水稻核不育突變體gsl5花粉壁單糖組分研究

劉啟明 陳振華 韓霄

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

水稻核不育突變體gsl5花粉壁單糖組分研究

劉啟明 陳振華 韓霄

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

水稻花粉壁在花粉發(fā)育、適應(yīng)環(huán)境和授粉識別過程中具有重要作用。花粉壁的發(fā)育異常會導(dǎo)致水稻雄性不育。在水稻花粉壁發(fā)育過程中，胼胝質(zhì)層形成、初生外壁沉積和孢粉素的生物合成是關(guān)鍵步驟。目前對花粉初生外壁胼胝質(zhì)層的研究較多，但對于水稻花粉壁的單糖組分缺乏整體性研究。我們利用花粉胼胝質(zhì)層缺失的水稻突變體gsl5與野生型進(jìn)行比較，對花粉壁單糖組分進(jìn)行了色譜分析，初步研究了胼胝質(zhì)層缺失對水稻花粉外壁組分的影響。

水稻；核不育；gsl5；單糖組分

水稻的雄性不育材料既是提高育種效率的寶貴種質(zhì)資源，也是研究植物生殖生物學(xué)的重要實(shí)驗(yàn)材料。深入研究水稻生殖發(fā)育過程及其機(jī)理對于改進(jìn)育種方法，促進(jìn)生產(chǎn)實(shí)踐有著重要的指導(dǎo)意義［1，2］。在被子植物雄性生殖發(fā)育過程中，花粉壁的形成是其中一個關(guān)鍵步驟，目前研究發(fā)現(xiàn)多數(shù)雄性不育性狀都與花粉壁發(fā)育異常相關(guān)［3］。對花粉壁的研究不僅在理論上具有重大意義，在育種生產(chǎn)上也極為重要。花粉形成的外壁結(jié)構(gòu)堅硬并具有粘性，它既可以在環(huán)境變化中保護(hù)花粉，又能夠幫助花粉與媒體的附著和柱頭的識別。花粉壁的發(fā)育是一個極其復(fù)雜的過程，小孢子質(zhì)膜外積累胼胝質(zhì)并形成初生外壁后，以初生外壁形成的模板不斷積累孢粉素等組分最終發(fā)育成為成熟的花粉外壁［4-8］。整個過程當(dāng)中，胼胝質(zhì)層是初生外壁的沉積模板，初生外壁又進(jìn)而決定花粉外壁的沉積模式。初生外壁的沉積物的主要組分為多聚糖、纖維素，同時含有一些蛋白質(zhì)。而花粉外壁的主要成分是長鏈脂肪酸、氧化芬芳環(huán)以及苯基丙酸類物質(zhì)聚合而成的孢粉素，具有抗腐蝕的特性。近年來，通過觀察雄性不育突變體的花粉外壁的結(jié)構(gòu)形態(tài)，結(jié)果闡明了胼胝質(zhì)層與花粉外壁沉積模式的關(guān)系［9，10］。但是對沉積物組分的影響尚未有深入的研究。

最近，水稻雄性不育突變體gsl5被研究證明花粉發(fā)育過程中細(xì)胞板和初生壁中胼胝質(zhì)成分明顯缺失［11］。胼胝質(zhì)缺失導(dǎo)致了花粉外壁的結(jié)構(gòu)形態(tài)產(chǎn)生了極大的變化，孢粉素積累異常，最終造成雄性不育。為了進(jìn)一步研究胼胝質(zhì)層缺失對花粉壁多糖組分的改變，本研究對gsl5突變體花粉進(jìn)行了氣譜分析，試圖闡述花粉壁發(fā)育過程中單糖組分的含量變化，對深入研究花粉壁的形成及其功能具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

親本參照是選用本實(shí)驗(yàn)中使用的品種Oryza Japonica，突變體是在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的雄性不育突變體gsl5。以上材料均在河北省廊坊市（海拔1500米）中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院基地種植，年均氣溫3℃，年均降水量390 mm，年均日照時數(shù)2 896 h。突變體gsl5從2010年至2014年與Oryza Japonica回交4次，后期兩次采用大棚種植，日照時間為12 h和8 h兩種。在本試驗(yàn)中檢測花粉細(xì)胞壁單糖組分所使用的樣品為2013年在大棚中12 h日照種植的。

1.2 方法

1.2.1 提取花粉細(xì)胞壁 9000水稻花穗中的花粉被人工收集后加入3倍體積的95%的乙醇，共收集3個生物學(xué)重復(fù)。5 000×g離心后棄上清，加入70%的酒精重懸，離心。清洗3次后對沉淀物進(jìn)行研磨并用70%的酒精在70℃孵育15 min，然后將沉淀加入氯仿：甲醇（1：1）混合液，離心棄上清，并依此清洗3次。最終沉淀物為花粉細(xì)胞壁組分，干燥后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 提取花粉細(xì)胞壁富含膠質(zhì)的組分 富含膠質(zhì)的組分用草酸銨提取法［12］獲得。樣品經(jīng)0.5%草酸銨煮沸1 h后離心，取上清透析。

