉片黃-綠(白-綠)彩斑與葉綠體色素相關。而葉綠體色素含量的變化主要與葉綠體色素合成和降解代謝，或者與葉綠體的發育、結構及其蛋白質的異常有關。【本研究切入點】本研究對金邊黃楊和金心黃楊彩葉葉綠素合成過程以及葉綠體結構進行分析，初步掌握其彩葉形成的生理生化特點。【擬解決的關鍵問題】為彩葉形成的分子機制研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選擇長勢一致的金邊黃楊(Euonymus japonicus L.var.aureamarginatus)、金心黃楊(E.japonicus L. var.aureovariegatus)和大葉黃楊(E.japonicus L.) (對照)當年生枝條形態學上端的第二對完全展開的成熟葉片為試材。各項指標測定時，將金邊黃楊和金心黃楊葉片的綠色和黃色組織切分開，分別進行測定。

1.2 研究方法

1.2.1 葉綠體色素含量測定 取0.1 g葉片剪碎研磨加入少量95%的乙醇混合至勻漿，轉入離心管并定體積至10 mL，于8000 r/min的轉速下離心15 min，在波長665、649和470 nm下測定吸收值，計算葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素的含量。

1.2.2 δ-氨基乙酰丙酸(ALA)的測定 ALA的提取及其含量測定按照王凌健等[10]方法，分別稱取金邊和金心黃楊葉片綠色和黃色組織各0.2 g，加入4 %的三氯乙酸充分研磨，8000 r/min離心5 min，取1 mL提取液加入500μl NaAc(1 M)和50μl乙酰丙酮，沸水浴10 min后冷卻到室溫，再8000 r/min離心5 min，取1.5mL上清液加入1.5 mL Ehrlich-Hg試劑在黑暗中反應15min后，在553 nm處測定吸光值。

1.2.3 膽色素原(PBG)的測定 PBG的含量測定按照Bogorad[4]方法，分別稱取金邊和金心黃楊葉片綠色和黃色組織各0.2 g，液氮研磨后，加入5 mL提取緩沖液(0.6 mol·L-1Tris，0.1M EDTA，pH8.2)充分研磨后，12 000 r/min離心10 min，取1.5 mL上清液加入1.5 mL Ehrlich-Hg，在黑暗中反應15 min，553 nm處測定吸光值。

1.2.4 尿外啉原Ⅲ(UrogenⅢ)和糞外啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)的測定 尿卟啉原Ⅲ和糞卟啉原Ⅲ含量的測定按照Bogorad[11]方法，稱取葉片綠色和黃色組織各0.2 g，液氮研磨后，加入5 mL磷酸緩沖液(0.067 M pH 6.8)，12 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清加入150μl1%的Na2S2O3，劇烈震蕩，光照20min，用冰醋酸(1 mol/L)調pH到3.5，然后用乙醚萃取，分層后，測定水相在405.5 nm處吸光值，得UrogenⅢ。測定醚相的399.5 nm處的吸光值，得CoprogenⅢ。

1.2.5 原外啉IX(ProtoIX)、Mg-原外啉IX(Mg-ProtoIX)、原葉綠素酸酯(Pchlide)含量的測定 采用Hodgins和van Huystee的方法[12]，分別取0.2 g，綠色和黃色葉片組織，加入5 mL 80%的丙酮研磨，在12 000 r/min、4℃下離心10 min，取上清液，用80 %的丙酮稀釋到25 mL，測定575、590和628 nm的吸光值。

1.3 數據處理分析

使用SPSS統計分析軟件對數據進行方差分析和差異顯著性分析。葉綠素合成各中間產物均以大葉黃楊(視為100%)為參照計算相對含量。

2 結果與分析

2.1 金邊黃楊和金心黃楊葉綠體色素含量分析

與大葉黃楊葉片相比，金邊黃楊和金心黃楊葉片的黃色組織中葉綠素a、b及類胡蘿卜素的含量均顯著低于大葉黃楊和綠色組織的含量(表1～2)。這一結果與肉眼觀察的現象一致。

