控制水稻葉形基因CLF1的圖位克隆

邢豹 陳振華 張治國

（中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

研究報告

控制水稻葉形基因CLF1的圖位克隆

邢豹 陳振華 張治國

（中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081）

分蘗、株高、植株形態是水稻理想株型的3個主要農藝性狀。目前對水稻理想株型的分子調控機制認識還非常有限。而葉片形態建成是決定植株形態特征的主要因子，鑒定控制水稻葉片形態建成的關鍵基因至關重要。本研究通過篩選水稻突變體庫，獲得一份光合效率顯著提高的突變體（curly leaf 1，clf1），其形態學特征表現為葉片適度卷曲，經石蠟細胞學切片發現，突變體clf1近軸面的泡狀細胞明顯增多是導致葉片卷曲和光合效率提高的主要原因。利用圖位克隆，將CLF1基因縮小在2個分子標記InDel51與InDel57之間，該區間包含44個基因。通過生物信息學分析，確定了LOC_OS02G45250為CLF1的候選基因。對LOC_ OS02G45250基因進行測序，在clf1突變體中，LOC_OS02G45250基因的第六外顯子缺失20 bp，造成編碼產物提前終止。該基因與已報道的水稻卷葉基因Roc5（Rice outermost cell-specific gene5）為等位基因，Roc5編碼產物為一個具有GL2類同源異型結構域的轉錄因子，不同于已報道的突變體oul1（對應于Roc5基因），突變體clf1農藝性狀表現優良，具有較大的生產應用潛力。

水稻；突變體clf1；圖位克隆

水稻是禾本科的模式作物，也是我國主要糧食作物。隨著耕地面積的減少、人口的增加、農村勞動力的縮減、農村城鎮化的加劇，對水稻總產量的需求越來越大，而水稻理想株型改良對提高產量具有至關重要的作用。水稻理想株型主要由分蘗、株高、植株形態等農藝性狀決定。植株形態特別注重葉片的直立性和葉片的適度卷曲。水稻葉片適度卷曲能保持葉片直立不披垂，改善群體中后期基部的受光條件，提高光能利用率，從而有利于水稻產量的提高，同時由于冠層基部光量的增加還能增強根系活力，進而提高群體的抗倒性，其重要作用已在超高產育種中得到充分體現［1，2］。

水稻作為單子葉模式植物，主要通過葉長、葉寬、披垂度和卷曲度等形態因子來界定葉片形態及空間伸展姿態。水稻葉片的細胞結構主要包括上下表皮細胞、葉肉細胞、薄壁細胞、泡狀細胞、木質部、韌皮部和維管束等，每一個組織都發揮著不可或缺的作用，其中葉片表皮中的泡狀細胞發育形態往往與葉片形態密切相關。泡狀細胞是水稻的動力細胞［3］。在單子葉植物中，泡狀細胞是一類壁薄，高度液泡化的大細胞，禾本科植物葉片中的泡狀細胞在兩維管束之間成束出現［4］。Linsbsuer［5］研究認為泡狀細胞主要起著水分儲存的作用。然而更多的研究認為［1.2］，泡狀細胞可能還具有另外一個重要的作用，即通過其內含的水分得失控制葉片的伸展和卷曲運動，從而達到影響葉片形態和光能作用的目的。

