4種蟲生真菌對儲糧害蟲黃粉蟲不同蟲態的生防研究

徐 玲，張鴨關，陳自宏*，陳 凱，楊曉娜

4種蟲生真菌對儲糧害蟲黃粉蟲不同蟲態的生防研究

徐 玲1，張鴨關2，陳自宏1*，陳 凱1，楊曉娜1

(1.保山學院高黎貢山生物資源研究所，云南保山 678000;2.曲靖師范學院化學化工學院，云南曲靖 655011)

【目的】通過研究蟲生真菌對黃粉蟲不同蟲態的生防效果，以期為儲糧害蟲的生物防治提供參考。【方法】在實驗室模擬干燥的儲糧環境，測定了4種蟲生真菌菌株(金龜子綠僵菌MAX-2、玫煙色棒束抱IFK-20、球抱白僵菌BBL-3、蟬棒束抱ICG-1)對黃粉蟲3種不同蟲態(8齡幼蟲、蛹、剛羽化的成蟲)的生防效果。【結果】在模擬儲糧環境中，BBL-3對3種蟲態的毒力都較低，說明該菌株不適宜在干燥條件下發揮作用;MAX-2對幼蟲和成蟲的毒力都最高，IFK-20其次;抱子懸液處理蛹，ICG-1致死速度最快，其次為MAX-2與IFK-20;ICG-1在模擬儲糧環境中對幼蟲和成蟲無毒力，但用其抱子懸液處理蛹，毒力卻達到最高，說明蟲生真菌有的對不同蟲態的毒力較穩定，而有的可能只在昆蟲某些發育階段或在特定環境中發揮有效作用。對MAX-2侵染黃粉蟲不同蟲態的特征進行了描述，發現其防治害蟲的效果具有持續性，部分被感染的幼蟲和蛹可以帶菌生存，但生活力下降，有的發育畸形，最終都會死亡。【結論】不同蟲生真菌菌株對不同蟲態的毒力差異顯著，同一菌株對不同蟲態的毒力也不同。除ICG-1外其它3株菌在黃粉蟲不同發育階段都具有較好防效，MAX-2對3種蟲態的持續防效最好，有望應用于儲糧害蟲的生物防治。

蟲生真菌;儲糧害蟲;黃粉蟲;毒力;生物防治

糧食安全直接關系到國家安全和社會穩定，儲糧害蟲是直接影響糧食產量和品質的重要因素之一。化學農藥雖然見效快，但往往毒性高、用量大、用藥次數頻繁，安全危害性極大[1]。【研究意義】蟲生真菌是一種重要的環境友好型生防資源，但其活性在干燥的儲糧環境中會受到限制。真菌發揮活性需要較高濕度條件，在相對干燥的儲糧環境中其作用容易受到限制[2]，改良菌株的耐旱性或篩選耐旱的病原真菌有望提高對儲糧害蟲的防治，減少農藥對人畜和環境的危害。【前人研究進展】儲糧害蟲又稱倉庫害蟲，其種類多、分布廣、繁殖力高、適應性強，使許多儲糧、中藥材、食品、干果等受到巨大損失。近年來，隨著社會經濟文明的發展，尋找綠色的儲糧害蟲防治方法來替代化學保護劑和熏蒸劑的研究越來越受到人們的重視[3]。生物防治是害蟲綜合治理的重要組成部分，具有環境友好、安全無毒、費用較低等優點，目前在防治儲糧害蟲方面主要應用的方法包括利用昆蟲激素、天敵昆蟲、病原微生物等。用病原微生物防治儲糧害蟲已有成功范例，如蘇云金芽孢桿菌、冰核細菌等[4]，但用蟲生真菌防治儲糧害蟲的研究較有限。蟲生真菌可穿透害蟲表皮進行侵染，具有較強流行性和持續控制的優勢，加強對防治儲糧害蟲的真菌資源研究具有重要意義。【本研究的切入點】儲糧害蟲的發育過程需經歷卵、幼蟲、蛹、成蟲4個階段，不同蟲態具有不同的生命活動狀態，對蟲生真菌的敏感性也不同[5]。許多儲糧害蟲都具有耐干旱的特性，黃粉蟲是一種較普遍的儲糧害蟲，在含水量很低的干燥環境中能健康完成整個生活史。【擬解決的關鍵問題】本研究以黃粉蟲生活史不同階段的蟲態為對象，用干燥麩皮培養基模擬儲藏糧食，分析應用較廣泛的蟲生真菌金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)、球孢白僵菌(Beauveria bassiana)、玫煙色棒束孢(Isaria fumosorosea)、蟬棒束孢(Isaria cicadae)在干燥環境中感染黃粉蟲不同蟲態的效果，為儲糧害蟲的生物防治研究奠定基礎。

