紅色熒光蛋白的研究進展

王飛 楊海濤 王澤方

（天津大學生命科學學院，天津 300000）

紅色熒光蛋白的研究進展

王飛 楊海濤 王澤方

（天津大學生命科學學院，天津 300000）

從熒光蛋白的首次發現至今，其不斷豐富的熒光光譜以及日益增多的光化學特性促使其在生物學研究中的地位不斷提升。1999年出現的紅色熒光蛋白以其卓越的優勢在生物學研究中占領了重要地位。主要介紹了從紅色熒光蛋白發現至今日趨重要的原因，以及它的顯著優勢。另外，重討論了目前幾種常見的紅色熒光蛋白的特性及其在生物學研究中存在的優勢和不足之處，為今后紅色熒光蛋白的研究提供一個選擇。

紅色熒光蛋白；遠紅外熒光蛋白；熒光計時器；大斯托克斯熒光蛋白；光活化熒光蛋白

Abstract:Since the first discovery of fluorescent proteins，its ever-increasing fluorescence spectra and the increasing number of photochemical properties have led to an increasing position in biological research. The red fluorescent protein emerged in 1999 dominated the biology study with its superiority. This paper focuses on the growing importance of fluorescent protein discovery from now on，as well as the significant advantages of red fluorescent protein. In addition，we discuss the characteristics of several common red fluorescent proteins and their advantages and disadvantages in biology research，providing an alternative for the future research of red fluorescent protein.

Key words:red fluorescent protein；far-red fluorescent protein；fluorescent timers；LSSFP；PAFP

從1962年下村修等在名為Aequorea victoria的水母體內發現并分離得到最早的熒光蛋白綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）開始［1］，人們對于熒光蛋白的進一步研究和應用都沒有停止過。研究者通過一系列突變得到各種不同波長的突變體，大大豐富了熒光蛋白的家族成員。如此大量的熒光蛋白使得其在蛋白質分子標記和細胞內示蹤等方面得到了大量的應用。

在紅色熒光蛋白發現以前，GFP雖然能幫助生物科學家解決一些問題，但由于其發射光譜僅僅局限在440-529 nm，細胞內成像時背景較高，不能夠解決活體生物皮下更深的熒光標記問題。1999年紅色熒光蛋白首次被報道［2］，紅色熒光蛋白能夠與GFP共用，激發和發射波長更長，最重要的是其在細胞內成像時背景低。這些優點促使科學家們對紅色熒光蛋白進行了系列研究，極大的完善了其多樣性。

研究者在應用紅色熒光蛋白的時候也發現了一些問題，如野生型的紅色熒光蛋白成熟速度慢且多以四聚體或二聚體形式出現，對細胞有一定的毒性作用［3-4］。紅色熒光蛋白的這些問題影響了被標記物的功能和性質，因此對野生型紅色熒光蛋白進行改造就成了必不可少的步驟，而改造的目的主要針對紅色熒光蛋白的成熟慢，易聚合等缺點。此外，還要進一步研究熒光強度更高，能夠進一步豐富熒光蛋白發射光譜的更適用于生物熒光標記的熒光蛋白。對以上內容進行簡要綜述，旨為以后紅色熒光蛋白的進一步改造提供參考與幫助。

1 紅色熒光蛋白的發現及其發展

1962年，下村修等在一種名為維多利亞多管水母（Aequorea victoria）體內發現了綠色熒光蛋白（Green fluorescent protein，GFP），這是熒光蛋白首次被發現。從水母體內發現的GFP由238個氨基酸構成，其中65-67位氨基酸為發光團，可以被光激發產生熒光［5-6］。錢永健先生［7］在GFP的基礎上進行了一系列的體外突變產生了熒光強度更強以及發射波長不同的多種突變體，如藍色、青色、黃色熒光蛋白都是體外突變的產物。也因此在2008年，錢永健等三位科學家因發現并發展了GFP而獲得了諾貝爾化學獎。

GFP作為能夠在細胞內精確定位的遺傳標簽，結合如今飛速發展的成像技術和數據分析技術使得其在生物科學領域的應用飛速發展。GFP蛋白沒有毒性，在目標生物體內能夠高效表達的同時不影響生物體的功能，作為標記蛋白時GFP在不影響目標蛋白的活性的同時還能保持其熒光［8］，這也是GFP能夠被廣泛應用于生命科學研究的重要原因之一。GFP各種突變體的出現又能夠不同程度的滿足科學家對于熒光蛋白的要求，目前應用最廣的就是其中一個突變體EGFP。然而，這系列熒光蛋白的發射光譜局限在440-529 nm之間，在細胞內成像時能夠激發細胞內的某些物質成像，造成細胞內成像時的背景較高。使得實驗結果不夠可靠。

1999年紅色熒光蛋白首次被報道，與綠色熒光蛋白相比其優點顯而易見。首先紅色熒光蛋白可以和GFP共同使用解決一些GFP單獨解決不了的科學問題；其次作為紅色熒光蛋白其激發和發射波長更長可以覆蓋GFP所不能涉及的波長段；最重要的是紅色熒光蛋白在細胞內成像時背景低更適用于進行生物科學的研究。正因為紅色熒光蛋白的這些優勢，它在生物學研究中迅速得到了大量應用［9-10］。紅色熒光蛋白分子與水母綠色熒光蛋白有中等的序列相似性，具有相似的結構基礎［11］，都是在由11個β-折疊形成的桶狀結構中心的螺旋形成固有發色團。

最早用于研究的紅色熒光蛋白是DsRed，它是一種從珊瑚中分離出來的紅色熒光蛋白，具有熒光強、穩定性好等優勢。但其本身也存在許多問題。例如，DsRed寡聚狀態是四聚體，在進行蛋白融合時容易形成多聚體影響目標蛋白；DsRed在細胞內表達會產生毒性。這就促使科學家不得不對其進行結構改造，目前，至少6種不同的紅色熒光蛋白類型，包括常規熒光蛋白、遠紅外熒光蛋白、具有斯托克斯位移的紅色熒光蛋白、熒光定時器、可光活化紅色熒光蛋白和可逆光開關紅色熒光蛋白。這些類型中的每一種都能應用于不同的成像技術，但是每種紅色熒光蛋白又都有局限性使其不能廣泛應用。

2 紅色熒光蛋白的種類及其相關應用的介紹

目前已知的紅色熒光蛋白類型就有6種之多，其中不少是由最初的紅色熒光蛋白突變而來的，這里簡要介紹了有關紅色熒光蛋白突變體的結構研究，以及一些具有特殊性質的紅色熒光蛋白的應用，相信以后對于這兩方面的進一步研究能夠使紅色熒光蛋白的家族更加壯大。

2.1 常規紅色熒光蛋白

常規紅色熒光蛋白也叫做永久熒光蛋白，可以分為橙色熒光蛋白（550-570 nm）紅色熒光蛋白（570-620 nm）和遠紅外熒光蛋白（>620 nm）3種。其中遠紅外熒光蛋白我們將分開討論，以突顯其在熒光成像中的重要性。

