女貞子墨旱蓮對多發性肌炎模型大鼠肌組織中核轉錄因子－κB的影響

顧 威 張 杰（遼寧省沈陽市中醫院風濕科，遼寧 沈陽 110003）

女貞子墨旱蓮對多發性肌炎模型大鼠肌組織中核轉錄因子－κB的影響

顧 威 張 杰△
（遼寧省沈陽市中醫院風濕科，遼寧 沈陽 110003）

目的 研究中藥女貞子墨旱蓮配伍對多發性肌炎模型大鼠的治療作用與療效，闡明養陰滋補肝腎法對多發性肌炎模型大鼠肌組織中核轉錄因子－κB（NF－κB）的影響。方法 將40只SPF級SD雄性大鼠隨機抽取10只作為空白組，其余大鼠皮下注射完全弗氏佐劑與抗原1∶1混合乳化液，成功制備多發性肌炎大鼠模型，成模大鼠隨機分為中藥組、激素組、模型組，各10只。空白組、模型組給予0.9%氯化鈉注射液，激素組給予甲潑尼龍溶液，中藥組給予女貞子墨旱蓮藥物溶液，均給藥4周，觀察大鼠的一般狀態，根據LennonLA的評分標準進行評分，檢測血清中血清肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）含量。采用酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測肌肉組織中NF－κB的含量水平。結果 在各組大鼠進行干預治療后，中藥組的癥狀評分低于模型組（P＜0.01），中藥組AST水平明顯低于模型組（P＜0.01），中藥組與激素組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。中藥組LDH水平明顯低于模型組（P＜0.01），中藥組與激素組比較，血清中LDH含量較高（P＜0.05）。中藥組CK水平明顯低于模型組（P＜0.01），中藥組與激素組，血清中CK含量高（P＜0.05）。中藥組的NF－κB表達水平明顯低于模型組（P＜0.05），中藥組與激素組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 中藥女貞子墨旱蓮阻止炎癥細胞凋亡，進而起到抗炎、阻止肌肉組織破壞，是通過抑制NF－κB信號通路，促進抗凋亡蛋白的表達，從而達到對多發性肌炎的治療作用，表明養陰滋補肝腎法對多發性肌炎模型大鼠肌組織中NF－κB有一定的影響。

多發性肌炎；疾病模型，動物；NF－κB；女貞子；墨旱蓮

多發性肌炎（polymyositis，PM）是一種病因未明，累及橫紋肌的非化膿性炎癥，臨床表現以四肢近端、咽部肌肉組織、頸部出現炎癥、變性改變，并出現對稱性肌無力和肌萎縮，可累及多個系統和器官［1］。當累及到皮膚損害時稱為皮肌炎。多發性肌炎、皮肌炎在中醫學中還沒有相應的醫學病名，根據其臨床表現和發病機制，早期類似痹證，后期類似痿證［2］。多數患者以陰虛為本，故以養陰滋補肝腎為法治療多發性肌炎。中藥女貞子墨旱蓮配伍在臨床治療多發性肌炎方面效果甚佳，但直接將其作為臨床一線的指導用藥為時尚早，尚且缺乏大數據的支撐。本實驗將模擬肌炎的發病過程，將異種動物骨骼肌勻漿作為誘發疾病的抗原物質，建立多發性肌炎大鼠模型，觀察中藥女貞子墨旱蓮對多發性肌炎模型大鼠肌組織中核轉錄因子－κB（NF－κB）的影響，進一步研究該藥物如何影響多發性肌炎的發病過程。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF清潔級SD雄性大鼠（遼寧中醫藥大學實驗動物中心提供，合格證號：2015 6A032），共40只，體質量（200±20）g，大鼠身體健康，毛色亮澤。

1.2 實驗藥品 藥物組成：女貞子20 g，墨旱蓮

20 g。中藥采用免煎顆粒，江陰天江藥業有限公司生產，每包相當于10 g原藥。于遼寧中醫藥大學附屬醫院門診藥房購買。甲潑尼龍片由輝瑞公司生產，規格為4 mg／片，30片／盒。