1.2.3 提取花粉細(xì)胞壁富含半纖維素的組分 富含半纖維素的組分用KOH提取法［12］獲得。先將草酸銨不溶物用4 mol/L KOH、20 mmol/l NaBH4室溫溶解12 h。KOH不溶物用pH5.5的乙酸溶解透析后冷凍干燥。

1.2.4 色譜分析 色譜分析單糖組分的方法參照York 等［12］的方法進(jìn)行，用肌醇作為內(nèi)參。各種組分經(jīng)1 mol/L methanolic-HCl 80℃ 處理16 h，自由單糖轉(zhuǎn)化為甲基糖苷。110℃硅烷化20 min后，干燥樣品，用環(huán)己烷溶解。然后上機(jī)GC3800 Varian 檢測。

2 結(jié)果

2.1 花粉壁單糖組分

水稻突變體gsl5胼胝質(zhì)層缺失后總花粉壁單糖組分變化見表1，其中阿拉伯糖（Ara）、葡萄糖（Glc）和半乳糖醛酸（GalUA）分別提高了22.70%、38.76%和12.5%；另外巖藻糖（Fuc）、半乳糖（Gal）、葡萄糖醛酸（GlcUA）、鼠李糖（Rha）、甘露糖（Man）和木糖（Xyl）則分別降低了7.89%、8.77%、18.4%、25%、15.79%和6.12%。概括來說，總花粉壁組分單糖變化不大，多數(shù)單糖組分變化未超過20%。變化較大的是阿拉伯糖、半乳糖醛酸和鼠李糖，超過了20%的增減。與后面富含膠質(zhì)或者富含半纖維素的花粉壁比較，總花粉壁單糖組分變化并不明顯。

表1 總花粉壁單糖組分分析結(jié)果

2.2 花粉壁富含膠質(zhì)的單糖組分

水稻突變體gsl5胼胝質(zhì)層缺失后花粉壁富含膠質(zhì)的單糖組分變化見表2，其中中性糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和鼠李糖分別增加了3.53%、46.15%、43.75%、5.22%、111.11%；另外糖醛酸、阿拉伯糖、巖藻糖、半乳糖、甘露糖和木糖分別降低了11.49%、15.07%、17.19%、12.37%、57.69%和7.89%。概括來說，富含膠質(zhì)的組分單糖變化較大，4種單糖的增減都超過20%，其中鼠李糖的變化超過2倍，增加顯著。與總花粉壁或者富含半纖維素的花粉壁比較，變化的單糖種類并不多，但是鼠李糖的增加是最高的。

表2 花粉壁富含膠質(zhì)的單糖組分分析結(jié)果

2.3 花粉壁富含半纖維素的單糖組分

水稻突變體gsl5胼胝質(zhì)層缺失后花粉壁富含半纖維素的單糖組分變化見表3，其中中性糖、阿拉伯糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸和木糖分別增加了1.73%、20.51%、44.68%、17.98%和49.9%；另外糖醛酸、巖藻糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、鼠李糖、甘露糖分別降低了21.62%、21.21%、15.66%、41.05%、20.83%和44.44%。對于富含半纖維素的花粉壁單糖組分來講，變化比前兩者在量上并不是最高的，但是變化的單糖種類最多，超過8種單糖有20%以上的增減量。

表3 花粉壁富含半纖維素的單糖組分分析結(jié)果

3 討論

與許多被子植物雄性不育性狀一樣，水稻突變體gsl5的性狀是由于花粉壁的形成受到嚴(yán)重阻礙造成的［12］。通過對花粉發(fā)育過程的細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)其初生外壁胼胝質(zhì)層缺失，根據(jù)被子植物花粉發(fā)育模型，胼胝質(zhì)層是不斷積累孢粉素等組分的模板，并以此模板決定花粉外壁的沉積。研究工作已經(jīng)揭示了胼胝質(zhì)層在花粉壁形成過程中的關(guān)鍵性作用，但是它究竟影響了堆積物的哪些方面還鮮有研究。初生外壁沉積物大多由多聚糖、纖維素構(gòu)成，其單糖組分是沉積物的一個重要特征。我們的工作發(fā)現(xiàn)花粉壁在胼胝質(zhì)層缺失后的單糖組分變化很復(fù)雜，增加或者降低含量都很普遍，沒有一個統(tǒng)一的模式。至于這些單糖組分的變化如何影響花粉的結(jié)構(gòu)性、硬度和粘性等特征，有待更進(jìn)一步的研究。但是我們發(fā)現(xiàn)富含膠質(zhì)和富含半纖維素的花粉壁成分改變了很多單糖的組分，超過8種單糖在半纖維素花粉壁中產(chǎn)生了較大的變化，而膠質(zhì)花粉壁的鼠李糖增加了1倍以上。也就是說前兩者在單糖構(gòu)成上與親本就有很大的差異。半纖維素和膠質(zhì)對于細(xì)胞壁纖維的彈性具有重要影響，同時研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)水稻突變體gsl5花粉的形態(tài)畸形，不能形成類球的親本花粉形態(tài)。于是我們推測這兩者單糖組分的巨大差異減少了花粉壁的韌性，從而導(dǎo)致花粉壁不能維持正常的形態(tài)。