表1 蟲生真菌菌株的來源Table 1 Origin of entomogenous fungus strains

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株:從云南省內不同地區分離純化得到4種蟲生真菌菌株(表1)。

昆蟲材料:由保山學院高黎貢山生物多樣性資源開發利用研究室通過無菌培養形成的黃粉蟲(發明專利號ZL201110360999.7)[6]生活史不同階段蟲態。

原菌劑培養基M1:麩皮400 g、玉米粉100 g、米糠100 g、自來水600 mL，拌勻后分裝入培養瓶，100克/瓶，常規滅菌30 min備用。

干燥麩皮培養基M2:麩皮500 g、玉米粉100 g、黃豆粉50 g，混勻分裝入150 mL罐頭瓶，20 g/瓶，常規滅菌30 min備用。

1.2 研究方法

1.2.1 蟲生真菌原菌劑制備 在PPDA培養基平皿上活化4種蟲生真菌菌株，用直徑5 mm的打孔器分別取3個菌塊接種到原菌劑培養基M1上，攪拌均勻，于25℃恒溫培養20 d，得到富含不同蟲生真菌分生孢子的培養物。將各培養物自然陰干，粉碎，過60目篩，制成蟲生真菌原菌劑，測得其含水率為8%。采用平板稀釋涂布法檢測每克培養基中蟲生真菌分生孢子含量。

1.2.2 蟲生真菌接種黃粉蟲幼蟲和成蟲 用干燥麩皮培養基M2模擬黃粉蟲生長的儲糧環境。分別取各蟲生真菌原菌劑適量，接入裝有100 g培養基M2的罐頭瓶中，攪拌均勻。根據原菌劑的孢子含量調整不同菌株的接種量，使終濃度約為5×108孢子/g。

分別選個體大小相近的8齡幼蟲、剛羽化的成蟲和羽化1周后成熟的成蟲作為寄主進行接種。每瓶加入10只寄主，重復4瓶。以空白培養基M2(不加蟲生真菌分生孢子)中培養黃粉蟲幼蟲(或成蟲)為對照。在室溫下(20～25℃)進行培養，每天觀察計數寄主感染及死亡數量。

1.2.3 蟲生真菌接種黃粉蟲蛹 分別取適量蟲生真菌原菌劑，加入到含20 mL無菌水的小燒杯中，滴加2滴吐溫80，攪拌均勻制成孢子懸液，調整孢子懸液濃度為5×108孢子/mL。選剛化蛹的黃粉蟲蛹作為寄主進行接種，將蛹在孢子懸液中蘸1 s，在無菌濾紙片上吸干表面水分后放置在含無菌濾紙片的平皿內，每皿放5只，每個菌株重復4皿。以黃粉蟲蛹在無菌水中蘸1 s，吸干表面水分后放置在含無菌濾紙片的平皿內為對照。在室內溫濕度下進行靜置(不進行保濕處理)，每天觀察計數蛹感染及死亡數量。

圖1 接種蟲生真菌后黃粉蟲逐日累計死亡率Fig.1 Cumulativemortality rates of T.molitor every day after inoculated by entomogenous fungi

2 結果與分析

2.1 蟲生真菌菌株對黃粉蟲的毒力檢測

分別用4種蟲生真菌菌株處理黃粉蟲幼蟲、蛹和剛羽化的成蟲，結果顯示，對照幼蟲、蛹和成蟲都正常生長，沒有出現死亡現象，而接種了蟲生真菌的黃粉蟲不同蟲態都出現了不同程度的死亡情況。