熒光蛋白在細胞標記中的適用性主要取決于其細胞毒性。只有降低熒光蛋白的細胞毒性保證高的細胞存活率，才能保證熒光蛋白穩定高效的表達。而目前熒光蛋白的細胞毒性主要是由于其在細胞內的非特異性聚合引起的，野生型的紅色熒光蛋白就具有明顯的寡聚現象。所以細胞毒性較小的突變體可以通過優化蛋白質的溶解性獲得，這種方式對于四聚體的紅色熒光蛋白同樣適用，如DsRed、E2-Orange和DsRed-Express2已經通過這種方式得到了優化［12］。一般情況下紅色熒光蛋白的寡聚確實會對細胞產生毒性使得實驗結果不準確，但是這種特性也是可以開發和預測并加以利用的，Dash等［13］就利用這種性質優先將未配體的核受體從核轉移到細胞質隔室然后再由其配體轉入細胞核，這種能夠將缺點進行開發和利用的做法就更加豐富了紅色熒光蛋白的應用范圍。

現代紅色熒光蛋白與第一代常規紅色熒光蛋白相比有增強的熒光特性。例如，mOrange2和TagRFP-T［14］與它們的祖先mOrange和TagRFP［15］相比其光穩定性更強。其他橙色熒光蛋白，如mKO2［16］和mKOk［17］與其祖先相比更明亮，具有更快的成熟時間，然而，它們的光穩定性較低。最近Bindels等［18］研究產生的mScarlet為單體紅色熒光蛋白，與其他紅色熒光蛋白相比更適合作為融合標簽。2016年，Pandelieva等［19］在mRojoA的發色團之上引入芳香殘基降低發色團的構象靈活性，這種突變使得其比前體的熒光蛋白量子產率提高了3倍以上。而且通過對突變體的晶體結構研究表明，發色團夾在芳環三層基序中的兩個Tyr殘基之間，這種基序的存在增加了發色團的 剛性。Pandelieva提出的方法為具有較高量子產率和總體亮度的熒光蛋白的發展提供了一個選擇。盡管現代紅色熒光蛋白在某些特定應用方面有一定的優勢，但一些早期的紅色熒光蛋白是仍然存在競爭力的。2016年，Fan［20］報道的rxRFP1對于氧化還原反應敏感，能夠用于研究各亞細胞域的氧化還原動力學。通常mCherry是作為標簽的好選擇，因其光穩定性更強，且其具備良好的單體特性，細胞毒性低［21］。2015年，Wannier等［22］通過計算設計的手段結合表面突變，創建了一種DsRed和mCherry的混合RFP不僅保持了單體性而且熒光不受損，相信這種方法對于以后的熒光蛋白改造有很大的意義。

從結構上看突變體mCherry能夠具有如此強的競爭力有兩個原因。第一個原因是，mCherry中的第163位Lys已經突變成了Gln，這個突變的氨基酸所在的側鏈位于發色團苯環下方，在結構中能夠清楚的看到163位的Lys與發色團的苯環之間由氫鍵相互作用。熒光蛋白中的發色團是去質子化的，主要原因在于發色團在蛋白質內部與蛋白所處環境的吸光度有所不同，據此我們相信163位的Lys是被質子化的，也因此通過氫鍵與發色團相互聯系。這種相互作用能夠穩定DsRed的電子密度，降低了發色團苯環的活躍性。而突變體中用中性的Glu替代酸性的Lys，這將導致這個位點與發色團的距離增加，從而維持一個相對較弱的氫鍵。這就引起發色團處于一個相對活躍的狀態，從而能夠產生更亮的熒光。第二個原因是83位的Lys突變為Leu。有一個熒光亮度增強的突變體，在這個位點上也發生了突變不過將Lys突變為Met，在后者突變體的結構中能夠看出79位Lys向著Met的方向移動，這個方向剛好是遠離發色團的方向。在mCherry中也觀察到70位Lys有類似的變化，因此可以認為70位的Lys能夠幫助發色團處于穩定狀態，而Lys的遠離能夠使其處于一個活躍的狀態，在激發熒光時產生更亮的熒光［23-24］。如圖1所示顯示了突變體mCherry發色團與其周圍環境的相互關系。

2.2 遠紅外熒光蛋白

研究具有600 nm以上發射波長的熒光蛋白主要有兩個目的：首先，在生物成像技術中很需要能夠在近紅外（Near infrared，NIR）窗口（650-900 nm）內具有發射光的熒光蛋白，因為光照射穿透組織時，其中的生物分子如黑色素、血紅蛋白和水，在近紅外窗口的光具有最小的吸收；其次，這種熒光蛋白能為多波長成像技術提供更多的選擇，其應用于生物體內的成像技術能產生更少的光毒性。熒光蛋白本身不能夠在近紅外窗口產生激發光，目前為止報道的天然紅色熒光蛋白最長發射光波長為613 nm，是來自Nematostella vectensis體內的NvFP-7R［25］。

圖1 突變后的mCherry發色團與其環境相互關系

經過設計和突變得到了許多能夠在近紅外窗口產生激發光的熒光蛋白突變體，但都具有低產量或者低亮度等缺點［26-28］。這其中包括2005年從來自Actinia equine的aeCP597突變產生的AQ143，具有在595-655 nm的激發和發射最大值［29，30］。2014年，由Archaerhodopsin-3突變產生的突變體具有迄今為止最遠的紅移發射［31］。2013年，經mKate突變產生的穩定性明顯增強的突變體TagRFP675［32］。經mRuby突變產生的mGarnet在670 nm處產生激發光［33］。2015年，Yu等［34］通過對新近的單體紅色熒光蛋白mIFP進行合理的設計突變使其產生新的突變體iBlueberry，這是一種藍移突變體，其激發和發射光譜，約40 nm的光譜移動。iBlueberry除保持單體狀態外，還具有比其母體穩定性高4倍的特性。2016年，Bajar等［35］經過26個突變最終得到mMaroon1，細胞毒性小，且具有紅移吸光度，用于研究細胞周期的4個階段取得了很好的效果。同年Li等［36］通過對mNeptune進行突變以開發新的熒光蛋白，在眾多突變體中mNeptune681和mNeptune684相對于其母體顯示出超過30 nm的紅移發射，并且這兩種突變體還保持著單體狀態。Ren等［37］經過在mKate2的發色團附近引入半胱氨酸得到新的遠紅外紅色熒光蛋白mStable，該突變體比其前體穩定性增強12倍，他們還對mPlum進行了同樣的改變得到了穩定性增強23倍的突變體，這種突變代表了一種生產更好穩定性熒光蛋白的一種機制。表1給出了目前常見的幾種遠紅外紅色熒光蛋白及其特征參數。

從結構方面分析這些突變體發生紅移的原因主要有兩方面。第一，發色團的平面化增強。從Neptune的結構來看其中的發色團平面性有明顯的增強。在Neptune中，197位Arg的側鏈與其上面的發色團中的兩個環相互平行。這個變化可能是由于其中158位Cys突變成Ser引起的，突變后的氨基酸殘基側鏈占領了本來由197位Arg占有的空間。順著Arg的延伸方向發色團中的兩個環更接近共平面（圖2左側），這種變化能夠使電子位移容易發生，降低激發所需能量，從而使突變體的熒光范圍發生紅移。這種變化也能夠在其他突變體中發現，比如eqFP650和eqFP670。第二，氫與酰基亞胺氧的結合。從Neptune的結構中可以看出，由于41位Met突變為Gly形成了一個含有水分子的空穴（圖2右側），水分子與發色團中的?；鶃啺费跣纬蓺滏I，氫鍵的形成能夠富集電子降低激發熒光所需能量。這種情況在eqFP650和eqFP670中同樣也有發現，這說明41位Met突變為小側鏈有助于紅移的發生。

