干擾素-γ基因多態性與擴張型心肌病相關性研究

周莉，陳海燕，孔山，成家茂

（1.大理大學第一附屬醫院兒科，云南大理671000；2.大理大學第一附屬醫院超聲科，云南大理671000；3.大理大學第一附屬醫院檢驗科，云南大理671000；4.大理大學基礎醫學院，云南大理671000）

干擾素-γ基因多態性與擴張型心肌病相關性研究

周莉1，陳海燕2，孔山3，成家茂4*

（1.大理大學第一附屬醫院兒科，云南大理671000；2.大理大學第一附屬醫院超聲科，云南大理671000；3.大理大學第一附屬醫院檢驗科，云南大理671000；4.大理大學基礎醫學院，云南大理671000）

目的：探討干擾素基因874位點（IFN-γ+874T∕A）的單核苷酸多態性與擴張型心肌病（DCM）易感性之間的關系。方法：收集經大理大學第一附屬醫院確診的113例DCM患者（患者組）以及100例漢族健康成人（對照組）的靜脈血，采用PCRSSP技術和瓊脂糖凝膠電泳檢測DCM患者和健康對照者的IFN-γ+874T∕A單核苷酸多態性。結果：患病組IFN-γ+874TT基因型分布頻率（30.97%）與健康對照組（8.00%）比較，差異具有統計學意義（χ2=17.631，P＜0.01）；患病組和對照組的T等位基因分布頻率分別為40.27%和22.00%，二者比較差異有統計學意義（χ2=16.352，P＜0.001）。結論：IFN-γ+874T∕A多態性與DCM易感性可能存在密切聯系。

擴張型心肌病；干擾素-γ；基因多態性

應用免疫抑制治療擴張型心肌病（Dilated Car?diomyopathy，DCM），尤其是近年來被發現的炎癥性擴張型心肌病，可顯著改善病情〔1〕，表明DCM的發病與病毒感染和自身免疫異常密切相關。干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）是唯一的Ⅱ型IFN，也稱為免疫干擾素，除具有廣譜抗病毒作用外，對免疫系統也起著關鍵的調節作用〔2〕。IFN-γ是IFN-γ基因的表達產物，該基因內含子1的+874T∕A位點具有單核苷酸多態性，是產物的高表達表型，與DCM的易感性、病情嚴重程度和預后相關〔3〕。我們對大理大學第一附屬醫院確診的113例DCM患者和100例健康對照者的IFN-γ+874A∕T基因多態性進行了檢測，旨在進一步探討IFN-γ+874T∕A基因多態性與DCM易感性之間的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象收集大理大學第一附屬醫院各科室中自2012年1月至2015年12月經確診的DCM病人共計113例納入患病組，均符合中華醫學會心血管病學分會2007年頒布的《心肌病診斷與治療建議》中DCM的診斷標準〔4〕：①左心室舒張期末內徑（LVEDD）＞5.0 cm（女性）和＞5.5 cm（男性）。②左心室射血分數（LVEF）＜45%或左心室縮短速率（FS）＜25%。并排除高血壓、冠心病、心臟瓣膜病、先天性心臟病、酒精性心肌病、心動過速性心肌病、心包疾病、系統性疾病、肺心病和神經肌肉性疾病等。其中，男68例，女45例，年齡17～82歲，平均（36.45±17.33）歲，漢族，無近親血緣關系和家族史。另隨機選取我院某次健康體檢中無近親血緣關系的成人100例作為正常對照組，其中，男57例，女43例，年齡19～67歲，平均（35.77±19.63）歲。所有研究對象在檢驗室采血5 mL，從中取2 mL抽檢血液作為本次研究所用，所有血液均已經過抗凝處理。

1.2 總DNA提取全血基因組DNA抽提試劑盒購于上海生工，按試劑盒說明進行操作。所有DNA樣本-20℃保存。DNA提取、PCR基因轉錄均在解剖教研室的細胞生物學實驗室嚴格按照無菌要求和檢測步驟完成。