水稻葉片可以通過控制泡狀細胞數量的多少、體積的大小以及泡狀細胞中所含水分的多少來控制葉片的卷曲。一般情況下，泡狀細胞失水能夠使葉片形成向近軸面方向的一個作用力，從而使葉片發生正卷。泡狀細胞吸水可以形成向遠軸面方向的作用力，又可以使卷葉慢慢平展。目前對控制泡狀細胞的基因功能研究也有了一些進展。Hong等［6］報道BRD1基因在控制水稻泡狀細胞個體數量方面起著重要作用。突變體brd1葉片的泡狀細胞數量比野生型多，但該突變體葉片并沒有發生反卷，因為該基因除了影響泡狀細胞的數量外，還影響葉片的其它細胞結構，該突變體植株表現為矮化、葉片嚴重扭曲。Dai等［7］報道水稻YAB1基因不僅參與了GA生物合成的反饋調控，而且在YAB1基因干涉株系中，檢測到泡狀細胞數量增加且葉片卷曲，對側生器官的腹-背軸極性的建立卻并沒有產生影響，這不同于在擬南芥中報道的所有的YABBY成員在側生器官發育中決定腹-背軸的極性建立［8，9］，進一步揭示YABBY家族基因在雙子葉植物和單子葉植物在進化上的功能差異。Hibara等［10］報道ADL1基因，ADLl 基因編碼一個類鈣調素半胱氨酸蛋白酶，該突變體ADL1葉片背腹的表皮細胞形態改變，形態類似泡狀細胞，導致葉片支持力減小，造成了葉片的背腹卷曲，該基因在控制泡狀細胞的分化和發育、葉原基腹-背軸極性的正確建立方面起著關鍵作用。Li等［11］報道，從T-DNA突變體庫中克隆了ACL1基因，ACL1基因編碼116個氨基酸，在BY240（ACL1過表達突變體）中，葉片的泡狀細胞個數增加、體積變大，葉片的表皮細胞也增大，它的高度同源基因ACL2的過量表達也可使泡狀細胞變大，數目增多，導致葉片外卷。Zhao等［12］報道控制葉夾角的基因LC2，其編碼VIN3樣蛋白，LC2發生突變能夠改變葉表皮細胞的分裂的數量，葉片中泡狀細胞的數量增加，同時LC2在葉發育過程中受到脫落酸、赤霉素、生長素以及油菜素類脂的誘導表達。Xiang等［13］報道半顯性卷葉基因SRL1，SRL1編碼糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白，定位于質膜上。SRL1 通過負向調節編碼液泡H+-ATPase亞基和H+-焦磷酸酶基因的表達，抑制泡狀細胞形成，進而調控葉片卷曲。上述基因主要是涉及泡狀細胞的數量、體積、泡狀細胞的分化及排列模式等。本研究主要目的是獲取光合效率提高、農藝性狀優異的突變體，并研究其細胞學成因及克隆該基因，旨為該基因的功能研究提供遺傳原材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 水稻材料 水稻卷葉突變體clf1來源于本實驗室構建的T-DNA插入突變體庫，遺傳背景為粳稻品種日本晴。經多代自交和選擇，是遺傳穩定的材料。1.1.2 農藝性狀統計及光合參數測定 使用美國LICOR LI-6400XT便攜式光合儀對完全抽穗期的野生型和突變體的光合效率、蒸騰速率、CO2氣孔導度進行測定。

1.2 方法

1.2.1 葉片的組織學石蠟切片分析 在分蘗盛期分別取突變體clf1與日本晴的新鮮葉片，分別用FAA固定液（70%酒精 90 mL，40%甲醛 5 mL，冰醋酸5 mL）固定，乙醇脫水，石蠟包埋。取8 μm 的橫切片，用蘇木精染色，在蔡司熒光顯微鏡A1下觀察、拍照，觀察其顯微結構。

2 結果

2.1 突變體clf1的形態學特征

突變體clf1在葉片生長至第10葉后，葉片表現向遠軸面卷曲，隨著植株的生長發育，突變體葉片的卷曲趨勢越來越顯著，至植株完全成熟時，葉片呈半卷曲成筒狀（圖1-B）。把葉片的橫切面置于體視鏡下觀察，可以清晰的看到野生型葉片平展，而突變體葉片兩側明顯外卷（圖1-B）。與此相對應的是，突變體clf1的卷曲度（LRIs）在生長后期在0.57-0.73之間變動；而野生型在生長發育的整個過程中，葉片都是表現為平展狀態，LRIs一直都在0左右（圖

1.2.2 突變體clf1的遺傳規律分析 將突變體clf1與日本晴正反交，統計其F1、F2代遺傳分離比。同時將突變體clf1與秈稻品種Dular雜交，收獲其F1、F2代，構建遺傳定位群體，用于基因的初定位和精細定位。