此外，已經開發了幾種近紅外熒光蛋白，如最近在細菌植物色素的基礎上突變得到的IFP1.4［41］和iRFP［42］。這些蛋白的熒光是依賴于外源四吡咯發色團的，稱為膽綠素，在哺乳動物細胞中含量比較多。2013年產生的融合蛋白mPlum-IFP 1.4能夠用于體內和體外的檢測［43］。來自水母或珊瑚的熒光蛋白在產生激發光的同時需要氧氣，并且在發色團形成時產生過氧化氫，因此需要對有氧環境具有耐受性［44］。發色團形成可能需要數小時，并且在其產物中綠色和紅色熒光的混合物是常見的［45］，在此過程中產生的過氧化氫是細胞存活、生長、分化和介導疾病的誘因［46］，這些有可能導致實驗結果不可信。因此，使用熒光蛋白內源發色團以消除需氧性和過氧化氫［47］的產生是有必要的。2016年，Rodriguez等［48］用TeAPCα經過突變產生了符合要求的突變體smURFP，smURFP在生物物理上是最亮的熒光蛋白，并能夠激發近紅外窗口內的激發光，且具有最小的毒性不產生過氧化氫。此外，不像其前體TeAPCα smURFP不需要裂解酶共價附著其發色團。經過一系列的體內或細胞實驗，可以看出，與mCherry相比，smURFP沒有出現聚合的情況，與目前常用的一些熒光蛋白相比，smURFP在細胞內能夠更穩定的表達。目前smURFP能夠有這些特性的原因還有待發現，希望能夠通過解析smURFP的結構來解釋這一變化。并且目前smURFP產生熒光依賴于其發色團膽綠素的結合，考慮到在原核生物（厭氧型）中smURFP不能方便的使用，對此進行研究和改進也是日后的一個目標。

表1 常見遠紅外紅色熒光蛋白特性參數［38-40］

圖2 Neptine與mKate相比較發生紅移的結構基礎

2.3 具有大斯托克斯頻移的紅色熒光蛋白

大斯托克斯頻移（Large stokes shift，LSS），是指激發和發射最大值之間的差大于100 nm（圖3），是熒光蛋白中具有獨特特征的亞類，稱為具有大色托克斯位移的熒光蛋白（Large stokes shift fluorescent protein，LSSFP）。LSSFP為多色成像應用提供光譜可分辨的顏色。除了綠色和黃色LSSFP［49］之外，還有橙色LSSFP-LSSmOrange［50］和3種紅色LSSFP：mKeima、LSSmKate1和LSSmKate2［51-52］。2013年發現的青色熒光蛋白psamFP488也具有顯著擴展的斯托克斯位移［53］。所有紅移LSSFP光吸收值在440-460 nm并且激發熒光范圍在光譜中紅色部分。LSSmOrange在紅色LSSFP中具有最高強度和最亮熒光［54］。LSSmKate2在pH穩定性、光穩定性和亮度方面勝過mKeima，它缺乏黃色光譜區的額外激發峰［55］。2015年，的突變體hmKeima8.5［56］具有更高的細胞內亮度，且其斯托克斯位移增加至約180 nm，這些性質使其更適用于生物科學研究。LSSmKate2具有較低的細胞毒性，能夠在哺乳動物細胞內穩定的表達。2014年，LSSmKate的一個突變體PSLSSmKate具有可光活化的特性［57］，相信通過對其結構的進一步研究能夠指導我們進一步改善使其能夠用于光活化成像。2013年，由mKate突變獲得了一種新的LSSFP：mBeRFP，其中包括5個氨基酸突變。原始的mKate發色團中的68位Tyr比較靠近發生突變的147位Ser和162位Glu，假定發色團與162位Glu能夠形成氫鍵從而使發色團處于相對穩定的中性環境，而突變可能改變了這種穩態，使得其性質發生變化，具體的原理還有待進一步研究［58］。2014年，Pletnev等［59］研究了LSSmOrange的晶體結構發現，其中唯一的突變Ile161Asp對于其性質的改進以及超大的斯托克斯位移有重要的意義。

圖3 斯托克斯位移示意圖

LSSFP的光譜特性對于使用單一的激發波長激發的多色應用是有利的。熒光互相關光譜（Fluorescence cross-correlation spectroscopy，FCCS）是一種可變的熒光相關光譜（Fluorescence Correlation Spectroscopy，FCS），其被優化用來研究相對分子量相似的蛋白質之間的相互作用。在雙色FCCS中，兩個信號之間的互相關程度與相互作用對的百分比相關。與FRET相反，FCCS不依賴于接近度和熒光蛋白之間的有利取向［60］。單激光雙色FCCS比雙激光器設置更有優勢因為它不需要兩個激光器精確對準共同共焦點。紅色LSSFP，mKeima與青色熒光蛋白（Cyan fluorescent protein，CFP）一起能夠被同一激光有效地激發產生雙色FCCS。這一戰略已經擴大到實現四色FCCS。對于FRET紅色LSSFP是很好的探針。LSSFP是遠紅外熒光蛋白的假定供體和藍色熒光蛋白的潛在受體。紅色LSSFP供體激發光譜和紅色LSSFP受體發射光譜的較大差異在相應的FRET組合中能夠產生低背景和高靈敏度FRET測定［61］?；贚SSFP的FRET對也可以與其他FRET對結合使用，如LSSmOrange-mKate2 FRET對與CFPYFP（Yellow fluorescent protein）FRET生物傳感器一起使用在單個細胞中同時成像兩個過程。2016年，Laviv等［62］對應用于FRET的熒光蛋白對進行了優化新開發的熒光蛋白對中采用能夠激發紅色熒光的LSSFP的mCyRFP1。LSSFP在生物學研究中的應用尤為重要，但是目前的LSSFP亮度普遍較低，而且在使用過程中只能與CFP聯合使用，所以尋找能夠與亮度最大的GFP聯合使用的LSSFP成為了急需解決的問題。表2給出了幾種LSSFP及其特征參數。

2.4 熒光計時器蛋白

熒光計時器（Fluorescent timers，FT）蛋白可以隨著時間改變其熒光顏色。這個現象是基于其較慢的發色團形成過程，中間發色團和最終發色團在不同的光譜范圍內形成熒光。可預測的顏色變化時間過程使得體內的時間和空間變化能夠定量分析［63］。關于其顏色變化的機制還有待進一步的研究。與下節描述的適用于研究快速細胞內動力學研究的可光活化熒光蛋白相反，熒光計時器通常用于研究相對較慢的變化。

表2 常見LSSFP的特征參數

目前有兩種類型的熒光計時器，第一種是mCherry衍生的單體快速（Fast-FT）、中等（Medium-FT）和慢速（Slow-FT）熒光計時器，隨著時間的變化它們的熒光從藍色變化到紅色。藍色和紅色FT亮度較高，具有pH穩定性，并且能夠完成藍色到紅色熒光的轉換，但是這種FT需要在強紫外光下使用，這導致其在生物學研究中的使用變得復雜。2015年，Takamura等［64］，通過體外重組FT碎片研究其顏色變化以及速率的方式對活細胞中的α-突觸核蛋白的聚集過程進行了可視化研究。另一種類型的FT是單體Kusabira Green Orange（mK-GO）其顏色隨時間從綠色變為橙色。與mCherry衍生的FT相反，兩種形式的mK-GO獨立成熟。綠色形式的mK-GO在橙色形式的mK-GO成熟后不消失。完全成熟后橙-綠兩種形式的比例從約0.1變為0.7。圖4表示了這兩種FT的基本原理。這種類型的FT在熒光的敏感程度不如第一種類型的FT。單體FT可以用于估計它所標記的目的蛋白的年齡。能用Medium-FT和mKGO［65］確定參與自噬和內吞作用的組分的年齡。目前這兩種類型的FT都存某些缺點，限制了其在生物科學研究領域中的順利應用，因此接下來的研究任務是改進其應用的方便性及增加其熒光敏感性。