黃粉蟲幼蟲和成蟲在干燥麩皮培養基中爬行能力較強，并大量進食含孢子的基質，易接觸孢子導致被感染。從昆蟲的逐日累計死亡率和半致死時間(LT50)來看，4個蟲生真菌菌株對黃粉蟲幼蟲和剛羽化的成蟲的毒力都為金龜子綠僵菌MAX-2最強，玫煙色棒束孢IFK-20其次，球孢白僵菌BBL-3較弱，而蟬棒束孢ICG-1無毒力(圖1，表2)。蟲生真菌接種幼蟲，MAX-2和IFK-20都在接種第7天幼蟲開始出現死亡。MAX-2的LT50最短，平均為8.375 d(201 h)，與其它菌株差異顯著，第11天死亡率達到最高為80%。IFK-20的LT50平均為10 d(240 h)，顯著短于BBL-3，第12天死亡率達到最高為65 %。BBL-3接種第8天幼蟲開始出現死亡，LT50平均為11.5 d(276 h)，第12天死亡率達到最高為50 %。蟲生真菌接種剛羽化的成蟲，MAX-2、IFK-20和BBL-3都在接種第4天成蟲開始出現死亡，MAX-2的致死速度最快，LT50平均為5.167 d(124 h)，與其它菌株差異顯著，第7天死亡率達到最高為100%。IFK-20的LT50平均為5.979 d(143.5 h)，BBL-3的LT50平均為6.063 d(145.5 h)，二者差異不顯著;但IFK-20殺蟲效果持續時間較長，第9天死亡率達到最高為97.5%，BBL-3接種第8天死亡率達到最高為90%，說明IFK-20對成蟲的生防效果也具有一定優勢。用ICG-1接種后，黃粉蟲幼蟲和成蟲都沒有出現感染和死亡現象，說明在干燥的儲糧環境中ICG-1對黃粉蟲幼蟲和成蟲均無毒力。

黃粉蟲蛹在分生孢子懸液中蘸1 s使孢子附著到蛹上，然后吸干表面水分并進行靜置處理(不保濕)。通過此方法處理，4個蟲生真菌菌株都能高效侵染蛹，且致死率都能達到100%。從蛹的逐日累計死亡率和LT50來看，ICG-1的致死速度最快，接種第2天開始出現死亡，LT50平均為3.083 d(74 h)，與其它菌株差異顯著，完全致死時間為5 d。MAX-2、IFK-20和BBL-3都為接種第3天開始出現死亡。MAX-2的LT50平均為4.917 d(118 h)，略短于IFK-20，但差異不顯著，其完全致死時間較短為7 d。IFK-20的LT50平均為5.083 d(122.5 h)，完全致死時間為8 d。BBL-3的致死速度最慢，LT50平均為7. 417 d(178 h)，完全致死時間為10 d。

表2 蟲生真菌菌株對黃粉蟲不同蟲態的毒力Table 2 The efficacy of entomogenous fungus strains against T.molitor at different stages

圖2 MAX-2對黃粉蟲不同蟲態的侵染特征Fig.2 Infective characteristics of MAX-2 against T.molitor at different stages

2.2 金龜子綠僵菌MAX-2對黃粉蟲不同蟲態的侵染特征

黃粉蟲幼蟲在接種了金龜子綠僵菌原菌劑的麩皮培養基上(圖2a)培養。幼蟲和成蟲會鉆到培養基中或在培養基表面爬行，體表接觸分生孢子，取食過程中也會促進分生孢子進入腸道，為分生孢子附著于黃粉蟲提供了機會。黃粉蟲蛹一般在麩皮培養基中靜止不動，有時可以擺動腹部進行短距離移動，由于運動能力較差，附著在蛹表面的分生孢子不易清除，易被蟲生真菌分生孢子感染。