1.2.3 基因的初定位與精細定位 根據F2代植株表型，選取隱型表型單株10株，分別剪取等量葉片，采用改進過的CTAB法［13］提取隱性表型植株DNA。精細定位時用同樣方法提取用于連鎖分析的F2代單株DNA。本實驗室所用Indel引物由北京擎科新業生物技術有限公司合成。利用網上所公布的粳稻亞種日本晴和秈稻品種9311的全基因組序列進行比對，利用在秈稻粳稻之間片段大小差異設計引物，引物設計軟件為DNAMAN version4.0，用設計好的引物在日本晴、Dular親本之間檢測多態性，然后利用多態性引物對前述F2代隱性單株表型進行初定位，再用與連鎖的初定位標記對隱性F2代全部單株進行連鎖分析，確定引物與F2代隱性表型群體的連鎖關系。反應在PCR擴增儀（Bio-Rad S1000 Thermal Cycler）中進行。反應產物在4%瓊脂糖凝膠上電泳，電泳電壓180 V，時間20 min。電泳完成后在膠片觀察燈下觀察結果并照相。將電泳圖譜進行數值轉換：與隱性親本帶型一致的記為1型帶，與顯性親本帶型一致的記為2型帶，同時具有雙親本帶型的的記為3型帶。對獲得的數據進行分析，并進行遺傳作圖。1.2.4 候選基因的克隆及分析 通過生物信息學分析，篩選定位區間內與葉片發育相關的基因，設計引物并進行測序，根據測序結果分析突變原因。1-C）。clf1葉片的直立度（LEIs）也比野生型的高，并且這種趨勢從第10葉一直保持到花期（圖1-D）。突變體clf1與野生型相比，在株高、粒長、粒寬、千粒重等均無顯著差異。適度卷曲能增加葉片的直立度，突變體clf1葉片的直立顯著地提高植株的光合效率（表1）。

圖1 成熟期野生型與clf1的植株形態比較圖

表1 蒸騰速率、CO2氣孔導度、光合作用效率測量

2.2 突變體clf1的遺傳規律分析

對clf1、與日本晴雜交的F1、F2代葉片卷曲性狀進行調查統計。F1代葉片與野生型相似，較平展，表明卷葉相對于平展葉片為隱性性狀。F2代，葉片出現明顯的分離，平展葉與卷曲葉的分離比為3：1，符合卡平方比（表2）。由此可見，控制突變體clf1的卷曲表型受一對單隱性核基因控制。

2.3 突變體clf1的細胞形態學特征

水稻葉片主要包括上下表皮、薄壁細胞、厚壁細胞、葉肉細胞、維管束等。兩個維管束之間有泡狀細胞，葉片水分減少，泡狀細胞就失去膨壓而收縮，稻葉失水而卷曲。水稻葉片各組織的改變都可能引起葉片的卷曲。為了從細胞學結構上更深入地揭示該卷葉性狀形成的原因，我們對日本晴和突變體clf1的葉片進行石蠟切片分析，以揭示其顯微結構（圖2-A），結果發現突變體clf1上表皮的泡狀細胞數量和體積明顯變大、變多。

表2 F2代分離群體的統計分析

為了對泡狀細胞大小和面積進行定量，利用image J軟件定量分析日本晴和突變體clf1泡狀細胞的面積和數量（圖2-B、C）。統計數據結果顯示，突變體clf1的泡狀細胞面積要比野生型大13.6%，突變體泡狀細胞的數量平均比野生型多2-3個，由于泡狀細胞是儲存水分的重要器官，突變體clf1中泡狀細胞數量變大和體積變大，因此葉片水分含水量增加，導致葉片的膨壓增強而反卷。以上數據表明突變體clf1葉片卷曲是由于泡狀細胞的體積和數量變化引起的。

圖2 野生型與clf1的石蠟切片顯微結構比較圖

2.4 CLF1基因的初步定位和精細定位

用均勻分布的589對Indel引物對親本Dular和日本晴進行多態性分析，有150對引物在Dular和日本晴之間有多態性。用150對引物對clf1/Dular F2代群體隱性表型植株進行分析，發現10株突變體表型單株的DNA與rj2-24和rj2-27完全連鎖，取20株突變體表型單株以及10株野生型表型單株驗證，證明rj2-24和rj2-27與clf1位點連鎖，在rj2-24和rj2-27之間合成InDel引物，其中有20對在親本間具有多態性，其中多態性較好的標記是InDel2、InDel3、InDel51、InDel57（表3）等，利用66個突變體表型單株將CLF1定位在InDel3與rj2-27之間，進一步利用350株突變表型（隱性單株）群體和新開發的分子標記最終把CLF1基因定位在InDel51與InDel57之間，物理距離約250 kb（圖3-A）。