圖4 傳統熒光計時器示意圖

2012年，Khmelinskii等［66］通過串聯熒光蛋白定時器（Tandem fluorescent protein timers，tFT）來測量細胞過程中的動力學反應。其原理是根據兩個串聯的熒光蛋白在發色團成熟過程中存在的時間差，整個檢測過程中不同時間被檢測細胞顯示的顏色有所差異，也因此可以判定被檢測蛋白的年齡及狀態。圖5表示了這種串聯熒光定時器的基本原理。tFT與定量雙色熒光顯微鏡成像結合使用時能夠提供從亞細胞到有機體的信號傳導活動的詳細“快照”讀數，對于研究胚胎發育的研究具有重要的意義［67］。而在之后許多科學家也對此進行了研究［68-69］，其中使用最多是成熟較慢的紅色熒光蛋白mCherry與成熟較快的綠色熒光蛋白（Superfolder green fluorescent protein，sfGFP）串聯形成的tFT。在2016年，Khmelinskii等［70］又通過不同的綠色熒光蛋白與mCherry串聯研究了綠色熒光蛋白成熟動力學對tFT時間范圍的影響，研究表明，實驗過程中的不完全蛋白酶降解會影響到tFT的時間檢測范圍，所以在進行實驗時有必要通過研究蛋白酶體降解來進一步精確tFT的檢測范圍。

2.5 可活化紅色熒光蛋白

圖5 串聯熒光定時器示意圖

圖6 PAFP原理示意圖

能夠由光調節其熒光性質的熒光蛋白適合用于各種選擇性成像標記技術，從粒子跟蹤到超分辨率成像都適用，具有這種性質的熒光蛋白稱為可光活化熒光蛋白（Photoactivatable FP，PAFP）。PAFP的重要特性主要包括兩方面，首先是光活化對比度；其次是熒光蛋白在初始狀態和光活化狀態的亮度。光活化對比度是光活化后的熒光強度和光活化前的熒光強度的比率。較高的對比度能夠產生更大的信號與背景比；另一個要考慮的參數是光活化時所需的光強度：不應該高到對細胞有害，同樣也不能低到可以自發發生光活化。目前有3種類型的不可逆紅色PAFP（圖6）：從暗到紅可光活化PAmCherry樣紅色熒光蛋白，如PAmCherry和PATagRFP，其中的PATagRFP在亮度和光穩定性方面比PAmCherry更好［71］；從綠到紅可光活化Kaede樣紅色熒光蛋白，如Dendra2［72］、mEos3［73］和mKikGR是目前比較常用的PAFP，在2010年的一個突變體mClavGR2 PSFP是一個亮度和光轉化對比度更加優秀的PAFP［74］；以及最近發現的從橙到遠紅可活化熒光蛋白PSmOrange［75］，目前為止其具有最遠的紅色激發峰。2013年產生的PAiRFP1和PAiRFP2能夠在近紅外窗口產生激發光應用于組織內部檢測［76］。

PAFP可以用來標記目標蛋白、特定細胞器或細胞。用PAFP標記蛋白一般用于研究蛋白動力學和轉運。細胞器光標記能夠監測裂變和融合。細胞追蹤適用于研究發育、癌變和炎癥反應［77］。PAFP的特性使其適合于在體內的長期跟蹤檢測。在FRET成像中也可以使用PAFP，可以基于一個簡單的方法在一個細胞區室中特定PAFP的光活化然后監測PAFP供體和常規紅色熒光蛋白受體之間不同的細胞區域FRET。PAFP表型對光活化定位顯微鏡（Photoactivated localization microscopy，PALM）［78-79］和熒光PALM（Fluorescent photo-activated localization mic-roscopy，FPALM）超分辨率方法至關重要。PALM依賴于單分子成像，單分子亮度以及背景和光活化后光子輸出之間的對比度在這項技術中是關鍵的熒光蛋白特性。在PALM方法中，較高的對比度引起較高的空間分辨率，因此其成像伴隨較低的自發熒光背景的紅色熒光蛋白是優選PALM探針［80］，這些蛋白不產生綠色熒光因此能夠與綠色PAFP相結合使用達到更高的分辨率。值得一提的是，2014年的諾貝爾化學獎就表彰了Eric Bctzig等3位科學家在超高分辨率熒光顯微鏡上的貢獻。PAFP的特性影響著PALM圖像質量，主要包括每個周期發射的光子數量、蛋白的二聚化現象以及蛋白的信號效率。目前已知的各種PAFP都有很高程度的二聚化現象這就導致其信號效率變低影響PALM的圖像質量［81］，生產出沒有二聚化現象的PAFP是今后改造工作的首要目標。表3列舉了幾種常見的可活化紅色熒光蛋白。2.6 可逆光開關紅色熒光蛋白

表3 常見可活化紅色熒光蛋白特征參數［82-84］

圖7 rsFP原理示意圖

可逆光開關熒光蛋白（Reversibly switchable fluorescent protein，rsFP）可以在兩者之間重復光開關熒光和非熒光狀態。這種屬性能夠促使產生新的成像技術。2009年發現的紅色rsFP包括rsCherry［85］、rsCherryRev和rsTagRFP［86］。用550-570 nm光照射rsTagRFP能夠關閉紅色熒光狀態使其在567 nm的光吸收特性變成在440 nm有光吸收的暗態，而照射430-450 nm光將暗態切換回熒光態。圖7顯示了rsFP的基本原理。rsFP的這種特性有可能是由于用相應波長的光照射能夠使其發色團發生順-反光異構化，伴隨著質子化與去質子化產生亮暗的轉化?？赡娴責晒廪D化表型可以為超分辨率技術提供優勢。然而，在實踐中使用rsFP的超分辨率成像受到熒光蛋白缺乏“耐疲勞”的限制。此外，即使亮度和對比度最好的可用紅色rsFPs都不如那些紅色PAFP和PSFP效果好［87］。到目前為止，已經報道了5種基于rsFP的超辨率技術，可逆飽和光學（熒光）轉換（Reversible saturable optical fluorescence transitions，RESOLFT）、PALM運行采集（PALM independently running acquisition，PALMIRA）、活細胞納米鏡（Live-cell fluorescence nanoscopy）［88］和PALM與雙色頻閃照明（Two-color troboscopic illumination PALM，S-PALM）顯微鏡，以及2015年出現的光致變色隨機光波動成像（Photochromic stochastic optical fluctuation imaging，pcSOFI）［89］。2016年，Wang等［90］報道了GMars-Q，這是一種具有低殘留強度和較強的抗疲勞特性，這種抗疲勞特性歸因于雙相光漂白過程。這種rsFP的性質對于RESOLFT是非常有利的。紅色rsFP已應用于RESOLFT對細菌成像，使用的是四聚體asFP595rsFP。2014年，Lavoie-Cardinal等［91］將一種新的紅色熒光蛋白rsCherryRev1.4用于RESOLFT成像，獲得了高出衍射屏障4倍的空間分辨率。表4給出了幾種常見的可逆光開關紅色熒光蛋白及其特征參數。