2.2 金邊和金心黃楊葉綠素合成中間產物分析

大葉黃楊為對照，綠色和黃色組織各中間產物含量均以相對含量表示。綠色組織各中間產物的含量相對穩定，而黃色組織葉綠素合成過程中各中間產物的相對含量變化幅度較大。金邊黃楊黃色組織的δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、膽色素原(PBG)、糞卟啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)的含量顯著低于綠色組織。特別是由CoprogenⅢ向ProtoIX轉變時出現急劇降低現象(圖1)。金心黃楊黃色組織中間產物的變化趨勢與金邊黃楊類似，但黃色組織ALA的含量卻遠遠高于綠色組織，從PBG開始黃色組織各中間產物的含量出現下降趨勢，至原卟啉IX(ProtoIX)陡然下降。由此可見，2種彩葉植物黃色組織的葉綠素含量降低可能是由于在代謝層面上由CoprogenⅢ向ProtoIX合成過程出現障礙。

表1 金邊黃楊成熟葉片黃色和綠色組織中葉綠體色素含量Table 1 Chlorophyll contents in both green and yellow tissues of E.japonicus var.Aureamarginatus

表2 金心黃楊成熟葉片黃色和綠色組織中葉綠體色素含量Table 2 Chlorophyll contents in both green and yellow tissues of E.japonicus var.Aureovariegatus

2.3 金邊和金心黃楊綠色和黃色組織中葉綠體形態結構分析

利用透射電子顯微鏡分別觀察了金邊黃楊和金心黃楊綠色和黃色組織中葉綠體形態結構和類囊體的垜曡程度。通過觀察發現黃色組織的細胞內葉綠體的數量普遍較少，而且葉綠體中內膜排列紊亂，缺乏有序的基粒類囊體，且嗜鋨顆粒多而大，甚至出現空泡現象(圖2)。光合作用相關的色素、蛋白質和酶將失去其依存的場所。

3 討 論

目前，對金邊黃楊和金心黃楊彩葉形成的機理研究國內外報導較少。2種彩葉植物的黃色組織葉綠素和類胡蘿卜素的含量相比正常的綠色組織和大葉黃楊均明顯降低。這與張開明等[13]和莊猛等[14]對金邊黃楊色素測定結果相符。再次說明金邊黃楊綠色和黃色組織顏色差異的直接原因是葉綠素的含量降低。然而，導致葉綠素含量降低的原因涉及方面較廣，十分復雜。可能是由于葉綠素在合成過程中某一環節受阻，可能是葉綠素降解過程加速，也可能是葉綠體發育或結構異常等等。

不少報道顯示，彩葉和黃化突變體葉綠素含量降低是由于葉綠素合成過程受阻引起[15-17]。為進一步搞清楚葉綠素含量降低的原因，本研究對葉綠素合成的過程進行了分析。分別測定了葉綠素合成中幾個關鍵的中間產物，δ-氨基乙酰丙酸(ALA)、膽色素原(PBG)、尿卟啉原Ⅲ(UrogenⅢ)、糞卟啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)、原卟啉IX(ProtoIX)、Mg-原卟啉IX (Mg-ProtoIX)、原葉綠素酸酯(Pchlide)等成分在黃色組織中的含量變化。相比綠色組織和大葉黃楊葉片，黃色組織的ALA、PBG、UrogenⅢ和CoprogenⅢ相對含量均有降低現象，但從ProtoIX開始，Mg-ProtoIX以及Pchlide減少的幅度陡然上升。結果說明黃色組織的葉綠素合成過程受阻，且受阻位點可能在CoprogenⅢ和ProtoIX之間的反應環節上。劉彩云[18]對白肋型煙草葉綠素合成過程分析發現合成過程的后期中間產物ProtoIX、Mg-ProtoIX和Pchlide的含量均顯著低于對照，與本研究的受阻位點一致。類似的研究結果在芥菜型油菜黃化突變體L638-y葉綠素合成中出現[16]。高等植物葉綠素生物合成由16種酶參與完成，而由CoprogenⅢ到ProtoIX的轉變是在糞卟啉原氧化脫羧酶和原卟啉原氧化酶的催化下完成[19]。推測這一反應環節中相關的酶也許存在活性降低或表達量降低的可能性。

圖1 金邊黃楊(A)和金心黃楊(B)綠色和黃色組織葉綠素合成中間產物先對含量分析Fig.1 Analysis of the chlorophyll biosynthesis intermediatesboth E.japonicus.var.Aureamarginatus(A)and E.japonicus var.Aureovariegatus(B)

圖2 金邊黃楊和金心黃楊綠色和黃色組織中葉綠體的形態結構Fig.2 Chloroplastmicrostructure in green and yellow tissues of E.japonicas var.Aureamarginatus and E.japonicus var.Aureovariegatus