圖3 CLF1基因在第2號染色體上的定位

2.5 CLF1基因克隆及基因突變分析

CLF1基因定位在InDel51與InDel57分子標記之間，物理距離250 kb（圖3-A）。在250 kb中，約44個基因，通過生物信息學分析，確定了LOC_OS02G45250為CLF1的候選基因。對LOC_OS02G45250基因進行測序，在clf1突變體中，LOC_OS02G45250基因的第6外顯子缺失20 bp（圖3-B），造成編碼產物至552處提前終止（圖4-A）。該基因與已報道的水稻卷葉基因Roc5（Rice outermost cell-specific gene5）為等位基因，Roc5基因是由于T-DNA插入至第六內含子造成功能缺失導致，其編碼一個具有GL2類同源異型結構域的轉錄因子，clf1與oul1有相同結構域START的突變（圖4-B）。

表明了START結構域對LOC_OS02G45250基因的功能發揮具體重要作用。START結構域被確認是一種功能寬泛的脂類結合結構域，可以參與防止蛋白酶水解，有的參與脂質轉運，信號轉導及轉錄調控等過程，也能參與植物脅迫與病原菌反應，START結構域是如何調控泡狀細胞的發育還需進一步研究。

表3 本研究開發的多態性InDel標記

圖4 CLF1氨基酸和蛋白功能結構域差異比較

3 討論

葉片的適度卷曲是重要的水稻遺傳資源，在水稻高產株型改良中具有重要的利用價值。但是到目前為止，葉片的適度卷曲的克隆基因較少。主要原因有：葉片的適度卷曲在雜交群體F2或后代的表型易受環境因素影響，經常會干擾了定位的結果，如Roc5基因最早定位開始于1995年，但是直到2011年才通過T-DNA的方法克隆，表明了適度卷葉基因的定位的復雜性。到目前為止，適度卷曲的基因均通過T-DNA方法克隆，如OsAGO7和Roc5等，表明T-DNA方法或其它方法比圖位克隆法更適合適度卷曲類型突變體的基因克隆。本實驗中，由于適度卷葉基因的定位的復雜性，采用單株定位的方法而非傳統的混池定位法，這樣避免了混池法定位的不準確性。

經過復雜的圖位克隆過程，克隆了控制葉片卷曲的基因CLF1，該蛋白與Roc5同，但相應突變體是等位突變體。oul1是鑒定Roc5基因的完全失活突變體，證明前期Roc5基因的正確性。本文中CLF1鑒定是用圖位克隆獲得，盡管其來源于T-DNA插入突變體庫，但實際位點的突變是由于堿基缺失。因此，大多數情況下，插入缺失造成的indel可能比T-DNA插入造成的突變更多些。同時，我們比較了突變體clf1與oul1（Roc5基因突變）的表型異同點。在2個突變體中，葉片均向遠軸面卷曲，葉片上表皮的泡狀細胞數量和大小均比野生型多。但是，突變體oul1育性降低，而突變體clf1育性好，突變體clf1的實際穗粒數優于突變體oul1，在生產上，突變體clf1具有較大的生產應用潛力。由于CLF1基因具有較大的生產潛力，是否可以在已測序3 000份水稻種質中獲取優異的等位變異是下一步的重點。

在clf1突變體中，LOC_OS02G45250基因的第六外顯子缺失20 bp，造成編碼產物提前終止，突變位于基因的START結構域，前期Roc5基因由T-DNA插入START結構域而導致失活，表明了START結構域對LOC_OS02G45250基因的功能發揮具體重要作用。START結構域被確認是一種功能寬泛的脂類結合結構域，可以參與防止蛋白酶水解，有的參與脂質轉運，信號轉導及轉錄調控等過程，也能參與植物脅迫與病原菌反應，START結構域是如何調控泡狀細胞的發揮還需進一步研究。

4 結論

本研究通過篩選水稻T-DNA突變體庫，獲得高光效突變體clf1，并經過圖位克隆，克隆了該基因，且位于ROC5基因。為進一步研究該基因的功能，提供重要的遺傳資料。

［1］Zhang GH, Xu Q, Zhu XD, et al. SHALLOT-LIKE1 is a KANADI transcription factor that modulates rice leaf rolling by regulating leaf abaxial cell development. ［J］. Plant Cell, 2009, 21（3）：719.

