氯沙坦對慢性心力衰竭患者外周血內皮祖細胞的影響研究

陳菊明，左 琦，宋艷玲，麥華德，紀新博，王雅純，林蕓蕓，顧申紅

·論著·

氯沙坦對慢性心力衰竭患者外周血內皮祖細胞的影響研究

陳菊明1，左 琦2，宋艷玲1，麥華德1，紀新博1，王雅純1，林蕓蕓1，顧申紅1

目的探討氯沙坦對慢性心力衰竭患者外周血內皮祖細胞(EPCs)的影響。方法選取2015年3月—2016年3月海南醫學院第一附屬醫院心內科收治的慢性心力衰竭患者30例，采集患者外周血10 ml，體外培養EPCs。將體外培養的EPCs隨機分為A組，B組和C組，每組10份。A組不做任何處理，B組采用氯沙坦10 μmol/L進行處理，C組采用氯沙坦10 μmol/L+磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑10 μmol/L進行處理。比較3組EPCs培養12 h、24 h、36 h、48 h、72 h 535nm波長下光密度值(OD535)，穿膜細胞數，蘇氨酸蛋白激酶(Akt)及內皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表達量。結果時間與方法在OD535上存在交互作用(P<0.05)；時間在OD535上主效應顯著(P<0.05)；方法在OD535上主效應顯著(P<0.05)；B組EPCs 12 h、24 h、36 h、48 h、72 h OD535高于A組、C組(P<0.05)。B組EPCs穿膜細胞數多于A組、C組(P<0.05)。B組EPCs的Akt和eNOS蛋白表達量高于A、C組(P<0.05)。結論氯沙坦可有效促進慢性心力衰竭患者外周血EPCs增殖和遷移，改善內皮細胞功能，其可能通過調節PI3K/Akt/eNOS信號通路而發揮作用。

心力衰竭；氯沙坦；內皮祖細胞

內皮祖細胞(EPCs)可參與血管生成，在缺血性疾病、血管創傷后愈合、預防血管狹窄中具有較好的應用前景[1]。研究表明，EPCs是反映慢性心力衰竭的生物標志物，因此提高EPCs的釋放可有效改善慢性心力衰竭患者心功能[2]。研究表明，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARBs)具有調節EPCs的作用[3]。氯沙坦是ARBs類藥物，可減輕左心室肥厚，抑制心肌細胞增生，延遲或逆轉心肌重構，改善左心室功能，同時可增加慢性心力衰竭患者外周血EPCs，改善血管內皮細胞功能。近年來，臨床有關EPCs與慢性心力衰竭的關系研究報道逐漸增多[4-5]。本研究旨在探討氯沙坦對慢性心力衰竭患者外周血EPCs的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年3月—2016年3月海南醫學院第一附屬醫院心內科收治的慢性心力衰竭患者30例，均符合第8版《內科學》中的慢性心力衰竭診斷標準。排除標準：(1)合并肝、腎功能不全者；(2)存在惡性腫瘤者；(3)妊娠期或哺乳期婦女。本研究經醫院醫學倫理委員會審核批準，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 藥物與實驗試劑 氯沙坦(商品名：科素亞；生產廠家：杭州默沙東制藥有限公司；批準文號：20161105；規格：50 mg/片)；PI3K抑制劑(商品名：NVP-BEZ235；生產廠家：美國Selleck公司；批準文號：20160324)。M-199培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素雙抗購自美國Gibco公司；兔抗人一抗(抗蘇氨酸蛋白激酶、抗內皮型一氧化氮合酶)、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗、增強化學發光法(ECL)顯色試劑盒購自美國Santa Cruz公司；噻唑藍購自美國Sigma公司。

1.3 方法

1.3.1 EPCs培養 采集30例患者外周血10 ml，采用Ficoll密度梯度離心法收集外周血單個核細胞；將單個核細胞接種于人纖維連結蛋白包被的6孔培養板中，每孔加入M-199培養液(10%胎牛血清+100 U/ml鏈霉素+100 U/ml青霉素)1 ml；置于37 ℃，5%CO2的培養箱中培養，隔天更換培養液。

1.3.2 分組 將體外培養的EPCs隨機分為3組，空白組(A組，n=10)：不經任何處理；氯沙坦組(B組，n=10)：采用氯沙坦10 μmol/L處理；磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制劑組(C組，n=10)：采用氯沙坦10 μmol/L+PI3K抑制劑10 μmol/L處理。