1.3 引物設計與合成參照文獻〔5〕設計IFN-γ+ 874T∕A位點的PCR引物，所有引物均由北京賽百盛基因技術有限公司合成。見表1。

表1 IFN-γ+874T∕A位點單核苷酸多態性檢測的引物序列

1.4 PCR-SSP反應試劑購自大連寶生物工程有限公司，應用美國賽默飛世爾Piko系列PCR儀進行基因擴增。PCR反應體系為25 μL，基因組DNA 2 μL（50～100 ng）、10×PCR緩沖液1.5 μL、dNTPs 200 μmol∕L、引物P1、P2、P3各1.5 μmol∕L，P4、P5各0.5 μmol∕L，Taq DNA聚合酶1.5 U。PCR反應條件為：94℃預變性5 min，然后94℃變性30 s、60℃退火40 s、72℃延伸40 s共30個循環，最后72℃延伸10 min。擴增產物經含有溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠電泳，穩壓140 V，電泳時間15～20 min，在紫外光下觀察擴增結果并記錄拍照。

1.5 統計學分析使用SPSS 19.0軟件進行基因型和等位基因頻率，然后經Hardy-Weiberg遺傳平衡定律檢驗，型別分布使用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IFN-γ+874T∕A位點PCR-SSP多態性檢測的基因型樣本的基因組DNA片段經擴增后，可出現3種不同的基因型陽性條帶，分別為TT正常純合子（264 bp）、AA突變純合子（264 bp）以及AT雜合子。見表2、圖1。

表2 IFN-γ+874T∕A位點多態性檢測的基因型

2.2 IFN-γ+874T∕A等位基因的分布頻率患病組和對照組人群的IFN-γ+874T∕A位點基因型和等位基因頻率，均經Hardy-Weiberg遺傳平衡定律檢驗，達到遺傳平衡，具有群體代表性。結果顯示，患病組IFN-γ+874TT基因型分布頻率（30.97%）較健康對照組（8.00%）顯著升高，差異有統計學意義（χ2=17.631，P＜0.001）；且患病組的T等位基因分布頻率（40.27%）也較對照組（22.00%）的明顯升高，二者比較差異有統計學意義（χ2=16.352，P＜0.001）。見表3。

圖1 IFN-γ+874T∕A位點基因型的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳圖

表3 IFN-γ+874位點基因型及等位基因的數量與分布頻率

3 討論

IFN-γ為Ⅱ型干擾素，是Th1細胞產生的免疫因子，與免疫應答機制的啟動和調節關系密切。IFN-γ基因位于染色體12q24.1，包含有4個外顯子和3個內含子。近年來文獻報道的IFN-γ單核苷酸多態性位點有：-183G∕T，+764C∕G，+874A∕T，+2 109A∕G，+2 118A∕G，+2 326T∕C，+2 459A∕G，+2 671T∕C，+3 177T∕G，+3 273G∕A，+3 810G∕A，+5 199A∕T，+5 272A∕G，+4 766C∕T，+5 644G∕A等〔6〕，在內含子區的+874和+2 109位點存在兩個調控基因轉錄的多態性。IFN-γ基因啟動上游+874T∕A位點的多態性變異，是由第874位點堿基A變為T所致，可通過改變轉錄因子的結合位點，影響IFN-γ的表達量〔7〕，且TT為高表達基因型，AA為低表達型基因型，TA為中等表達基因型〔8〕。研究表明，IFN-γ+874T∕A等位基因可能是DCM的遺傳易感基因之一〔9〕，這可能與DCM發病機制中的自身免疫調節以及疾病發展過程中Th1細胞針對心肌抗原所產生的免疫反應密切相關〔10〕。研究認為，IFN-γ作為重要的細胞因子，在擴張型心肌病病程發展中發揮著重要的調節作用：促進Th0細胞向Th1細胞分化，通過抑制白細胞介素-4的產生，阻滯Th2的增殖分化，調整Th1∕Th2比例，從而抑制體液免疫，調節自身免疫；通過誘導抗病毒蛋白直接抑制病毒復制；活化NK細胞，形成IFN-NK系統，抵御病毒感染；誘導一氧化氮產生，而發揮抗病毒、擴張血管保護心肌作用〔11〕。本研究結果顯示，在海拔超過2 000 m的高原地區漢族人群中，DCM患者的IFN-γ+874TT基因型和T等位基因的表達較正常對照組明顯升高，說明IFN-γ+874T∕A基因位點多態性與DCM相關，可能是DCM的易感性基因之一。近年來，隨著分子心臟病學研究的進展，應用分子生物學手段治療DCM已成為該領域的熱門話題。因此，今后對于DCM患者而言，介于注射用重組人IFN-γ制劑克隆伽瑪不失為一種新的治療選擇，有必要對此類患者的外周血IFN-γ水平及其免疫性指標進行檢測，進一步明確IFN-γ對DCM患者自身免疫和心功能的影響。

〔1〕馬沛然，王小康.炎癥性擴張型心肌病定義、診斷和治療〔J〕.中國實用兒科雜志，2013，28（7）：509-511.