4 結(jié)論

初生壁胼胝質(zhì)層的缺失導(dǎo)致水稻雄性不育突變體gsl5的花粉壁單糖組分發(fā)生了很大的變化，對于花粉的發(fā)育和生理功能造成影響。

［1］李仕貴, 周開達(dá), 朱立煌. 水稻溫敏顯性核不育基因的遺傳分析和分子標(biāo)記定位［J］. 科學(xué)通報, 1999, 44（9）：955.

［2］袁隆平. 水稻光, 溫敏不育系的提純和原種生產(chǎn)［J］. 雜交水稻, 1994（6）：1-3.

［3］Ariizumi T, Toriyama K. Genetic regulation of sporopollenin synthesis and pollen exine development［J］. Annual Review of Plant Biology, 2012, 62（1）：437.

［4］ Lu P, Chai M, Yang J, et al. The Arabidopsis CALLOSE DEFECTIVE MICROSPORE1 gene is required for male fertility through regulating callose metabolism during microsporogenesis. ［J］. Plant Physiology, 2014, 164（4）：1893.

［5］Worrall D, Hird DL, Hodge R, et al. Premature dissolution of the microsporocyte callose wall causes male sterility in transgenic tobacco［J］. Plant Cell, 1992, 4（7）：759-71.

［6］ Dong X, Hong Z, Sivaramakrishnan M, et al. Callose synthase（CalS5）is required for exine formation during microgametogenesis and for pollen viability in Arabidopsis［J］. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2005, 42（3）：315-328.

［7］Enns LC, Kanaoka MM, Torii KU, et al. Two callose synthases, GSL1 and GSL5, play an essential and redundant role in plant and pollen development and in fertility［J］. Plant Molecular Biology, 2005, 58（3）：333-349.

［8］Nishikawa S, Zinkl GM, Swanson RJ, et al. Callose（β-1, 3 glucan）is essential for Arabidopsis pollen wall patterning, but not tube growth［J］. Bmc Plant Biology, 2005, 5（1）：1-9.

［9］ Shi X, Han X, Lu T. Callose synthesis during reproductive development in monocotyledonous and dicotyledonous plants［J］. Plant Signaling & Behavior, 2015, 11（2）.

［10］ Shi X, Sun X, Zhang Z, et al. GLUCAN SYNTHASE-LIKE 5（GSL5）plays an essential role in male fertility by regulating callose metabolism during microsporogenesis in rice［J］. Plant & Cell Physiology, 2015, 56（3）：497.

［11］ Yang C, Zhou H, Shi X, et al. Identification and Analysis of Zbs1, a Dominant Male-Sterile Mutant of Naked Oat（Avena nuda L.）［J］. 2016, 56（4）.

［12］ York WS, Darvill AG, Mcneil M, et al. Isolation and characterization of plant cell walls and cell wall components［J］. Methods in Enzymology, 1986, 118（1）：3-40.

（責(zé)任編輯 李楠）

Monosaccharide Components of the Male Sterile Mutant gsl5 in Rice

LIU Qi-ming CHEN Zhen-hua HAN Xiao
（Biotechnology Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081）

Pollen wall plays vital role during microspore development and pollination in rice（Oryza Japonica）. Abnormal pollen wall formation usually leads to male sterility. Callose wall，microspore primary wall development and sporonpollenin accumulation are key step to control pollen wall formation. Recent studies focus on callose wall formation during microspore development. Neither less，the knowledge about monosaccharide composition in the pollen wall is limited. In this study，we compared the monosaccharide composition in the pollen wall of the wide type rice with a male sterility mutant gsl5.

rice；male sterility mutant；gsl5；monosaccharide composition

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0696

2017-05-20

中國-巴西作物生物技術(shù)與種質(zhì)資源聯(lián)合研究項(xiàng)目（2014DFA31550），中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（CAAS-XTCX2016002）

劉啟明，陳振華，碩士研究生，研究方向：植物基因功能；E-mail：liuqiming516516@163.com，陳振華同為本文第一作者

韓霄，研究員，博士生導(dǎo)師，研究方向：植物功能基因研究；E-mail：hanxiao@caas.cn