表4 常見可逆光開關紅色熒光蛋白特征參數

目前紅色rsFPs仍然具有限制其廣泛應用的不足，包括其較低的耐疲勞性，較慢的光轉化效率以及其較差的穩定性，但是科學家們已經通過改造得到了相對優秀的綠色rsFPs突變體［92］。例如，2016年出現的rsFolder和rsFolder2是由rsFolder是通過Superfolder-GFP與rsEGFP2的雜交設計的，能夠用于有效的研究細胞室內的研究［93］。同樣，由Smyrnova等［94］改進的突變體rsFastLime（Dronpa V157G）和rsKame（Dronpa V157L）在轉化速度方面具有很大的優勢，這兩種突變體都通過異構化進行轉化。并且通過功能模式分析得出其中的Val / Leu 157和α-螺旋中的氨基酸在異構化過程中有很重要的作用。而2015年出現的Skylan-S具有很高的光穩定性［95］。Morozov等［96］通過對Dronpa快速切換Met159Thr突變體的分子動力學模擬的研究指出，以后在進行新的rsFP的研究時除了關注結構方面的還要關注異構化方面的研究。有這些優秀的突變體以及其結構性質方面的研究作為參考，相信性質更加完善的紅色rsFPs的改造能夠很快的出現輔助于改善RESOLFT和PALMIRA性能，并使這些技術廣泛應用于研究具有超分辨率精確度的細胞內過程。

3 發色團研究

熒光蛋白顏色的多樣性是因其發色團多樣性以及蛋白所處化學環境的多樣性導致的必然結果。由于科學家對于熒光蛋白的研究和改進，科學家們在研究先進熒光蛋白的同時也對其發色團的結構和形成過程進行了研究，而發色團自催化和光誘導化學的基本原理已經為人們所知［97］。這無疑為操縱發色團結構之間的躍遷提供了可能性，相信日后我們會獲得新的熒光蛋白表型。這里主要介紹紅色熒光蛋白的發光團。迅速發展的成像應用促進了紅色熒光蛋白探針的改進?；趯t色熒光蛋白發色團的發色原理的了解，科學家們對紅色熒光蛋白進行了有效的改進。用于紅色熒光蛋白改造的方法有很多種包括有晶體學方法［98］、突變、同位素研究、質譜［99-101］等方法都應用于熒光蛋白的改進。我們完全可以應用這些手段制定合理的改進策略。

紅色熒光蛋白的發色團中的三肽由固定的66位Tyr和67位Gly以及可變的65位氨基酸殘基構成。其中核心4-對羥基亞芐基-5-咪唑啉酮結構在紅色熒光蛋白是共有的發色團組成部分，而65位氨基酸殘基的變化是導致其光譜范圍變化的原因。在多種多樣的發色團中還有一種稱為光敏劑的發色團，這種發色團在被光照射時能夠產生活性氧，可以用于靶蛋白的精確光誘導失活、DNA損傷和細胞殺傷。經過晶體結構的研究表明GFP樣光敏劑中的獨特結構特征是沿著β-桶軸從發色團延伸到筒體末端的充水通道［102］。2015年，Pletneva等［103］通過對二聚KillerOrange和單體mKillerOrange的晶體學研究發現在兩種蛋白質中，發色團的Trp66通過與其附近的Gln159形成氫鍵來穩定一種不尋常的反式-順式構象。這種反式-順式構象和水通道是這兩種橙色光敏劑產生明亮的橙色熒光和光毒性的關鍵結構特征。目前已知有兩種類型的紅色發光團：DsRed樣和Kaede樣發光團。有自催化或者三肽的光誘導轉化，Kaede樣發光團三肽只能產生光化學，而紅色熒光蛋白的不同色調由DsRed樣發色團的進一步轉化產生。

目前，包含有DsRed樣發色團的紅色熒光蛋白家族主要有3個：DsRed的衍生物、eqFP611和eqFP578。研究顯示，DsRed樣發色團的成熟過程，首先包含有mTagBFP［104］發色團的N-?；鶃啺稢 = N的形成，然后Tyr66側鏈的Cα-Cβ雙鍵形成。只有一個DsRed樣紅色熒光蛋白通過GFP樣生色團中間體成熟。關于幾個具有不同的表型熒光蛋白的研究表明其具有mTagBFP樣藍色中間體的結構。

第二種類型的紅色發色團，Kaede樣發色團，發現于紅色狀態的PSFP（Photoswitchable fluorescent proteins）。在綠色態下，這些熒光蛋白具有GFP樣發色團。用紫光照射后，β消除反應引起綠色至紅色的光轉化反應。這個過程中65位的His N- Cα鍵被切斷，側鏈的Cα-Cβ雙鍵形成，導致π-共軛系統延伸并得到Kaede樣紅色發色團。

對于光可控的熒光蛋白發色團的研究目前有一些進展，光控的熒光蛋白分為可逆和不可逆的光活化，在可逆光轉化中其發色團的原理包括順反式異構化，質子化-去質子化和脫水縮合。而不可逆的光轉化包括發色團內的共軛π系統，相鄰Glu的脫羧和多肽主干的斷裂。但是目前依然不清楚可逆光開關抗疲勞的化學基礎，而在這方面的改進是現在生物科學研究技術中急需的。

基于目前已知的紅色發色團、其衍生物以及其中的過渡態的結構數據可以得出以下結論：首先，發色團結構之間的化學轉變可以發生自催化，光誘導或者被阻塞。第二，發色團可以處于熒光狀態或色原態。第三，發色團中的氨基酸殘基及其微環境決定發色團結構之間的轉變以及所產生的熒光蛋白表型。電子結構計算和模型的化學合成與結晶學共同應用、質譜、生物化學和光物理表征等技術的進一步研究，將助力于進一步闡明發色團的化學和光譜行為。

4 展望

人們對紅色熒光蛋白結構和功能的理解在過去幾年里已經大大提高了，但仍有許多爭議和謎團需解決。在現有知識的基礎上，可以設計和改進以得到具有新的光化學性質的紅色熒光蛋白。目前對熒光蛋白的激發態的理論研究已經有許多了，我們仍在努力闡明發射熒光的調節機制。

對于紅色熒光蛋白的研究不僅是理性工程，也有可能是將隨機誘變與高通量篩選技術相結合來達到使紅色熒光蛋白分子有效進化的目的。當然，不排除新的克隆或者新發現的紅色熒光蛋白具有前所未有的光化學性質。正如Tsien［105］博士在1999年所說：“這些分子工具的普及使得欣賞陽光和珊瑚蟲動物體內的熒光蛋白之間的相互作用變得重要，并且促使我們考慮如何使這些獨特的蛋白在生物學研究中得到最佳應用”。通過一些優秀突變體的結構分析我們了解了一些能夠引起熒光蛋白性質變化的位點，結合種類繁多的紅色熒光蛋白，配合紅色熒光蛋白的應用相信可以設計和生產出令人滿意的突變體。

新出現的紅色熒光蛋白肯定會刺激許多生物學家的想象力，反之也激發了生物學家們對于開發新的突變體和新技術的需求，使他們有高漲的研究熱情。當然與此同時，熒光顯微鏡將不可避免地不斷配備特殊的硬件和軟件功能來配合這些紅色熒光蛋白的使用。例如，用于深層組織和活體成像的顯微鏡的進化，是實現雙光子激發紅色熒光蛋白充分利用的必要條件［106］。

［1］Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, et al. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein［J］. Gene, 1992, 111（2）：229-233.