〔2〕SCHRODER K，HERTZOG P J，RAVASI T，et al.Interfer?on-gamma：an overview of signals，mechanisms and func?tions〔J〕.J Leukoc Biol，2004，75（2）：163-189.

〔3〕ADAMOPOULOS S，KOLOKATHIS F，GKOUZIOUTA A，et al.Cytokine gene polymorphisms are associated with markers of disease severity and prognosis in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy〔J〕.Cytokine，2011，54（1）：68-73.

〔4〕中華醫學會心血管病學分會，中華心血管病雜志編輯委員會，中國心肌病診斷與治療建議工作組.心肌病診斷與治療建議〔J〕.中華心血管病雜志，2007，35（1）：5-16.

〔5〕BIDWELL J，KEEN L，GALLAGHER G，et al.Cytokine gene polymorphism in human disease：on-line databases，supplement 1〔J〕.Genes Immun，2001，2（2）：61-70.

〔6〕曾強，王紅，常紅，等.IFN-γ+874A∕T基因多態性與再生障礙性貧血免疫抑制治療療效的關系〔J〕.中國實驗血液學雜志，2015，23（5）：1375-1379.

〔7〕CHEVILLARD C，HENRI S，STEFANI F，et al.Two new polymorphisms in the human interferon gamma（IFN-gam?ma）promoter〔J〕.Eur J Immunogenet，2002，29：53-56.

〔8〕趙娜，陳宗波，錢娜，等.IFN-y+874位點單核苷酸多態性和蛋白表達水平與腸道病毒71感染關系〔J〕.齊魯醫學雜志，2010，25（4）：315-317.

〔9〕郝剛，劉麗華，王春梅，等.干擾素基因多態性與擴張型心肌病的相關研究〔J〕.中國優生與遺傳雜志，2008，16（3）：64-65.

〔10〕EFTHIMIADIS I，SKENDROS P，SARANTOPOULOS A，et al.CD4+∕CD25+T-Lymphocytes and Th1∕Th2 regula?tion in dilated cardiomyopathy〔J〕.Hippokratia，2011，15（4）：335-342.

〔11〕趙艷霞，周亞濱，崔志勇，等.益氣養陰、活血化瘀方對實驗性病毒性擴張型心肌病小鼠外周血γ-干擾素的影響〔J〕.中國中醫藥信息雜志，2008，15（6）：25-27.

Associations of IFN-γ Gene Polymorphism with Dilated Cardiomyopathy

Zhou Li1,Chen Haiyan2,Kong Shan3,Cheng Jiamao4*
（1.Department of Pediatrics,The First Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；2.Ultrasonic Department, The First Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；3.Department of Laboratory,The First Affiliated Hospital of Dali University,Dali,Yunnan 671000,China；4.Pre-clinical College,Dali University,Dali,Yunnan 671000,China）

Objective：To investigate the relationship between mononucleotide's polymorphism of IFN-γ gene's 874 site and the susceptibility to dilated cardiomyopathy.Methods：In this case-control study,we have collected venous blood of 113 patients with DCM（patients group）and of 100 healthy Han adults（control group）from the first affiliated hospital of Dali University.PCR-SSP technology and agarose gel electrophoresis were applied to detect mononucleotide's IFN-γ+874T∕A polymorphism of the two groups.Results：There were significant differences between the patient group whose IFN-γ+874TT genotypic frequency distribution was 30.97%and the health control group with 8.00%（χ2=17.631，P＜0.001）.The distributive frequencies of T allele in the patient group and control group were 40.27%and 22.00%respectively.There were statistically significant differences between them（χ2=16.352，P＜0.001）.Conclusion：There may be a close relationship between IFN-γ+874A∕T polymorphism and the susceptibility to DCM.

dilated cardiomyopathy;IFN-γ;gene polymorphism

R542.2

B

2096-2266（2017）08-0028-03

10.3969∕j.issn.2096-2266.2017.08.007

（責任編輯 董杰）

大理大學青年教師科研基金資助項目（KYQN201118）

2016-03-24

2017-03-26

周莉，講師，主要從事心血管病研究.

*通信作者：成家茂，教授.