1.4 觀察指標 (1)EPCs增殖情況：將3組EPCs接種于人纖維連結蛋白包被的96孔培養板中，每孔加入M-199培養液(10%胎牛血清+100 U/ml鏈霉素+100 μg/ml青霉素)1 ml及血管內皮生長因子(VEGF)50 ng/ml；置于37 ℃，5% CO2培養箱中培養，3 d后更換培養液，后每隔2 d更換1次；待EPCs鋪滿80%以上后加入噻唑藍10 μl，置于培養箱孵育4 h，吸棄培養液上清，加入二甲基亞砜(DMSO)100 μl，振搖10 min，采用美國Bio-Rad公司生產的iMark680型全自動酶標儀于535 nm波長下測定各孔培養12 h、24 h、36 h、48 h、72 h光密度值(OD)。(2)EPCs遷移情況：將3組EPCs細胞懸浮于培養液200 μl，后接種于Boyden chamber，下室加入培養液600 μl+VEGF 50 ng/ml+基質細胞趨化因子-1(SDF-1)100 ng/ml；培養24 h后取出濾膜，刮去上室未遷移細胞，用10%甲醇固定，Giemsa染色，隨機選取6個顯微視野(×200)計數遷移到底層的細胞數目。(3)EPCs蘇氨酸蛋白激酶(Akt)和內皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表達量：采用RIPA裂解液裂解3組EPCs，離心提取細胞總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度；等量總蛋白上樣，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉至硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉1 h，加入Akt(1∶500)，eNOS(1∶500)一抗4 ℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔(1∶20 000)二抗孵育1 h，TBS-T漂洗3次，ECL顯色，使用Bio-Rad掃描分析，并計算目的蛋白相對表達量〔蛋白相對表達量=OD目的蛋白/OD內參(β-actin)〕。上述檢測均進行5次，檢測結果取平均值。

2 結果

2.1EPCs增殖 時間與方法在OD535上存在交互作用(P<0.05)；時間在OD535上主效應顯著(P<0.05)；方法在OD535上主效應顯著(P<0.05)；B組EPCs12h、24h、36h、48h、72hOD535高于A組、C組，差異有統計學意義(P<0.05，見表1、圖1)。

Table1ComparisonofOD535ofEPCsamongthethreegroupsatdifferenttimepoints

組別份數12h24h36h48h72hA組100.22±0.02a0.47±0.04a0.91±0.03a1.15±0.04a1.28±0.03aB組100.50±0.060.84±0.041.53±0.061.84±0.052.02±0.06C組100.25±0.03a0.57±0.05a0.88±0.06a1.26±0.05a1.37±0.05aF值F時間=69.641,F組間=41.317,F交互=23.656P值P時間<0.001,P組間<0.001,P交互<0.001

注：與B組比較，aP<0.05

注：OD=光密度值

圖1 3組EPCs不同時間點OD535

Figure1 OD535of EPCs of the three groups at different time points

2.2 EPCs遷移 A組EPCs穿膜細胞數為(15.5±1.7)個，B組EPCs穿膜細胞數為(33.8±2.9)個，C組EPCs穿膜細胞數為(17.5±2.0)個。3組EPCs穿膜細胞數比較，差異有統計學意義(F=197.580，P<0.05)；B組EPCs穿膜細胞數多于A組、C組，差異有統計學意義(t值分別為25.625、22.825，P<0.05，見圖2)。

圖2 3組EPCs穿膜情況(Giemsa染色，×200)

2.3 Akt和eNOS蛋白表達量 3組EPCs的Akt和eNOS蛋白表達量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；B組EPCs的Akt和eNOS蛋白表達量高于A、C組，差異有統計學意義(P<0.05，見表2、圖3)。

Table2ComparisonofproteinexpressionsofAktandeNOSproteinamongthethreegroups

組別份數AkteNOSA組100.91±0.03a0.88±0.03aB組101.37±0.081.26±0.06C組100.98±0.07a0.82±0.06aF值75.533105.432P值<0.05<0.05

注：與B組比較，aP<0.05；Akt=蘇氨酸蛋白激酶，eNOS=內皮型一氧化氮合酶

注：Akt=蘇氨酸蛋白激酶，eNOS=內皮型一氧化氮合酶

圖3 3組Akt和eNOS蛋白表達情況

Figure3 Protein expressions of Akt and eNOS of the three groups

3 討論

EPCs是血管內皮細胞的前體細胞，可通過動員、遷移、歸巢和分化4步驟而修復內皮細胞功能損傷，減少氧化應激或細胞凋亡。1997年ASAHARA等[6]證明外周血中存在能分化為血管內皮細胞的前體細胞，并將其命名為血管EPCs。新生血管中約25%內皮細胞由EPCs分化而來，且其可在損傷部位黏附、聚集、增殖、分化形成新的血管內皮細胞[7-9]。因此，EPCs具有修復內皮細胞功能，促進內皮細胞分化、血管再生，延緩動脈粥樣硬化形成的作用[4]。另外，EPCs還能抑制氧化應激，促進一氧化氮(NO)生成，可在缺血或腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)激活狀態下增強內皮細胞功能，進而保護心肌細胞[10-11]。