1.3 主要試劑 10%水合氯醛溶液由遼寧中醫藥大學動物實驗中心提供。乙酸（分析純冰醋酸）由遼寧中醫藥大學動物實驗中心提供。NF－κB酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測試劑盒，購自上海酶聯生物科技有限公司。BCA蛋白定量試劑盒購自上海酶聯生物科技有限公司。完全弗氏佐劑購自sigma，批號1001541106。

1.4 實驗用藥配置

1.4.1 女貞子墨旱蓮藥物溶液的制備 本實驗的受試藥物為女貞子20 g、墨旱蓮20 g，中藥采用免煎顆粒，每包相當于10 g原藥。將上述藥物裝入相同器皿中，加入約54 mL溫水，藥物完全融化。200 g大鼠1 d的有效劑量0.126 g，大鼠按給藥容積0.1 mL／10 g灌胃，200 g的大鼠大概可以灌2mL的藥液，由此確定女貞子墨旱蓮水溶液濃度為0.063 g／mL，隨后將藥液密封存放于4℃的恒溫箱中。

1.4.2 甲潑尼龍片溶液的制備 甲潑尼龍片大鼠每日的所需的藥物劑量為1.26 mg。將36 mg甲潑尼龍片溶解于22 mL蒸餾水中，制成濃度為0.63 mg／mL的甲潑尼龍片溶液，隨后將溶液密封保存于4℃的恒溫箱中。

1.4.3 抗原的制備 肌勻漿制備：用空氣栓塞法將家兔處死，隨后取家兔后肢骨骼肌，將其消毒后放置于冰臺上，剔除所有的筋膜、脂肪、血管及神經組織，隨后將處理后的組織剪碎，置于冰0.9%氯化鈉注射液中浸泡30 min，隨后用T10高速分散機進行勻漿處理，轉速為30 000 r／min，每次勻漿過程持續15 s，靜置30 s，然后用4層紗布將勻漿后的液體進行過濾，濾液用VCX500超聲波細胞破碎儀進行破碎，在顯微鏡下觀察，確認無完整細胞后再次利用T10高速分散機對溶液進行離心處理，轉速設置為3 500 r／min，最后測定離心后的上層清液中的蛋白含量，結果為13.1 mg／mL。將上層清液分裝于多個標準容器中，放置于－80℃冰箱中保存。

1.5 模型建立 先適應性喂養40只SPF級SD大鼠1周，采用隨機數字表法，從40只大鼠中隨機抽取10只作為空白組，正常飼料喂養飲水。其余30只進行造模，采用背部皮下多點注射完全弗氏佐劑與抗原1∶1混合乳化液4周，每周1次，大鼠的注射劑量為每次0.4 mL，第4周可造模成功。

1.6 分組 第4周將成模大鼠隨機分為中藥組、激素組、模型組，各10只。

1.7 給藥方法 空白組、模型組均每日灌相同劑量2 mL的0.9%氯化鈉注射液，共4周。中藥組給予中藥女貞子墨旱蓮水溶液灌胃2 mL，每日1次，共4周。激素組給予甲潑尼龍片溶液2 mL灌胃，每日1次，共4周。在第4周末在麻醉狀態下于大鼠的腹主動脈處采集血樣，采集完畢后將大鼠全部處死。

1.8 觀察指標

1.8.1 大鼠一般狀態評分測定 最后1次藥物干預后，根據LennonLA評分標準進行評分［3］。0分：肌力大致正常。1分：撕咬、咀嚼或叫喊時無力。2分：行走困難，頭下垂，休息時表現尤為明顯。3分：無力叫喊，呼吸困難，肌肉明顯萎縮，瀕臨死亡。（癥狀居中者評為0.5、1.5、2.5分）

1.8.2 血清肌酶測定 用Vitros250型全自動生化分析儀（美國強生公司）檢測血清中肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）水平。