幼蟲被感染初期，蟲體行動變得緩慢，3～4 d后蟲體體壁局部出現黑褐色斑點，黑斑逐漸蔓延至1～2個體節(圖2b)。幼蟲在死亡之前都會爬到麩皮培養基表面靜止不動，死亡蟲體逐漸變干(圖2d)。如果在培養基表面噴灑無菌水，培養基和蟲體體表很快形成綠僵菌菌絲和孢子(圖2e)。少數幼蟲可以通過脫皮而暫時逃脫和幸存下來(圖2c)，將其挑到新的未接菌培養基中繼續培養，可以生長至化蛹或成蟲階段，但生長較緩慢，生活力低，最終逃脫不了死亡，有的在蛹的階段死亡，有的能繼續羽化為畸形成蟲，即使個別能形成正常成蟲也會在羽化完后很快死亡。

被感染的蛹有的迅速死亡，有的體壁局部也形成黑褐色斑點或斑塊后死亡(圖2f-g)。死亡的蛹如果保持在此干燥培養基上則會逐漸變干(圖2j)，如果轉移到濕潤環境或在培養基表面噴灑水分則綠僵菌菌絲和孢子會迅速布滿培養基和蛹的表面(圖2k-l)。少數被感染的蛹能夠進行羽化，發育形成畸形成蟲后死亡(圖2h-i)，即使能發育為正常成蟲也會在成蟲早期死亡。

被感染的成蟲會多數在剛發育為體表淺黃褐色(圖2m-n)或深黃褐色(圖2o-p)階段時即死亡，少數可能發育到體表顏色變為黑褐色(圖2q-r)時才死亡。成蟲被感染后會爬到麩皮培養基表面靜止不動直至死亡，并變干。有的成蟲腹部也會出現黑褐色斑點，在保持濕潤的環境中，蟲體表面會形成菌絲和孢子層(圖2s)。

3 討 論

自然界中蟲生真菌資源非常豐富，利用蟲生真菌來防治儲糧害蟲的研究還需加強。本研究為尋找實驗室分析蟲生真菌防治儲糧害蟲簡便易行可靠的方法，根據黃粉蟲生活史不同階段蟲態的活動能力不同，采用了不同的施菌方式以促進其感染。在實驗室處理或飼養的昆蟲大都處于受脅迫、免疫機制受抑制的狀況，所以實驗室生測環境要盡量接近正常的飼養環境[7]。Kavallieratos等[8]用真菌孢子懸浮液分別處理儲糧害蟲玉米象及其食物來評價幾種蟲生真菌的生防效果，發現食物缺乏時害蟲更易被致死。儲糧倉庫通常封閉，環境穩定，儲藏糧食堆積，害蟲的食物充足，危害期長，病原真菌的自然發生率較低[9]。本研究采用蟲生真菌的原菌劑與干燥麩皮培養基混合后處理黃粉蟲幼蟲和成蟲，幼蟲和成蟲階段活動能力強，需要大量進食，用干燥麩皮培養基模擬儲藏糧食以為其提供充足的食物。糧食儲藏期間要求較低的含水量，如小麥粉[10]和玉米粒[11]通常應控制水分低于14%方能安全收儲。干燥麩皮培養基配置不加水分，滅菌后含水量為8%，低于多數儲糧要求的含水量。以不接種真菌的干燥麩皮培養基飼養昆蟲為對照，對照生命力旺盛，可以順利完成其生活史。蟲生真菌生防制劑包括原菌劑、粉劑、懸乳劑、顆粒劑、無紡紗布條等[12]，儲糧在存放過程中需要干燥防霉變，故儲糧害蟲的防治選擇原菌劑或粉劑更具實用性。原菌劑的制備仿照柴新義[13]和黃寶靈[14]生產蟲生真菌粉劑的方法，并進行了簡化。Miolan等將蠶白僵菌分生孢子和高嶺土均勻混合后施于儲藏的玉米棒上，分別放入2種倉蟲，分析蠶白僵菌對儲藏玉米棒中大谷長蠢和玉米象的防治效果[15]。本研究處理儲糧害蟲的方法與其類似，都是給害蟲提供模擬的儲糧環境，再接種蟲生真菌。黃粉蟲蛹運動能力差，如果也接入干燥麩皮培養基中，通常在基質表面靜止不動，而培養基基質較干燥、顆粒較大(圖2a)，蛹體表接觸孢子的機會較少，不易感染，且蛹不需要進食，不必提供基質作為食物，故改用在分生孢子懸液中蘸1 s使孢子附著到蛹上后吸干表面水分，并進行不保濕靜置處理。此處理中，蛹通常靜止不動，偶爾會擺動腹部進行短距離移動，運動幅度很小，不易將分生孢子脫落，感染的幾率較大，死亡率較高。