慢性心力衰竭患者常伴有RAAS和內皮細胞功能損傷，臨床常采用ARBs類藥物治療。研究表明，ARBs通過抑制RAAS而有效阻斷血管緊張素Ⅱ受體活性，降低心血管疾病發生率、病死率和致殘率[12]。MATSUURA等[13]研究表明，ARBs可有效阻斷血管緊張素Ⅱ介導的氧化應激、炎性反應和胰島素抵抗等對EPCs的影響。

YAO等[14]研究表明，氯沙坦可促進EPCs增殖、遷移。本研究結果顯示，B組EPCs 12 h、24 h、36 h、48 h、72 h OD535高于A組、C組，EPCs穿膜細胞數多于A組、C組，提示氯沙坦可促進慢性心力衰竭患者外周血EPCs增殖和遷移。CHEN等[15]研究表明，激活PI3K/Akt/eNOS信號通路可提高小鼠外周血EPSs增殖、遷移和新生血管分化能力。本研究結果顯示，B組EPCs的Akt和eNOS蛋白表達量高于A組、C組，提示氯沙坦可提高慢性心力衰竭患者外周血EPCs的Akt和eNOS蛋白表達量，其可能通過調節PI3K/Akt/eNOS信號通路而發揮作用。

綜上所述，氯沙坦可促進慢性心力衰竭患者外周血EPCs的增殖和遷移，可改善內皮細胞功能，有一定的臨床參考價值。但本研究仍處于EPCs研究的初級階段，有待進一步深入研究，今后研究方向為EPCs在冠心病、腦出血、高血壓等疾病治療中的應用效果。

作者貢獻：陳菊明進行實驗設計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負責；左琦、宋艷玲、麥華德、紀新博、王雅純、林蕓蕓進行實驗實施、評估、資料收集；顧申紅進行質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：李潔晨)

ImpactofLosartanonPeripheralBloodEndothelialProgenitorCellsinPatientswithChronicHeartFailure

CHENJu-ming1，ZUOQi2，SONGYan-ling1，MAIHua-de1，JIXin-bo1，WANGYa-chun1，LINYun-yun1，GUShen-hong1

1.DepartmentofGerontology，theFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege，Haikou570102，China2.DepartmentofCardiology，theFirstAffiliatedHospitalofHainanMedicalCollege，Haikou570102，China

Correspondingauthor：GUShen-hong，E-mail：1574063710@qq.com

ObjectiveTo investigate the impact of losartan on peripheral blood endothelial progenitor cells in patients with chronic heart failure.MethodsFrom March 2015 to March 2016，a total of 30 patients with chronic heart failure were selected in the Department of Cardiology，the First Affiliated Hospital of Hainan Medical College，10 ml peripheral blood was collected from each case and endothelial progenitor cells were cultured in vitro.Cultured endothelial progenitor cells were divided into A group，B group and C group，each of 10 samples.Endothelial progenitor cells of A group did not

any intervention，endothelial progenitor cells of B group received losartan(10 μmol/L)，while endothelial progenitor cells of B group received losartan(10 μmol/L)combined with PI3K inhibitor(10 μmol/L).OD535of endothelial progenitor cells after 12 hours，24 hours，36 hours，48 hours and 72 hours of culture，number of transmembrane cells，protein expressions of Akt and eNOS were compared among the three groups.ResultsThere was interaction between time and method in OD535of endothelial progenitor cells(P<0.05)；main effects of time and method were significant in OD535of endothelial progenitor cells(P<0.05)；OD535of endothelial progenitor cells of B group was statistically significantly higher than that of A group and C group after 12 hours，24 hours，36 hours，48 hours and 72 hours of culture，respectively(P<0.05).Number of transmembrane cells of B group was statistically significantly more than that of A group and C group，respectively(P<0.05).Protein expressions of Akt and eNOS of B group were statistically significantly higher than those of A group and C group(P<0.05).ConclusionLosartan can effectively promote the proliferation and migration of peripheral blood endothelial progenitor cells in patients with chronic heart failure，is helpful to improve the endothelial cell function,losartan may play a role through adjusting PI3K/Akt/eNOS signal pathway.

Heart failure；Losartan；Endothelial progenitor cells

海南省自然科學基金項目(814355)；國家自然科學基金資助項目(81560054)

顧申紅，E-mail：1574063710@qq.com

R 541.6

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2017.08.010

2017-04-03；

2017-07-26)

1.570102海南省海口市，海南醫學院第一附屬醫院老年病科

2.570102海南省海口市，海南醫學院第一附屬醫院心內科

陳菊明，左琦，宋艷玲，等.氯沙坦對慢性心力衰竭患者外周血內皮祖細胞的影響研究[J].實用心腦肺血管病雜志，2017，25(8)：41-44.[www.syxnf.net]

CHEN J M，ZUO Q，SONG Y L，et al.Impact of losartan on peripheral blood endothelial progenitor cells in patients with chronic heart failure[J].Practical Journal of Cardiac Cerebral Pneumal and Vascular Disease，2017，25(8)：41-44.