1.8.3 NF－κB水平測定 采用酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測肌肉組織中NF－κB的含量水平。

1.9 統計學方法 采用SPSS 19.0統計軟件進行統計分析，計量資料用均數±標準差（ˉx±s）表示，采用t檢驗，并對單一因素采用方差分析。

2 結 果

2.1 各組大鼠末次給藥后評分比較 見表1。

表1 各組大鼠末次給藥后評分比較ˉx±s

由表1可見，中藥組、模型組癥狀評分高于空白組評分（P＜0.01），提示造模成功。中藥組、激素組評分低于模型組（P＜0.01）；激素組評分低于中藥組（P＜0.05）。

2.2 各組大鼠末次給藥后AST、LDH及CK比較

見表2。

表2 各組大鼠末次給藥后AST、LDH及CK比較U／L，ˉx±s

由表2可見，中藥組、激素組與模型組比較，血清中AST含量較低（P＜0.01）。中藥組與激素組血清中AST含量比較差異無統計學意義（P＞0.05）。激素組、中藥組與模型組比較，血清中LDH含量較低（P＜0.01）。中藥組與激素組比較，血清中LDH含量較高（P＜0.05）。激素組、中藥組與模型組比較，血清中CK含量低（P＜0.01）。中藥組與激素組比較，血清中CK含量高（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠末次給藥后組織中NF－κB比較見表3。

由表3可見，中藥組、激素組與模型組比較，組織中NF－κB低（P＜0.01）。中藥組組織中NF－κB與激素組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠末次給藥后組織中NF－κB比較ˉx±s

3 討 論

PM是一組骨骼肌非化膿性炎癥，其發病機制尚不十分明確，但自身免疫的異常在其發病過程中起重要作用，并與免疫、凋亡、遺傳和環境等因素密切相關。我國PM在臨床上并不少見，但發病率暫不清楚。美國PM的發病率較低，據統計每10萬人中發病人數僅為約0.1～1人，且該病與性別的相關性比較大，女性的患病率是男性患病率的2倍［4］。近來已有研究表明細胞免疫和體液免疫在PM的始發和進展過程中均起相當重要的作用。李靜等［5］研究采用免疫染色技術，將NF－κB作為研究目標，通過研究該因子的表達水平來探究其與PM之間的聯系，研究表明，在PM患者血清中可檢測出肌炎特異性抗體和肌炎相關性抗體，病肌組織中免疫球蛋白和補體的沉積以及壞死肌纖維上C5b－9膜攻擊復合物的存在，提示B細胞介導的體液免疫在PM的發生中也起著重要作用。該過程最早在B淋巴細胞中得以證實。NF－κB廣泛存在于真核生物中，是一個由復雜的多肽亞單位組成的蛋白家族，許多基因的啟動子和增強子區存在κB結合位點，NF－κB參與這些基因表達的調控，與免疫反應、炎癥、細胞凋亡、病毒、感染、腫瘤發生以及胚胎發育等重要生命事件密切相關［6］。目前認為細胞免疫及體液免疫均參與了PM的發病，而以細胞免疫為主，肌細胞可見CD4＋、CD8＋T細胞浸潤，肌纖維中聚集的炎癥細胞釋放炎性細胞因子產生一系列免疫反應，損傷肌細胞［7］。PM患者的肌纖維細胞中可檢測到NF－κB的過度表達，且細胞出現多個細胞核。越來越多的證據表明NF－κB與自身免疫反應有關，提示NF－κB可能成為今后治療自身免疫性疾病的一個新的靶點。