蟲生真菌不同菌株間的毒力、產孢能力和環境適應能力差異都很大，篩選毒力高、環境適應能力強的菌株可以提高蟲生真菌的生防應用潛力[16-17]。本研究在干燥的模擬儲糧環境中檢測4個蟲生真菌菌株對黃粉蟲不同蟲態的毒力，結果顯示不同菌種或菌株的毒力差異較大，同一蟲生真菌對昆蟲不同蟲態的毒力也存在差異。有的菌株對黃粉蟲不同蟲態毒力都較高，如綠僵菌MAX-2對幼蟲和成蟲的毒力都最高，對蛹的毒力也較高;玫煙色棒束孢IFK-20對幼蟲、蛹和成蟲的毒力都僅次于金龜子綠僵菌MAX-2。有的菌株對黃粉蟲不同蟲態的毒力都較低，如球孢白僵菌BBL-3。而有的菌株只在黃粉蟲某些發育階段具有毒力，如蟬棒束孢ICG-1對幼蟲和成蟲都沒有出現感染和致死的情況，但其對蛹的毒力卻超過金龜子綠僵菌MAX-2，達到最高，這可能與不同蟲態的結構及接種方式、接種環境不同有關，其侵染機制還有待研究。較多的研究發現綠僵菌和白僵菌對儲糧害蟲生防效果較好[7-9，18]，但同一種真菌不同菌株間的活性存在著很大的差異，如Adane等[19]分離的1個白僵菌菌株對玉米象有很強抑制作用，而Moino[20]等用61個白僵菌菌株控制玉米象卻只有微弱的活性。本研究中球孢白僵菌BBL-3對幼蟲、蛹和成蟲的毒力都較低，而金龜子綠僵菌MAX-2對黃粉蟲幼蟲、成蟲的毒力最高，對蛹的毒力也較高，這可能與菌株的毒力和環境適應能力有關。Searle等[21]研究白僵菌抑制鋸谷盜的作用，發現環境濕度是一個關鍵因素，在糧食安全水分的儲藏條件下，白僵菌難于控制鋸谷盜的數量。綠僵菌菌株MAX-2具有較強的耐旱侵染能力[22]，與其它蟲生真菌菌株相比具有毒殺速度較快、累計致死率較高的優勢，說明該菌株在儲糧害蟲的生物防治中具有較大的應用潛力。玫煙色棒束孢IFK-20對不同蟲態的毒力都僅次于MAX-2，蟬棒束孢ICG-1對黃粉蟲蛹的毒力甚至高于MAX-2，這些菌株在儲糧害蟲不同階段的生防應用潛力值得研究。

在干燥的模擬儲糧環境中接種蟲生真菌，剛羽化的成蟲被致死的速度更快，分析原因一方面可能是實驗的幼蟲蟲齡(8齡)較高，而成蟲為剛羽化，其抗侵染的能力存在差異;另一方面可能是由于黃粉蟲幼蟲較耐干旱脅迫[23]，故在干燥的模擬儲糧環境中對病原菌侵染的抗性較強。李世廣[23]發現同一菌株對不同生理狀態的棉鈴蟲毒力差異顯著，低齡幼蟲較為敏感，剛脫皮幼蟲極易受感染。閆鵬飛[24]等報道不同蟲態的扶桑綿粉蚧對蠟蚧輪枝菌的敏感性由高到低為2齡若蟲、成蟲、3齡若蟲、1齡若蟲。試驗中還發現，部分被感染的幼蟲可以通過脫皮而暫時逃脫幸存下來，部分被感染的蛹也可以帶菌生存并羽化為成蟲，但它們最終都逃脫不了死亡的命運，且在帶菌生存的過程中生活力下降，可能出現發育畸形，說明蟲生真菌防治害蟲的效果具有持續性。李世廣等[25]報道，白僵菌處理煙青蟲幼蟲，有的體內帶菌而不立即死亡，但生活力和繁殖力降低;白僵菌處理棉鈴蟲幼蟲，致死效應可持續到成蟲期。用球孢白僵菌處理玉米可以至少持續保護玉米6個月免遭玉米象危害。