［2］Matz MV, Fradkov AF, Labas YA, et al. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species［J］. Nat Biotechnol, 1999, 17（10）：969-973.

［3］Strack RL, Strongin DE, Bhattacharyya D, et al. A non-cytotoxic DsRed variant for whole-cell labeling［J］. Nature Methods, 2008, 5（11）：955-957.

［4］Tao W, Evans B, Yao J, et al. Enhanced green fluorescent protein is a nearly ideal long-term expression tracer for hematopoietic stem cells, whereas DsRed-express fluorescent protein is not［J］. Stem Cells, 2007, 25（3）：670-678.

［5］Yang F, Moss LG, Phillips GN Jr. The molecular structure of green fluorescent protein［J］. Nat Biotechnol, 1996, 14（10）：1246-1251.

［6］Orm? M, Cubitt AB, Kallio K, et al. Crystal structure of the green fluorescent protein［J］. Science, 1996, 273（5280）：1392-1395.

［7］Subach OM, Patterson GH, Ting L, et al. A photoswitchable orangeto-far-red fluorescent protein, PSmOrange［J］. Nature Methods, 2011, 8（9）：771-777.

［8］Ehrenberg M, 羅文新, 夏寧邵. 綠色熒光蛋白——發現、表達和發展［J］. 生物物理學報, 2008（6）：422-429.

［9］Park N, Song J, Jeong S, et al. Vaccinia-related kinase 3（VRK3）sets the circadian period and amplitude by affecting the subcellular localization of clock proteins in mammalian cells［J］. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2017, 487（2）：320-326.

［10］Zhao D, Xue C, Lin S, et al. Notch signaling pathway regulates angiogenesis via endothelial cell in 3D Co-culture model［J］. Journal of Cellular Physiology, 2017, 232（6）：1548-1558.

［11］Wachter RM, Watkins JL, Kim H. Mechanistic diversity of red fluorescence acquisition by GFP-like proteins［J］. Biochemistry, 2010, 49（35）：7417-7427.

［12］Strack RL, Bhattacharyya D, Glick BS, et al. Noncytotoxic orange and red/green derivatives of DsRed-Express2 for whole-cell labeling［J］. BMC Biotechnology, 2009, 9：32.

［13］Dash AK, Yende AS, Tyagi RK. Novel Application of red fluorescent protein（DsRed-Express）for the study of functional dynamics of nuclear receptors［J］. Journal of Fluorescence, 2017：1-7.

［14］Shaner NC, Lin MZ, Mckeown MR, et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins［J］. Nature Methods, 2008, 5（6）：545-551.

［15］Merzlyak EM, Goedhart J, Shcherbo D, et al. Bright monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime［J］. Nat Methods, 2007, 4（7）：555-557.

［16］Sakaue-Sawano A, Kurokawa H, Morimura T, et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression［J］. Cell, 2008, 132（3）：487-498.

［17］Tsutsui H, Karasawa S, Okamura Y, et al. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins［J］. Nat Methods, 2008, 5（8）：683-685.

［18］Bindels DS, Haarbosch L, van Weeren L, et al. mScarlet：a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging［J］. Nat Methods, 2017, 14（1）：53-56.

［19］Pandelieva AT, Baran MJ, Calderini GF, et al. Brighter red fluorescent proteins by rational design of triple-decker motif［J］. ACS Chemical Biology, 2016, 11（2）：508-517.

［20］Fan Y, Ai H. Development of redox-sensitive red fluorescent proteins for imaging redox dynamics in cellular compartments［J］. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2016, 408（11）：2901-2911.

［21］Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA, et al. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein［J］. Nat Biotechnol, 2004, 22（12）：1567-1572.

［22］Wannier TM, Moore MM, Mou Y, et al. Computational design of the β-sheet surface of a red fluorescent protein allows control of protein oligomerization［J］. PLoS One, 2015, 10（6）：e130582.

［23］Hasegawa J, Ise T, Fujimoto KJ, et al. Excited States of fluorescent proteins, mKO and DsRed：chromophore-protein electrostaticinteraction behind the color variations［J］. The Journal of Physical Chemistry B, 2010, 114（8）：2971-2979.

［24］Bravaya KB, Grigorenko BL, Nemukhin AV, et al. Quantum chemistry behind bioimaging：insights from Ab initio studies of fluorescent proteins and their chromophores［J］. Accounts of Chemical Research, 2012, 45（2）：265-275.

［25］Ikmi A, Gibson MC. Identification and in vivo characterization of NvFP-7R, a developmentally regulated red fluorescent protein of Nematostella vectensis［J］. PLoS One, 2010, 5（7）：e11807.

［26］Shcherbo D, Murphy CS, Ermakova GV, et al. Far-red fluorescent tags for protein imaging in living tissues［J］. The Biochemical Journal, 2009, 418（3）：567-574.

［27］Kredel S, Nienhaus K, Oswald F, et al. Optimized and far-redemitting variants of fluorescent protein eqFP611［J］. Chemistry & Biology, 2008, 15（3）：224-233.

［28］Chica RA, Moore MM, Allen BD, et al. Generation of longer emission wavelength red fluorescent proteins using computationally designed libraries［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107（47）：20257-20262.

［29］Shkrob MA, Yanushevich YG, Chudakov DM, et al. Far-red fluorescent proteins evolved from a blue chromoprotein from Actinia equina［J］. Biochemical Journal, 2005, 392（Pt 3）：649-654.

［30］Wannier TM, Mayo SL. The structure of a far-red fluorescent protein, AQ143, shows evidence in support of reported red-shifting chromophore interactions［J］. Protein Science：A Publication of the Protein Society, 2014, 23（8）：1148-1153.

［31］Mcisaac RS, Engqvist MKM, Wannier T, et al. Directed evolution of a far-red fluorescent rhodopsin［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111（36）：13034-13039.

［32］Konold PE, Yoon E, Lee J, et al. Fluorescence from multiple chromophore hydrogen-bonding states in the far-red protein TagRFP675［J］. The Journal of Physical Chemistry Letters, 2016, 7（15）：3046-3051.

［33］Hense A, Prunsche B, Gao P, et al. Monomeric Garnet, a far-red fluorescent protein for live-cell STED imaging［J］. Scientific Reports, 2015, 5：18006.

［34］Yu D, Dong Z, Gustafson WC, et al. Rational design of a monomeric and photostable far red fluorescent protein for fluorescence imaging in vivo［J］. Protein Science：A Publication of the Protein Society, 2015, 25（2）：308-315.

［35］Bajar BT, Lam AJ, Badiee RK, et al. Fluorescent indicators for simultaneous reporting of all four cell cycle phases［J］. Nat Methods, 2016, 13（12）：993-996.

［36］Li Z, Zhang Z, Bi L, et al. Mutagenesis of mNeptune red-shifts emission spectrum to 681-685 nm［J］. PLoS One, 2016, 11（4）：e148749.

［37］Ren H, Yang B, Ma C, et al. Cysteine sulfoxidation increases the photostability of red fluorescent proteins［J］. ACS Chemical Biology, 2016, 11（10）：2679-2684.

［38］Shcherbo D, Merzlyak EM, Chepurnykh TV, et al. Bright far-red fluorescent protein for whole-body imaging［J］. Nat Methods, 2007, 4（9）：741-746.

［39］Shcherbo D, Shemiakina II, Ryabova AV, et al. Near-infrared fluorescent proteins［J］. Nature Methods, 2010, 7（10）：827-829.