PM屬中醫學痹證、痿證等范疇。《諸病源候論》曰“人體虛，腠理開，故受風邪也”，強調了體虛，先天稟賦不足或后天失養常是PM的發病內在原因，這與現代醫學中自身免疫學說不謀而合，成為滋補肝腎的立論依據［8］。多數患者陽盛有熱，或陰虛津少，外邪乘虛而入誘導而致病。日久久病不愈，耗損真陰，肝陰不足，累及腎陰，腎陰不足，水不涵木，肝腎陰虛，又易致肝陽上亢或相火偏亢，進而出現陰虛火旺之證［9］。清末《本草備藥》明確“益肝腎”作為女貞子的首要功效，此與近代對本品的認識頗為一致。墨旱蓮使用較晚，首見于唐代《新修本草》，原名鱧腸。《新修本草》首次記載本品，曰“主血痢，針灸瘡發，洪血不可止者敷之立已，汁涂發眉，生速而繁”，樸實地記錄了本品內服、外用均可治血證這一主要功用。宋代《日華子本草》則明確本品具“排膿、止血”之功。繼后，明代《滇南本草》將其加入“固齒、烏須，洗九種痔瘡”之功，而李時珍《本草綱目》則補充了本品“益腎陰”的重要功用。清代，《本草正義》歸納其特征為“入腎補陰而生長毛發，又能入血為涼血止血之品”［10］。女貞子、墨旱蓮二者相須為用，有交通季節，順應陰陽之妙用，是滋補肝腎，明目烏發的妙方［11］，藥少而精，性味平和，久服不礙脾胃。

部分醫者從現代藥理學研究的角度進行了研究及證明，女貞子、墨旱蓮有效部位群由女貞子總皂苷、女貞子多糖、墨旱蓮總黃酮3種有效部位組成，具有明顯的保肝和增強免疫作用［12－13］。姚干等［14］研究結果表明女貞子乙醇提取物＋墨旱蓮乙醇提取物（1∶1）是二至丸復方最強的免疫調節作用活性部位，能夠協同脂多糖（LPS）、刀豆蛋白（ConA）等有絲分裂原誘導的小鼠外周血、脾淋巴細胞增殖，升高小鼠腹腔巨噬細胞活性。提示這些組分均能激活T細胞及B細胞，具有絲裂原樣作用，可以增強腹腔巨噬細胞的吞噬功能。女貞子、墨旱蓮其免疫調節功能是通過采用碳粒廓清、溶血素抗體測定方法來實現的。研究發現女貞子、墨旱蓮水提物能增強單核巨噬細胞的吞噬功能，增強特異性及非特異性免疫力［15］。王進進等［16］用給小鼠服用環磷酰胺致使其免疫力下降，隨后再服用女貞子、墨旱蓮水提物治療，研究發現女貞子、墨旱蓮水提物可以提高小鼠病理狀態下的免疫力，在促進胸腺指數，提高脾功能等方面表現的尤為突出。

PM臨床上應用糖皮質激素治療，已取得了一定的效果，但臨床極易引起嚴重的毒副作用及并發癥，長期使用易合并感染、消化道出血、骨質疏松等，且對該藥物有依賴性，而有部分患者屬于激素抵抗型，激素治療效果不佳。相對而言，傳統中醫藥通過辨證論治在治療過程中就發揮了其獨特的優勢，具有因地制宜、整體觀念、副作用小等特點。本研究應用中藥女貞子墨旱蓮與西藥甲潑尼龍做比較，從臨床癥狀方面，中藥女貞子墨旱蓮治療多發性肌炎有確切療效。從理化檢查方面，AST、LDH、CK均有顯著升高，其中CK升高可達正常值的10～100倍，主要原因是由于肌細胞損傷，使肌肉組織中的心肌酶溢出入血而導致升高，其與肌肉損傷快慢成正比，其可較為全面地反映肌肉的病變程度，應用女貞子墨旱蓮后均能降低升高的心肌酶，從而在理化檢查上證實中藥女貞子墨旱蓮確實有改善PM肌肉損傷的作用。在免疫方面，女貞子墨旱蓮對PM模型大鼠NF－κB信號通路的影響與西藥甲潑尼龍無明顯差異，說明中藥在女貞子墨旱蓮治療中發揮了細胞免疫效應。女貞子墨旱蓮能阻止炎癥細胞凋亡，進而起到抗炎、阻止肌肉組織破壞，抑制NF－κB信號通路，促進抗凋亡蛋白的表達，從而達到對PM的治療作用。