［2］ Zou LP, Sun XH, Zhang ZG, et al. Leaf Rolling Controlled by the Homeodomain Leucine Zipper Class IV Gene Roc5 in Rice［J］. Plant Physiology, 2011, 156（3）：1589.

［3］ J. B. F. Physiological Plant Anatomy［J］. Philosophical Transactions of the Royal Society of London, 1914, 364（1536）：3711-3735.

［4］Jane W N, Chiang SHT. Morphology and development of bulliform cells in Arundo formosana Hack［J］. 國立臺灣大學理學院植物學系研究報告, 1991, 36（1）：85-97.

［5］Linsbauer L. FIFTY YEARS OF PLANT PHYSIOLOGY IN AUSTRIA［J］. Plant Physiology, 1937, 12（3）：565.

［6］Hong Z, Ueguchi-Tanaka M, Shimizu-Sato S, et al. Loss-of-function of a rice brassinosteroid biosynthetic enzyme, C-6 oxidase, prevents the organized arrangement and polar elongation of cells in the leaves and stem［J］. Plant Journal, 2002, 32（4）：495-508.

［7］Dai M, Zhao Y, Ma Q, et al. The rice YABBY1 gene is involved in the feedback regulation of gibberellin metabolism. ［J］. Plant Physiology, 2007, 144（1）：121.

［8］Bowman JL. The YABBY gene family and abaxial cell fate. ［J］. Current Opinion in Plant Biology, 2000, 3（1）：17-22.

［9］Dai M, Zhao Y, Ma Q, et al. The rice YABBY1 gene is involved in the feedback regulation of gibberellin metabolism. ［J］. Plant Physiology, 2007, 144（1）：121.

［10］Hibara K I, Obara M, Hayashida E, et al. The ADAXIALIZED LEAF1, gene functions in leaf and embryonic pattern formation in rice［J］. Developmental Biology, 2009, 334（2）：345-354.

［11］Li L, Shi ZY, Li L, et al. Overexpression of ACL 1（abaxially curled leaf 1）increased bulliform cells and induced abaxial curling of leaf blades in rice［J］. Molecular Plant, 2010, 3（5）：807-817.

［12］Zhao SQ, Hu J, Guo LB, et al. Rice leaf inclination2, a VIN3-1ike protein, regulates leaf angle through modulating cell division of the collar［J］. Cell Res, 2010, 20（8）：935-947.

［13］Xiang JJ, Zhang GH, Qian Q, et al. SEMI-ROLLED LEAF1 encodes a putative glycosylphosphatidylinositol-anchored protein and modulates rice leaf rolling by regulating the formation of bulliform cells［J］. Plant Physiology, 2012, 159（4）：1488-1500.

（責任編輯 李楠）

Map-based Cloning of a Curly Leaf Gene CLF1 in Rice

XING Bao CHEN Zhen-hua ZHANG Zhi-guo
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Leaf is one of the most important photosynthetic organs and plays an important part in the productivity. We screened the rice leaf morphological variation mutants and isolated a curly leaf mutant（clf1）showing abaxial leaf rolling. The more bulliform cells numbers on leaf adaxial sides in clf1 mutnat were the main reason leading to leaves curling. Using Map-Based cloning methods，the site controlling CLF1 gene was mapped in chromosome2，tightly linking with two polymorphic markers（InDel51 and InDel57）. There were 44 genes in this region and we predicted LOC_OS02G45250 as the target gene by bioinformatics. We found that there were 20bp deletion in the sixth exon of LOC_OS02G45250 and the nucleotide deletion created a premature stop codon in the predicted coding region. The clf1 was another allele of the reported rice curly leaf gene Roc5（Rice outermost cell-specific gene5），whose encoded transcription factor including GL2 homologous structure domain. Different from the oul1 mutant（loss-of-function in Roc5），the clf1 was valuable for the production because of a better agricultural characters.

rice；clf1；map-based cloning

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0694

2017-05-20

國家自然科學基金項目（31471166），中國-巴西作物生物技術與種質資源聯合研究項目（2014DFA31550）

邢豹，碩士研究生，研究方向：植物基因功能；E-mail：xingbao2016@126.com；陳振華同為本文第一作者

張治國，副研究員，碩士生導師，研究方向：植物功能基因研究；E-mail：zhangzhiguo@caas.cn