［40］Armengol P, Gelabert R, Moreno M, et al. Chromophore interactions leading to different absorption spectra in mNeptune1 and mCardinal red fluorescent proteins［J］. Physical Chemistry Chemical Physics, 2016, 18（25）：16964-16976.

［41］Shu X, Royant A, Lin MZ, et al. Mammalian expression of infrared fluorescent proteins engineered from a bacterial phytochrome［J］. Science（New York, N. Y. ）, 2009, 324（5928）：804-807.

［42］Filonov GS, Piatkevich KD, Ting L, et al. Bright and stable near infra-red fluorescent protein for in vivo imaging［J］. Nature Biotechnology, 2011, 29（8）：757-761.

［43］Lin L, Wang B, Chen J, et al. mPlum-IFP 1. 4 fluorescent fusion protein may display F?rster resonance energy transfer associated properties that can be used for near-infrared based reporter gene imaging［J］. Journal of Biomedical Optics, 2013, 18（12）：126013.

［44］Bajar BT, Wang ES, Zhang S, et al. A guide to fluorescent protein FRET pairs［J］. Sensors（Basel, Switzerland）, 2016, 16（9）：1488.

［45］Moore MM, Oteng-Pabi SK, Pandelieva AT, et al. Recovery of red fluorescent protein chromophore maturation deficiency through rational design［J］. PLoS One, 2012, 7（12）：e52463.

［46］Veal EA, Day AM, Morgan BA. Hydrogen peroxide sensing and signaling［J］. Molecular Cell, 2007, 26（1）：1-14.

［47］Kumagai A, Ando R, Miyatake H, et al. A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle［J］. Cell, 2013, 153（7）：1602-1611.

［48］Rodriguez EA, Tran GN, Gross LA, et al. A far-red fluorescent protein evolved from a cyanobacterial phycobiliprotein［J］. Nature Methods, 2016, 13（9）：763-769.

［49］Ai H, Hazelwood KL, Davidson MW, et al. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors［J］. 2008, 5（5）：401-403.

［50］Shcherbakova DM, Hink MA, Joosen L, et al. An orange fluorescent protein with a large Stokes shift for single-excitation multicolor FCCS and FRET imaging［J］. Journal of the American Chemical Society, 2012, 134（18）：7913-7923.

［51］Kogure T, Karasawa S, Araki T, et al. A fluorescent variant of a protein from the stony coral Montipora facilitates dual-color single-laser fluorescence cross-correlation spectroscopy［J］. Nat Biotechnol, 2006, 24（5）：577-581.

［52］Piatkevich KD, Hulit J, Subach OM, et al. Monomeric red fluorescent proteins with a large Stokes shift［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2010, 107（12）：5369-5374.

［53］Kennis JTM, van Stokkum IHM, Peterson DS, et al. Ultrafast proton shuttling in psammocora cyan fluorescent protein［J］. The Journal of Physical Chemistry B, 2013, 117（38）：11134-11143.

［54］Fron E, De Keersmaecker H, Rocha S, et al. Mechanism behind the apparent large stokes shift in lssmorange investigated by timeresolved spectroscopy［J］. The Journal of Physical Chemistry B, 2015, 119（47）：14880-14891.

［55］Piatkevich KD, Malashkevich VN, Almo SC, et al. Engineering ESPT pathways based on structural analysis of LSSmKate red fluorescent proteins with large Stokes shift［J］. Journal of the American Chemical Society, 2010, 132（31）：10762-10770.

［56］Guan Y, Meurer M, Raghavan S, et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein［J］. Molecular Biology of the Cell, 2014, 26（11）：2054-2066.

［57］Piatkevich KD, English BP, Malashkevich VN, et al. Photoswitchable red fluorescent protein with a large Stokes shift［J］. Chemistry & Biology, 2014, 21（10）：1402-1414.

［58］Yang J, Wang L, Yang F, et al. mBeRFP, an improved large stokes shift red fluorescent protein［J］. PLoS One, 2013, 8（6）：e64849.

［59］Pletnev S, Shcherbakova DM, Subach OM, et al. Orange fluorescent proteins：structural studies of LSSmOrange, PSmOrange and PSmOrange2［J］. PLoS One, 2014, 9（6）：e99136.

［60］Bacia K, Kim SA, Schwille P. Fluorescence cross-correlation spectroscopy in living cells［J］. Nat Methods, 2006, 3（2）：83-89.

［61］Lindenburg LH, Malisauskas M, Sips T, et al. Quantifying stickiness：thermodynamic characterization of intramolecular domain interactions to guide the design of f?rster resonance energy transfer sensors［J］. Biochemistry, 2014, 53（40）：6370-6381.

［62］Laviv T, Kim BB, Chu J, et al. Simultaneous dual-color fluorescence lifetime imaging with novel red-shifted fluorescent proteins［J］. 2016, 13（12）：989-992.

［63］Zhu X, Zhang L, Kao Y, et al. A tunable fluorescent timer method for imaging spatial-temporal protein dynamics using light-driven photoconvertible protein［J］. Journal of Biophotonics, 2015, 8（3）：226-232.

［64］Takamura A, Hattori M, Yoshimura H, et al. Simultaneous timelamination imaging of protein association using a split fluorescent timer protein［J］. Analytical Chemistry, 2015, 87（6）：3366-3372.

［65］Tsuboi T, Kitaguchi T, Karasawa S, et al. Age-dependent preferential dense-core vesicle exocytosis in neuroendocrine cells revealed by newly developed monomeric fluorescent timer protein［J］. Molecular Biology of the Cell, 2009, 21（1）：87-94.

［66］Khmelinskii A, Keller PJ, Bartosik A, et al. Tandem fluorescent protein timers for in vivo analysis of protein dynamics［J］. Nat Biotechnol, 2012, 30（7）：708-714.

［67］Barry JD, Donà E, Gilmour D, et al. TimerQuant：a modelling approach to tandem fluorescent timer design and data interpretation for measuring protein turnover in embryos［J］. Development（Cambridge, England）, 2015, 143（1）：174-179.

［68］Khmelinskii A, Knop M. Analysis of protein dynamics with tandem fluorescent protein timers［M］. Exocytosis and Endocytosis, Ivanov AI, New York：Springer New York, 2014, 195-210.

［69］Dona E, Barry JD, Valentin G, et al. Directional tissue migration through a self-generated chemokine gradient［J］. Nature, 2013,503（7475）：285-289.

［70］Khmelinskii A, Meurer M, Ho C, et al. Incomplete proteasomal degradation of green fluorescent proteins in the context of tandem fluorescent protein timers［J］. Molecular Biology of the Cell, 2015, 27（2）：360-370.

［71］Subach FV, Patterson GH, Renz M, et al. Bright monomeric photoactivatable red fluorescent protein for two-color superresolution sptPALM of live cells［J］. Journal of the American Chemical Society, 2010, 132（18）：6481-6491.

［72］Chudakov DM, Lukyanov S, Lukyanov KA. Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PSCFP2 and Dendra2［J］. 2007, 2（8）：2024-2032.

［73］Zhang M, Chang H, Zhang Y, et al. Rational design of true monomeric and bright photoactivatable fluorescent proteins［J］. 2012, 9（7）：727-729.

［74］Hoi H, Shaner NC, Davidson MW, et al. A monomeric photoconvertible fluorescent protein for imaging of dynamic protein localization［J］. Journal of Molecular Biology, 2010, 401（5）：776-791.