葉片黃化的另一可能原因就是葉綠體結構和發育出現問題。葉綠體類囊體膜是一個由各種葉綠素——蛋白質復合體高度有組織性構成的體系[20]。主要有光系統系Ⅰ(PSI)、光系統Ⅱ(PSII)及捕光色素復合體(LHC)等。這些復合體中光合色素可以達到35%[21]。有研究指出光合作用相關蛋白質的明顯減少引起葉綠素合成缺陷[22]。因此，與葉綠素結合的蛋白質如果出現含量降低、缺失或結構異常等變異很可能間接引起葉綠素含量降低。擬南芥LHCs蛋白質顯著降低甚至缺失導致基粒類囊體的垛疊出現異常同時引起葉綠素缺失[23]。油菜葉綠素缺失突變體的LHCs、PSI、PSII、細胞色素復合體b6/f(Cyt b6f)以及葉綠體ATP合酶的豐度都出現了不同程度的降低[24]。本研究對金邊和金心黃楊綠色和黃色組織中的葉綠體分別進行觀察。結果顯示，黃色組織中葉綠體內膜沒有進行有序折疊，也無明顯的基粒結構，顯然在結構上屬于不正常的葉綠體。葉綠體的基粒類囊體是光系統Ⅰ和光系統Ⅱ，以及色素-蛋白復合體實現功能必需依附的場所，由此可以推測黃色組織的光合作用和能力較低。這在莊猛等[14]的研究中得到印證。同時也說明基粒類囊體的缺失與色素含量降低存在正相關現象。有報道認為，葉綠體結構與葉綠素合成之間關系主要存在2種可能，一種是催化葉綠素合成的酶基因突變使葉綠素合成受阻，而膜結構發育受阻只是葉綠素缺乏和葉綠素合成受阻的多效性反應;另一種可能是基因突變導致膜發育受阻，造成膜上酶復合體缺失而使葉綠素合成阻滯[25]。本研究中，黃色組織葉綠體結構異常與葉綠素含量降低之間如何相互影響以及它們之間的因果關系還有待進一步研究。

4 結 論

綜上所述，金邊黃楊和金心黃楊彩葉產生的直接原因是因為葉綠素含量降低所致。而引起葉綠素含量降低的生理代謝問題產生在葉綠素合成過程中糞卟啉原Ⅲ(CoprogenⅢ)到原卟啉IX(ProtoIX合)成過程。

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(責任編輯 陳 虹)

Analysis of Chlorophyll Biosynthesis and Chloroplast M icrostructure in Euonymus japonicus.var.Aureamarginatus and E.japonicus var.Aureovariegatus

ZHU Xue-yun，LIJian-mou，WANG Hai-yan，KONG Fan-qin
(Wuhan Bioengineering Institute，Landscape Gardening Department，HubeiWuhan 430415，China)

【Objective】In this paper，themechanism of the colored leaf in Euonymus japonicus.var.Aureamarginatus and E.japonicus var. Aureovariegatus were studied.【Method】The spectrophotometry and electron microscope technique were used，and their chlorophyll contents and chloroplast structurewere detected.【Result】The contentof chlorophyll in the yellow tissuesof both E.japonicus.var.Aureamarginatus and E.japonicus var.Aureovariegatus were much lower than the green tissues and the control E.japonicus.Furthermore，the intermediate products in the chlorophyll biosynthesis processwere analyzed，which indicated that Protoporphyrin IX weremarkedly decreased in yellow tissues of both varietas than green tissues and the control.For another，therewere few normal thylakoids in the chloroplastof yellow tissues of both varietas by transmission electronmicroscope analysis.【Conclusion】The chlorophyll biosynthesiswere blocked in coproporphyrinogenⅢconverted to Protoporphyrin IX in the yellow tissues.

Euonymus japonicus.var.Aureamarginatus;Euonymus japonicus var.Aureovariegatus;Yellow tissue;Chlorophyll;Chloroplast structure

S687

A

1001-4829(2017)8-1767-05

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.012

2016-07-20

武漢市教育局項目(2010097);國家自然科學基金(31401920);武漢市屬高校產學研結合項目(201435)

朱雪云(1981-)，女，河北邯鄲人，博士，副教授，研究方向植物遺傳育種，E-mail:zhuxueyun1981@163.com。