4 結 論

在模擬的干燥儲糧環境中，不同蟲生真菌菌株對黃粉蟲不同蟲態的毒力差異顯著，同一菌株對不同蟲態的毒力也不同。MAX-2對幼蟲和成蟲的毒力都最高，IFK-20其次，這2株菌對蛹也具有較高的致病力。綜合來看，MAX-2對3種蟲態的持續防效最好，在儲糧害蟲的生物防治上具有較大的應用潛力。BBL-3在干燥條件下對3種蟲態都具有毒力，但毒力都較低;ICG-1用孢子懸液處理蛹時具有最高的毒力，但在干燥條件下對幼蟲和成蟲無毒力，這2株菌株不適宜應用于儲糧害蟲防治。

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(責任編輯 王家銀)

Biocontrol of 4 Entomogenous Fungi on Different Stages of Tenebrio molitor

XU Ling1，ZHANG Ya-guan2，CHEN Zi-hong1*，CHEN Kai1，YANG Xiao-na1
(1.Institute of Biological Resources of Gaoligong Mountains，Baoshan University，Yunnan Baoshan 678000，China;2.College of Chemistry and Environmental Science，Qujing Normal University，Yunnan Qujing 655011，China)

【Objective】The biocontrol effects of different entomogenous fungus on different stages of Tenebriomolitor were tested so as to provide a reference for biological control of stored grain insects.【Method】In dry environment with simulated grain storage，the effects of 4 strains(Metarhizium anisopliae MAX-2，Isaria fumosorosea IFK-20，Beauveria bassiana BBL-3，Isaria cicadae ICG-1)on 3 stages of T. molitor(larvae of8 instars，pupa，newly emerged adults)were tested.【Result】In the environmentwith simulated grain storage，BBL-3 had relatively low virulence to 3 stages of insects，showing that itwas not appropriate to effect in desiccation.The virulence of MAX-2 was the highest both to the larvae and the adults，IFK-20 was the second.For the pupae treated by spore suspension，the lethal speed of ICG-1 was the fastest，then MAX-2 and IFK-20.ICG-1 showed no virulence to the larvae and the adults in the environmentwith simulated grain storage，but its virulence could reach the highest，suggesting that some of the entomogenous fungi could keep stable virulence at different stages of insects，while somemight only play an effective role at certain developmental stage of insects or in specific environment.The infective characteristics of MAX-2 against T.molitor at different stageswere described，showing that its control efficacy was sustainable.Some of the infected larvae and pupa could survive as carriers，while their viability declined and some turned developmentalmalformation，eventually leading to death.【Conclusion】The virulence for strains of different specieswas significantly differentand the virulence for the same strain to different stages of insectswas also different.These strains except ICG-1 had good effect at different stages of T.molitor and MAX-2 showed the best sustainable efficacy to 3 stages of T.molitor，indicating hopeful application for biological control of stored grain insects.

Entomogenous fungus;Stored grain insects;Tenebriomolitor;Virulence;Biological control

S379

A

1001-4829(2017)8-1784-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.8.015

2015-09-17

國家自然科學地區科學基金項目(31460153);保山市科技計劃項目(2014KJ033);保山市第六批中青年學術和技術帶頭人(bszqnxshjsdtr2017);云南省科技廳青年項目(2014FD057);保山學院校級項目(BZ15006)

徐 玲(1978-)，女，云南陸良人，博士，副教授，主要從事生物防治研究，E-mail:xuling09083@163.com，*為通訊作者:陳自宏，E-mail:zhchen78@163.com。