由于PM病情復雜多變，具有整體觀念、辨證論治思維體系的中醫中藥在治療此病上有其獨特優勢和巨大潛力。雖然目前各地醫家對PM的散在報道仍處于探索階段，但經長期的臨床觀察，中醫藥在治療PM中已取得可靠的效果，其在減少激素的劑量，減輕毒副作用，穩定病情及減少疾病復發等方面發揮了很大作用。總之，PM辨證施治的全過程，不外乎本虛標實，虛實錯雜，因此注意扶正在治療中的作用，中醫藥在分期分型、辨證施治及選方用藥方面還未形成統一認識，所以今后進一步深入探討病因病機及治療機制，掌握辨證規律，形成一套行之有效的中醫診療該病的理法方藥，是醫務工作者亟待解決的問題。

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Effect of Ligustrum lucidum ait combined w ith Eclipta on nuclear transcription factor－kappa b in muscletissue of polymyositis model rats

GU Wei*，ZHANG Jie．*
Department of Rheumatology，Hospital of Traditional Chinese Medicine in Shenyang City，Liaoning Provice，Liaoning，Shenyang 110003

Objective To study the therapeutic effect and curative effect of Ligustrum lucidum ait combined with Eclipta on the polymyositismodel rats，and clarify the effect of nourishing yin of liver and kidney therapy on nuclear transcription factor－kappa b（NF－κB）in muscle tissue of rats with polymyositis.M ethods 10 rats were randomly selected as blank group from 40 SPF grademale rats，the remaining ratswere injected subcutaneously with mixed emulsion of complete Freund＇s adjuvantand antigen by 1：1 for preparing themodel of polymyositis rats successfully，then themodel rats were randomly divided into Chinesemedicine group，hormone group and model group，10 rats in each group.The rats in blank group and model group were given 0.9%sodium chloride injection，hormone group was givenmethylprednisolone solution，Chinesemedicine group was given the solution of Ligustrum lucidum ait combined with Eclipt.All rats were administered for 4 weeks，then the general state of rats were observed，and the scores were calculated according to LennonLA＇s scoring criteria，the contents of serum creatine phosphokinase（CK），lactate dehydrogenase（LDH）and aspartate transaminase（AST）in serum weremeasured.The content of NF－κB in muscle tissue was detected by enzyme－linked immunosorbent assay（ELISA）.Results After intervention，the symptom scores in Chinese medicine group was lower than that in model group（P＜0.01）.The AST in Chinese medicine group was lower than that in model group（P＜0.01），and with no statistical difference between Chinese medicine group and hormone group（P＞0.05）.The LDH in Chinese medicine group was lower than that in model group（P＜0.01），and which in Chinese medicine group was higher than that in hormone group（P＜0.05）.The CKin Chinesemedicine group was obviously lower than that inmodel group with statistical differences（P＜0.01），and which in Chinesemedicine group was higher than that in hormone group（P＜0.05）.The expression of NF－κB in Chinesemedicine group was lower than that in model group（P＜0.05），and with no statistical difference between Chinesemedicine group and hormone group（P＞0.05）.Conclusions Chinesemedicine of Ligustrum lucidum ait combined with Eclipta prevent the apoptosis of inflammatory cells，and then anti－inflammatory and preventmuscle tissue from damage，which is through inhibition the signaling pathway of NF－κB to promote the expression of antiapoptotic protein，so as to achieve the therapeutic effecton polymyositis，and clarify the effectofnourishing yin of liver and kidney therapy on NF－κB in muscle tissue of rats with polymyositis.

Polymyositis；Diseasemodels；Animal；NF－κB；Ligustrum lucidum ait；Eclipta

R－332；R685.205.31

A

1002－2619（2017） 08－1230－05

2017－05－05）

（本文編輯：董軍杰）

10．3969／j．issn．1002－2619．2017．08．028

△通訊作者：中國醫科大學附屬第一醫院中醫科，遼寧 沈陽 110001

顧威（1984—），女，主治醫師，碩士。從事風濕臨床研究。