［75］Subach OM, Patterson GH, Ting L, et al. A photoswitchable orangeto-far-red fluorescent protein, PSmOrange［J］. Nature Methods, 2011, 8（9）：771-777.

［76］Piatkevich KD, Subach FV, Verkhusha VV. Far-red light photoactivatable near-infrared fluorescent proteins engineered from a bacterial phytochrome［J］. Nature Communications, 2013, 4：2153.

［77］Griswold SL, Sajja KC, Jang C, et al. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time lapse imaging during development［J］. Genesis, 2011, 49（7）：591-598.

［78］Nickerson A, Huang T, Lin L, et al. Photoactivated localization microscopy with bimolecular fluorescence complementation（BiFCPALM）［J］. J Vis Exp, 2015（106）：e53154.

［79］Shroff H, White H, Betzig E. Photoactivated localization microscopy（PALM）of adhesion complexes［J］. Current Protocols in Cell Biology, 2013, Chapter 4：t4.t21.

［80］Brown TA, Tkachuk AN, Shtengel G, et al. Superresolution fluorescence imaging of mitochondrial nucleoids reveals their spatial range, limits, and membrane interaction［J］. Molecular and Cellular Biology, 2011, 31（24）：4994-5010.

［81］Wang S, Moffitt JR, Dempsey GT, et al. Characterization and development of photoactivatable fluorescent proteins for singlemolecule-based superresolution imaging［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2014, 111（23）：8452-8457.

［82］Mckinney SA, Murphy CS, Hazelwood KL, et al. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein for fusion tags［J］. Nature Methods, 2009, 6（2）：131-133.

［83］Fuchs J, Bohme S, Oswald F, et al. A photoactivatable marker protein for pulse-chase imaging with superresolution［J］. 2010, 7（8）：627-630.

［84］Subach OM, Entenberg D, Condeelis JS, et al. A FRET-facilitated photoswitching using an orange fluorescent protein with the fast photoconversion kinetics［J］. Journal of the American Chemical Society, 2012, 134（36）：14789-14799.

［85］Subach FV, Subach OM, Gundorov IS, et al. Monomeric fluorescent timers that change color from blue to red report on cellular trafficking［J］. Nature Chemical Biology, 2009, 5（2）：118-126.

［86］Tsuboi T, Kitaguchi T, Karasawa S, et al. Age-dependent preferential dense-core vesicle exocytosis in neuroendocrine cells revealed by newly developed monomeric fluorescent timer protein［J］. Molecular Biology of the Cell, 2009, 21（1）：87-94.

［87］Griswold SL, Sajja KC, Jang C, et al. Generation and characterization of iUBC-KikGR photoconvertible transgenic mice for live time lapse imaging during development［J］. Genesis, 2011, 49（7）：591-598.

［88］Jensen NA, Danzl JG, Willig KI, et al. Coordinate-targeted and coordinate-stochastic super-resolution microscopy with the reversibly switchable fluorescent protein dreiklang［J］. Chemphyschem, 2014, 15（4）：756-762.

［89］Duwé S, Moeyaert B, Dedecker P. Diffraction-unlimited fluorescence microscopy of living biological samples using pcSOFI［J］. Curr Protoc Chem Biol, 2015, 7：27-41.

［90］Wang S, Chen X, Chang L, et al. GMars-Q enables long-term livecell parallelized reversible saturable optical fluorescence transitions nanoscopy［J］. ACS Nano, 2016, 10（10）：9136-9144.

［91］Lavoie-Cardinal F, Jensen NA, Westphal V, et al. Two-color RESOLFT nanoscopy with green and red fluorescent photochromicproteins［J］. Chemphyschem, 2014, 15（4）：655-663.

［92］Zhang X, Zhang M, Li D, et al. Highly photostable, reversibly photoswitchable fluorescent protein with high contrast ratio for livecell superresolution microscopy［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2016, 113（37）：10364-10369.

［93］El Khatib M, Martins A, Bourgeois D, et al. Rational design of ultrastable and reversibly photoswitchable fluorescent proteins for super-resolution imaging of the bacterial periplasm［J］. Scientific Reports, 2016, 6：18459.

［94］Smyrnova D, Zinovjev K, Tu?ón I, et al. Thermal isomerization mechanism in dronpa and its mutants［J］. The Journal of Physical Chemistry B, 2016, 120（50）：12820-12825.

［95］Zhang X, Chen X, Zeng Z, et al. Development of a reversibly switchable fluorescent protein for super-resolution optical fluctuation imaging（SOFI）［J］. ACS Nano, 2015, 9（3）：2659-2667.

［96］Morozov D, Groenhof G. Hydrogen bond fluctuations control photochromism in a reversibly photo-switchable fluorescent protein［J］. Angewandte Chemie International Edition, 2016, 55（2）：576-578.

［97］Subach OM, Malashkevich VN, Zencheck WD, et al. Structural characterization of acylimine-containing blue and red chromophores in mTagBFP and TagRFP fluorescent proteins［J］. Chemistry & Biology, 2010, 17（4）：333-341.

［98］Armengol P, Gelabert R, Moreno M, et al. New insights into the structure-spectrum relationship in S65T/H148D and E222Q/H148D green fluorescent protein mutants：a theoretical assessment［J］. Organic & Biomolecular Chemistry, 2014, 12（48）：9845-9852.

［99］Pletnev S, Subach FV, Dauter Z, et al. Understanding blue-tored conversion in monomeric fluorescent timers and hydrolytic degradation of their chromophores［J］. Journal of the American Chemical Society, 2010, 132（7）：2243-2253.

［100］Henderson JN, Osborn MF, Koon N, et al. Excited state proton transfer in the red fluorescent protein mKeima［J］. Journal of the American Chemical Society, 2009, 131（37）：13212-13213.

［101］Shu X, Wang L, Colip L, et al. Unique interactions between the chromophore and glutamate 16 lead to far-red emission in a red fluorescent protein［J］. Protein Science：A Publication of the Protein Society, 2009, 18（2）：460-466.

［102］Takemoto K, Matsuda T, Sakai N, et al. SuperNova, a monomeric photosensitizing fluorescent protein for chromophore-assisted light inactivation［J］. Scientific Reports, 2013, 3：2629.

［103］Pletneva NV, Pletnev VZ, Sarkisyan KS, et al. Crystal structure of phototoxic orange fluorescent proteins with a tryptophan-based chromophore［J］. PLoS One, 2015, 10（12）：e145740.

［104］Subach OM, Cranfill PJ, Davidson MW, et al. An enhanced monomeric blue fluorescent protein with the high chemical stability of the chromophore［J］. PLoS One, 2011, 6（12）：e28674.

［105］Tsien RY. Rosy dawn for fluorescent proteins［J］. Nat Biotechnol, 1999, 17（10）：956-957.

［106］Bindels DS, Haarbosch L, van Weeren L, et al. mScarlet：a bright monomeric red fluorescent protein for cellular imaging［J］. 2017, 14（1）：53-56.

（責任編輯 狄艷紅）

Research Progress on Red Fluorescent Protein

WANG Fei YANG Hai-tao WANG Ze-fang
（School of Life Science，Tianjin University，Tianjin 300000）

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0401

2017-05-25

國家重點基礎發展計劃（“973計劃”）

王飛，女，碩士，研究方向：分子生物學和結構生物學；E-mail：wang2010fei46@163.com

王澤方，男，博士，副研究員，研究方向：細胞生物學和蛋白質工程；E-mail：zefangwang@tju.edu.cn